一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑制肽的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610402642.3 (22)申请日 2016.06.08 (71)申请人 中国热带农业科学院椰子研究所 地址 571339 海南省文昌市文清大道496号 (72)发明人 郑亚军李艳张玉峰陈华 赵松林 (74)专利代理机构 海口翔翔专利事务有限公司 46001 代理人 莫臻 (51)Int.Cl. C12P 21/06(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (54)发明名称 。

2、一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑制肽的 方法 (57)摘要 本发明涉及一种以椰麸球蛋白为原料制备 ACE抑制肽的方法， 选取成熟老椰子进行处理得 到脱脂椰麸粉， 提取椰麸球蛋白后进行复合酶水 解、 离心分离制备多肽初提物， 从多肽初提物中 分离出5个多肽组分， 收集第5个多肽组分进一步 分离和纯化出12个多肽组分， 将第9个组分进一 步用碳18分析柱-反相高效液相色谱分离得到2 个纯肽， 二者对ACE的抑制率均在70以上。 本发 明以椰麸球蛋白为底物， 采用复合酶解、 凝胶色 谱分离、 反向高效液相色谱纯化等技术制备出纯 度达95以上的ACE抑制肽， 既可以用于天然抗 高血压药物的成分， 也。

3、可以添加到食品中， 进行 食源性预防和治疗高血压， 利于实现对椰子的综 合利用和精深加工， 有力促进我国椰子产业的发 展。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 105803024 A 2016.07.27 CN 105803024 A 1.一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑制肽的方法， 其特征在于， 其具体步骤如下： 1)、 原料前处理选择成熟老椰子果实， 然后去壳， 削去种皮， 清洗、 刨丝、 榨汁， 得到椰 麸； 将椰麸在4050干燥后粉碎， 过4060目筛， 然后按质量体积比为1 101 20的比例 加入石油醚或乙醚提取剩余的椰子油， 得到脱脂椰麸粉； 2)、 提取球蛋白在脱脂椰。

4、麸粉中按质量体积比为1 101 30的比例加入0.40.5mol/ L的氯化钠溶液， 室温下震荡提取23h， 过滤， 收集滤液； 按照如上方法反复提取3次， 合并 收集的滤液； 将滤液在410、 1000012000rpm的条件下离心1520min， 收集上清液； 将 上清液装入截留分子量为40008000透析膜中， 在46的蒸馏水中透析1224小时； 透 析结束后， 将透析液在410、 8000012000rpm的条件下离心1520min， 收集沉淀， 真空 冷冻干燥后即可获得纯度较高的椰麸球蛋白； 3)、 复合酶水解制备将椰麸球蛋白按质量体积比为1 15的比例溶解于0.10.3M磷酸 缓冲。

5、液中， 调节pH至8.0pH9.0， 然后按质量百分比为0.51的比例加入碱性蛋白酶， 45 55下震荡水解36h， 调节水解溶液pH至7.0pH7.5， 接着按质量百分比为0.51 的比例加入中性蛋白酶， 5055下震荡水解24h， 调节水解溶液pH至2.0， 再按质量百分 比为0.30.6的比例加入胃蛋白酶， 37下震荡水解24h， 调节水解溶液pH至7.0， 最后 按质量百分比为0.30.6的比例加入胰蛋白酶， 37下震荡水解24h； 将酶解液在95 100下加热510min， 灭酶； 4)、 高速离心分离将灭酶后的酶解液在46、 1000012000rpm的条件下离心25 30min，。

6、 收集上清液； 冷冻干燥后可得到多肽初提物； 5)、 凝胶色谱分离将多肽初提物进行SephadexG-15柱层析分离： 柱长0.61.2米， 直 径为1620mm， 固定相为SephadexG-15， 纯水洗脱， 流速0.60.8mL/min； 每5分钟收集一 次， 洗脱液在220nm处用分光光度计比色， 分离出5个多肽组分； 不断重复该步骤， 收集第5个 多肽组分， 冷冻干燥后可得到该多肽组分的粉末； 6)、 反向高效液相色谱纯化将上述凝胶色谱分离所得的第5个多肽组分在反向高效液 相色谱上进行进一步分离和纯化： 将第5个多肽组分按0.61mg/mL的比例溶解于蒸馏水 中， 过0.22微米的膜。

7、， 收集滤液； 将滤液进行反向高效液相色谱分离， 所用分离柱为碳18半 制备柱,二元梯度浓度洗脱， 流动相A为含0.1三氟乙酸的乙腈、 流动相B为超纯水， 流速 2.02.5mL/min， 柱温3040， 检测波长220nm， 分离出12个多肽组分； 将第9个组分进一 步用碳18分析柱-反相高效液相色谱分离,二元梯度浓度洗脱， 流动相A为含0.1三氟乙酸 的乙腈、 流动相B为超纯水， 流速0.81.0mL/min， 柱温3040， 检测波长220nm， 分离为2 个纯肽， 将2个纯肽分别收集， 冷冻干燥， 保存。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105803024 A 2 一种以椰麸球蛋白为。

8、原料制备ACE抑制肽的方法 技术领域 0001 本发明属农产品采后加工技术领域， 涉及一种ACE抑制肽的方法， 具体涉及一种以 椰麸为原料制备椰麸球蛋白， 进而制备ACE抑制肽的方法。 背景技术 0002 高血压是威胁人类健康的主要疾病之一。 据统计， 世界各国高血压平均发病率为 1020， 全球每年因高血压死亡人数达1200万， 中国每年死于高血压及相关疾病的人数 达200万， 高血压已经成为亟需解决的世界性健康问题之一。 0003 血管紧张素转化酶(AntiotensinIConvertingEnzyme， ACE)在调节血压上起关 键性作用。 研究表明， 人体内的肾素-血管紧张系统(re。

9、nnin-angiotensinsystem,RAS)和 激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kininsystem,KKS)是维持血压正常的两个相互拮抗 的平衡体系(Lietal.,2004)。 ACE能催化血管紧张素I(angiotensinI)转变为具有强效 升高血压作用的血管紧张素II(angiotensinII)， 同时将具有降压作用的舒缓激肽降解， 使之失去降压作用， 从而使RAS和KKS平衡体系失衡最终导致血压升高。 因此， 通过抑制体内 ACE的活性可以起到降血压的效果。 目前临床上使用的降血压药物的降压原理也主要是抑 制ACE的活性(Roye&Simpson,2010。

10、； 申晓文， 2010)。 0004 ACE抑制肽是指能够抑制ACE酶活性的多肽。 其对ACE的抑制机理是通过与ACE活性 中心的固定位点结合而使ACE失去酶活力， 也可以竞争性地与ACE的作用底物结合， 从而降 低ACE的活性， 进而起到降血压的作用。 目前使用的ACE抑制剂多为化学合成药物， 虽然疗效 显著， 但成本高昂， 且长期服用会产生各种副作用(如肾损伤、 干咳、 腹泻、 味觉功能紊乱 等)。 食源性ACE抑制肽因降血压效果好、 安全无副作用成为目前研究的热点。 随着人们自我 保健和安全意识的提高， 采用非药物疗法达到治病防病的观念将为更多的人所接受， 从饮 食上添加食源性ACE抑制。

11、肽来预防和治疗高血压的前景良好。 0005 椰子(CocosnuciferaL.)是热带地区最重要的木本油料作物和食品能源作物之 一， 椰子加工业已经发展成我国热区闻名全国的特色产业。 然而， 我国椰子加工业的产品主 要集中在椰子糖、 椰子粉、 椰纤果等普通椰子食品方面， 功能性产品所占比例很小； 企业缺 乏自主创新能力， 产品科技附加值少， 难以提高经济效益和资源利用率。 近年来， 东南亚椰 子主产国如越南、 印度尼西亚等国家以廉价的劳动力和原料、 较先进的加工技术等优势， 使 国内椰子加工企业面临越来越大的压力和挑战。 0006 椰子果肉含有约48的蛋白质， 其中清蛋白占21、 球蛋白占4。

12、0.1、 醇溶蛋白 占3.3， 酸溶性谷蛋白占14.4， 碱溶性谷蛋白占4.8。 1930年美国科学家和 Spychalski从椰肉中分离出一种分子量约208kDa的球蛋白， 并命名为cocosin， 开启了椰子 蛋白质的研究历史。 后续的研究表明， 在成熟椰子果肉中球蛋白占总蛋白含量的65， 而在 78个月嫩椰子果中， 球蛋白在总蛋白中的含量可高达80。 球蛋白根据沉降系数可分为 2S球蛋白、 7S球蛋白、 9S球蛋白、 11S球蛋白和15S球蛋白。 其中11S球蛋白占椰子总球蛋白的 86， 而7S球蛋白占14(Garciaetal， 2005)。 研究人员还发现cocosin是一个多聚体球。

13、 说明书 1/6 页 3 CN 105803024 A 3 蛋白(hexamer)， 它由酸性亚基和碱性亚基通过一条二硫键连接而成， 在碱性亚基上还结合 着糖基。 食品工业中， 椰子粉、 浓缩椰浆、 椰汁蛋白饮料等主要椰子产品所含蛋白质的主要 成分就是椰子球蛋白。 因而， 球蛋白是椰子蛋白中最主要的蛋白质， 也是最重要的蛋白质之 一。 0007 椰麸是椰肉榨汁后的主要副产物， 含有1624的蛋白质， 同时椰麸产量很大， 菲 律宾仅2014年的椰麸产量就达200万吨。 研究表明， 椰麸蛋白质中球蛋白的含量为54.35 3.69g/100g。 椰麸球蛋白富含天冬氨酸和精氨酸， 氨基酸占总氨基酸的比。

14、例为39.25， 远 高于FAO/WHO的推荐值 ， 氨基酸组成较为合理 ； 其体外消化吸收率( invitro digestibilityindex,IVPD)高达88.26， 生物效价(biologicalvalue,BV)为58.41,远 高于大豆分离蛋白， 因而营养价值较高。 同时， 椰麸球蛋白具有极强的络合铁离子能力， 是 制备食源性补铁剂或铁强化剂的优良原料， 同时对DPPH、OH、 ATBS+等体内自由基有 一定的清除能力， 生物活性较高。 目前， 椰麸仅仅被用作动物饲料或蛋糕等食品的辅料， 蛋 白质等活性成分没有被开发利用， 造成了资源的极大浪费。 发明内容 0008 本发明的。

15、目的是针对现有技术的不足而提供一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑 制肽的方法， 从椰麸中制备椰子球蛋白， 以椰麸球蛋白为底物， 采用复合酶解、 凝胶色谱分 离、 反向高效液相色谱纯化等技术制备出纯度达95以上的ACE抑制肽， 既有利于实现对椰 子的综合利用和精深加工， 又可以变废为宝， 有力促进我国椰子产业的发展。 0009 本发明所采用的技术方案： 0010 一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑制肽的方法， 其具体步骤如下： 0011 1、 原料前处理选择成熟老椰子果实， 然后去壳， 削去种皮， 清洗、 刨丝、 榨汁， 得到 椰麸。 将椰麸在4050干燥后粉碎， 过4060目筛， 然后按质量体。

16、积比(m/v)为1 101 20的比例加入石油醚或乙醚提取剩余的椰子油， 得到脱脂椰麸粉。 0012 2、 提取球蛋白在脱脂椰麸粉中按质量体积比(m/v)为1 101 30的比例加入0.4 0.5mol/L的氯化钠溶液， 室温下震荡提取23h， 过滤， 收集滤液； 按照如上方法反复提取 3次， 合并收集的滤液。 将滤液在410、 1000012000rpm的条件下离心1520min， 收集 上清液。 将上清液装入截留分子量为40008000透析膜中， 在46的蒸馏水中透析12 24小时， 去除盐离子、 可溶性糖、 小分子蛋白等杂质； 同时， 由于在蒸馏水中不能溶解， 椰麸 球蛋白在透析过程中会。

17、逐渐沉淀析出。 透析结束后， 将透析液在410、 8000012000rpm 的条件下离心1520min， 收集沉淀， 真空冷冻干燥后即可获得纯度较高的椰麸球蛋白。 0013 3、 复合酶水解制备将椰麸球蛋白按质量体积比(m/v)为1 15的比例溶解于0.1 0.3M磷酸缓冲液中， 调节pH至8.0pH9.0， 然后按质量百分比为0.51(m/m)的比例加入 碱性蛋白酶， 4555下震荡水解36h， 调节水解溶液pH至7.0pH7.5， 接着按质量百分 比为0.51(m/m)的比例加入中性蛋白酶， 5055下震荡水解24h， 调节水解溶液pH 至2.0， 再按质量百分比为0.30.6(m/m)。

18、的比例加入胃蛋白酶， 37下震荡水解24h， 调节水解溶液pH至7.0， 最后按质量百分比为0.30.6(m/m)的比例加入胰蛋白酶， 37 下震荡水解24h； 将酶解液在95100下加热510min， 灭酶。 0014 4、 高速离心分离将灭酶后的酶解液在46、 1000012000rpm的条件下离心25 说明书 2/6 页 4 CN 105803024 A 4 30min， 收集上清液； 冷冻干燥后可得到多肽初提物。 0015 5、 凝胶色谱分离将多肽初提物进行SephadexG-15柱层析分离。 柱长0.61.2米， 直径为1620mm， 固定相为SephadexG-15， 纯水洗脱， 。

19、流速0.60.8mL/min,每5分钟收集 一次， 洗脱液在220nm处用分光光度计比色。 可分离出5个多肽组分。 经检测表明， 第5个多肽 组分对ACE的抑制率最高。 不断重复该步骤， 收集第5个多肽组分， 冷冻干燥后可得到该多肽 组分的粉末。 由于SephadexG-15有脱盐的作用， 因而本步骤也可除去多肽提取物中的盐 分。 0016 6、 反向高效液相色谱纯化将上述凝胶色谱分离所得的第5个多肽组分在反向高效 液相色谱(reversed-phasehighperformanceliquidchromatography,RP-HPLC)上进行 进一步分离和纯化： 将第5个多肽组分按0.61。

20、mg/mL的比例溶解于蒸馏水中， 过0.22微米 的膜， 收集滤液； 将滤液进行反向高效液相色谱分离， 所用分离柱为碳18半制备柱(Zorbax semi-preparativeC18column， 9.4mm250mm),二元梯度浓度洗脱， 流动相A为含0.1三 氟乙酸的乙腈、 流动相B为超纯水， 流速2.02.5mL/min， 柱温3040， 检测波长220nm， 可 分离出12个多肽组分。 实验表明， 其中第9个多肽组分对ACE抑制率最高。 将第9个组分进一 步用碳18分析柱-反相高效液相色谱分离(ZorbaxanalyticalC18column， 4.6mm 250mm),二元梯度浓。

21、度洗脱， 流动相A为含0.1三氟乙酸的乙腈、 流动相B为超纯水， 流速 0.81.0mL/min， 柱温3040， 检测波长220nm， 可分离为2个纯肽。 将2个纯肽分别收集， 冷冻干燥， 保存。 0017 经LC-MC/MC分析鉴定， 这2个纯肽的氨基酸序列和分子量分别为： 1、 Leu-Leu-Leu- Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Arg， 分子量为1017.6Da； 2、 Arg-Pro-Phe-Asn-Leu-Phe-His-Lys， 分 子量为1057.58Da。 二者对ACE的抑制率均在70以上。 0018 本发明以从椰麸中制备的椰麸球蛋白为底物， 采用复合酶解、 凝。

22、胶色谱分离、 反向 高效液相色谱纯化等技术制备出纯度达95以上的ACE抑制肽， 由于制备过程中使用了胃 蛋白酶和胰蛋白酶， 因而两个多肽对人体胃肠道消化系统中的消化酶的稳定性较好， 既可 以用于天然抗高血压药物的成分， 也可以添加到食品中， 进行食源性预防和治疗高血压， 利 于实现对椰子的综合利用和精深加工， 又可以变废为宝， 有力促进我国椰子产业的发展。 附图说明 0019 图1是Leu-Leu-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Arg(分子量为1017.6Da)的LC-MS/MS 图。 0020 图2是Arg-Pro-Phe-Asn-Leu-Phe-His-Lys(分子量为1。

23、057.58Da)的LC-MS/MS图。 具体实施方式 0021 下面结合实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。 以下实施例用于 说明本发明， 但不是用来限制本发明的范围。 0022 一、 ACE抑制肽的制备 0023 实施例一 0024 1、 原料前处理选择成熟老椰子果实， 然后去壳， 削去种皮， 清洗、 刨丝、 榨汁， 得到 椰麸。 将椰麸在45干燥后粉碎， 过60目筛， 然后按1 10(m/v)的比例加入石油醚或乙醚提 说明书 3/6 页 5 CN 105803024 A 5 取剩余的椰子油， 得到脱脂椰麸粉。 0025 2、 提取球蛋白在脱脂椰麸粉中按1 10(m/v)的比。

24、例加入0.4mol/L的氯化钠溶液， 室温下震荡提取2h， 过滤， 收集滤液。 在滤渣中再次加入上述氯化钠溶液(1 10， m/v)， 按照 如上方法反复提取3次， 合并收集的滤液。 将滤液在4、 12000rpm的条件下离心15min， 收集 上清液。 将此上清液装入截留分子量为8000透析膜中， 在4的蒸馏水中透析12小时， 去除 盐离子、 可溶性糖、 小分子蛋白等杂质， 并使球蛋白逐渐沉淀析出。 透析结束后， 将透析液在 4、 12000rpm的条件下离心15min， 收集沉淀， 真空冷冻干燥后获得椰麸球蛋白。 0026 3、 复合酶水解制备将椰麸球蛋白溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(。

25、1 15， m/v)中， 调节 至pH9.0， 加入碱性蛋白酶(0.1， m/m)的， 50下震荡水解3h， 然后调节水解溶液至pH 7.0， 加入中性蛋白酶(1， m/m)， 55下震荡水解2h。 接着调节水解溶液至pH2.0， 加入胃 蛋白酶(0.5， m/m)， 37下震荡水解2h； 最后调节水解溶液至pH7.0， 加入胰蛋白酶 (0.5， m/m)， 37下震荡水解2h。 将水解液在100下加热5min， 灭酶。 0027 4、 高速离心分离将灭酶后的酶解液在4、 12000rpm的条件下离心25min， 收集上 清液。 冷冻干燥后可得到多肽初提物。 0028 5、 凝胶色谱分离将多肽。

26、初提物进行SephadexG-15柱层析分离。 柱长1.0米， 直径 为16mm， 固定相为SephadexG-15， 纯水洗脱， 流速0.8mL/min,每5分钟收集一次， 洗脱液在 220nm处用分光光度计比色。 可分离出5个多肽组分。 经检测表明， 第5个多肽组分对ACE的抑 制率最高。 不断重复该步骤， 收集第5个多肽组分， 冷冻干燥后可得到该多肽组分的粉末。 0029 6、 反向高效液相色谱纯化将上述凝胶色谱分离所得的第5个多肽组分在反向高效 液相色谱上进行进一步分离和纯化： 将第5个多肽组分溶解于蒸馏水中(1mg/mL)， 过0.22微 米的膜， 收集滤液。 将该滤液进行反向高效液。

27、相色谱分离， 所用分离柱为碳18半制备柱 (Zorbaxsemi-preparativeC18column， 9.4mm250mm),二元梯度浓度洗脱， 流动相A为乙 腈(含0.1三氟乙酸)、 流动相B为超纯水， 流速2.5mL/min， 柱温40， 检测波长220nm， 可分 离处12个多肽组分。 将第9个组分进一步用碳18分析柱-反相高效液相色谱分离(Zorbax analyticalC18column， 4.6mm250mm),二元梯度浓度洗脱， 流动相A为乙腈(含0.1三氟 乙酸)、 流动相B为超纯水， 流速1.0mL/min， 柱温35， 检测波长220nm， 可分离为2个纯肽， 分。

28、 别收集， 冷冻干燥， 保存。 0030 实施例二、 0031 1、 原料前处理选择成熟老椰子果实， 然后去壳， 削去种皮， 清洗、 刨丝、 榨汁， 得到 椰麸。 将椰麸在50干燥后粉碎， 过60目筛， 然后按1 15(m/v)的比例加入石油醚或乙醚提 取剩余的椰子油， 得到脱脂椰麸粉。 0032 2、 提取球蛋白在脱脂椰麸粉中按1 10(m/v)的比例加入0.4mol/L的氯化钠溶液， 室温下震荡提取3h， 过滤， 收集滤液。 在滤渣中再次加入上述氯化钠溶液(1 15， m/v)， 按照 如上方法反复提取3次， 合并收集的滤液。 将滤液在4、 10000rpm的条件下离心20min， 收集 。

29、上清液。 将此上清液装入截留分子量为8000透析膜中， 在4的蒸馏水中透析24小时， 去除 盐离子、 可溶性糖、 小分子蛋白等杂质， 并使球蛋白逐渐沉淀析出。 透析结束后， 将透析液在 4、 10000rpm的条件下离心20min， 收集沉淀， 真空冷冻干燥后获得椰麸球蛋白。 0033 3、 复合酶水解制备将椰麸球蛋白溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(1 15， m/v)中， 调节 至pH9.0， 加入碱性蛋白酶(0.6， m/m)的， 50下震荡水解6h， 然后调节水解溶液至pH 说明书 4/6 页 6 CN 105803024 A 6 7.0， 加入中性蛋白酶(0.6， m/m)， 55下。

30、震荡水解4h。 接着调节水解溶液至pH2.0， 加入 胃蛋白酶(0.6， m/m)， 37下震荡水解2h； 最后调节水解溶液至pH7.0， 加入胰蛋白酶 (0.6， m/m)， 37下震荡水解2h。 将水解液在95下加热10min， 灭酶。 0034 4、 高速离心分离将灭酶后的酶解液在4、 10000rpm的条件下离心30min， 收集上 清液。 冷冻干燥后可得到多肽初提物。 0035 5、 凝胶色谱分离将多肽初提物进行SephadexG-15柱层析分离。 柱长0.8米， 直径 为16mm， 固定相为SephadexG-15， 纯水洗脱， 流速0.6mL/min,每5分钟收集一次， 洗脱液在。

31、 220nm处用分光光度计比色。 可分离出5个多肽组分。 经检测表明， 第5个多肽组分对ACE的抑 制率最高。 不断重复该步骤， 收集第5个多肽组分， 冷冻干燥后可得到该多肽组分的粉末。 0036 6、 反向高效液相色谱纯化将上述凝胶色谱分离所得的第5个多肽组分在反向高效 液相色谱上进行进一步分离和纯化。 将第5个多肽组分溶解于蒸馏水中(1mg/mL)， 过0.22微 米的膜， 收集滤液。 将该滤液进行反向高效液相色谱分离， 所用分离柱为碳18半制备柱 (Zorbaxsemi-preparativeC18column， 9.4mm250mm),二元梯度浓度洗脱， 流动相A为乙 腈(含0.1三氟。

32、乙酸)、 流动相B为超纯水， 流速2mL/min， 柱温40， 检测波长220nm， 可分离 处12个多肽组分。 将第9个组分进一步用碳18分析柱-反相高效液相色谱分离(Zorbax analyticalC18column， 4.6mm250mm),二元梯度浓度洗脱， 流动相A为乙腈(含0.1三氟 乙酸)、 流动相B为超纯水， 流速1.0mL/min， 柱温35， 检测波长220nm， 可分离为2个纯肽， 分 别收集， 冷冻干燥， 保存。 0037 二、 实施例所得产物鉴定 0038 取实施例一、 实施例二所得产物经LC-MC/MC分析鉴定， 这2个纯肽的氨基酸序列和 分子量分别为： 0039。

33、 、 Leu-Leu-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Arg， 分子量为1017.6Da， 其LC-MS/MS图如 图1所示。 0040 、 Arg-Pro-Phe-Asn-Leu-Phe-His-Lys， 分子量为1057.58Da， 其LC-MS/MS图如图 2所示。 0041 三、 纯肽对ACE的抑制效果鉴定 0042 纯肽对ACE的抑制效果采用体外测定的方式进行， 测定方法按照文献(Jimsheena& Gowda， 2009)中方法进行： 0043 50微升纯肽(1mg/mL)、 50微升的血管紧张素转化酶(ACE， 25millunits/mL)和150 微升、 8。

34、.3毫摩尔/升的马尿酰-组氨酸-亮氨酸(HHL)混合均匀， 37下反应60分钟后， 加入 250微升、 1摩尔/升的盐酸终止反应。 然后加入1.4毫升的乙酸乙酯， 充分混匀后， 14100g下 离心5分钟。 吸取上层清液1毫升到敞口玻璃试管中， 在80下干燥1小时， 然后加入2毫升蒸 馏水， 在228nm下测吸光度。 每组测定三个重复， 计算平均抑制率， 结果见表1。 抑制率按照如 下公式计算： 0044 血管紧张素转化酶抑制率()(1-AS/AC)100 0045 式中， As表示加入纯肽的吸光度值， Ac表示未加纯肽的吸光度值。 0046 表1纯肽对ACE的抑制效果 说明书 5/6 页 7。

35、 CN 105803024 A 7 0047 0048 上述结果表明， 本发明以椰麸球蛋白为底物， 采用复合酶解、 凝胶色谱分离、 反向 高效液相色谱纯化等技术制备的纯肽 、 对ACE的抑制率分别为76.26和82.33， 均高 于70， 有作为治疗高血压天然药物成分的潜在能力。 0049 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说明书 6/6 页 8 CN 105803024 A 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 105803024 A 9 。