技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及鸡肾型传染性支气管炎病 毒毒株及其疫苗组合物、制备方法及其应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎是由冠状病毒引起的一种急性、高度接触性传染 病，根据病毒的组织嗜性和引起的病变部位常分为呼吸型、肾型、生殖 型及腺胃型等。
1948年，美国首次报道了肾型传染性支气管炎(Kidneyinfectious bronehitis)。1962年，Winterfied等在美国发现了致肾病变型传染性支 气管炎病毒，并将其命名为Holte株、Gray株、CV56b株、Wolgemuth 株等(WinterfieldRW，HitchnerSB.Etiologyofaninfectious nephritis-nephrosissyndromeofchickens.Am.J.Vet.Res.1962,23:1273～ 1279)。同年，Cumming在澳大利亚分离出N1/62(T株)，该病毒被 认为是嗜肾型传染性支气管炎病毒的代表株(CummingRGB.Infectious aviannephrosis(uraemia)inAustralia.AustVetJ.1963,39:145-147)。20 世纪90年代以来，肾型传染性支气管炎在国内也相继爆发，流行十分 广泛。尤其是近几年，鸡肾型传染性支气管炎在我国肉鸡群中大面积流 行，给养鸡生产带来了严重的损失。
禽传染性支气管炎病毒为典型的冠状病毒，基因组为单股正链 RNA，其基因组编码四种必需的结构蛋白：纤突蛋白(S蛋白)、膜蛋 白(M蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)和小膜蛋白(E蛋白)，其中S蛋 白由mRNA2编码，翻译后的产物在细胞内被切割为S1蛋白和S2蛋白。 由于肾型传染性支气管炎病毒及其毒株的变异十分复杂，在一定条件下 生物学特性及血清型水平上常发生一些变异毒(株)种，使得本病的诊 治遇到很大的困难。临床中，正常免疫鸡群也经常发生该病，其主要表 现为以下症状：前期气管口罗音、拉白色稀粪，后期主要呈水样下痢， 由于严重脱水，脚爪干枯(俗称“干爪病”)，病死鸡呈现肾脏肿大以及尿 酸盐沉积等主要特征症状。经实验室诊断，结合流行特点、临床症状及 病理剖检变化，可确诊为肾型传染性支气管炎。因此，研究开发一种新 的能有效预防当下流行的传染性支气管炎的鸡传染性支气管炎疫苗十 分重要。
专利申请CN101514334A公开了将分离的一株传染性支气管炎病毒 强毒株tl/CH/LDT3/03株，在9-10日龄SPF鸡胚中进行连续传代致弱， 传至120代，致弱评价试验合格，其作为弱毒疫苗株使用，命名为 LDT3-A，然而其疫苗株S1基因序列我国当前IBV流行毒株同源性较低， 不能对当前的肾型流行株提供完全的保护。
鸡传染性支气管炎(嗜肾型)活疫苗(W93株)的研究(王文成，卫广 森，李尚波等.鸡传染性支气管炎(嗜肾型)活疫苗(W93株)的研究. 中国预防兽医学报，2001，23(6):436-440)公开了通过鸡胚连续传代致 弱获得一株弱毒株W93株，应用于低日龄雏鸡免疫预防，然而该毒株分 离传代致弱年代较早，与当前流行毒株基因水平相距较远，无法提供有 效保护。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种与当前IBV流行毒株 基因同源性高的鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株、及其制备的灭活疫 苗、致弱活疫苗、亚单位疫苗其制备方法以及应用，该疫苗能够同时有 效预防当前IBV流行毒株感染以及经典IBV毒株感染。
本发明的第一方面涉及一种鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株，所述 鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株基因编码序列为SEQIDNO.2的蛋白。
术语“鸡肾型传染性支气管炎病毒株”是指将鸡肾型传染性支气管炎 病毒经本领域技术人员采用常规技术手段分离得到的毒株，包括但不限 于其S1蛋白具有与SEQIDNo.1基本相同的核苷酸序列的鸡肾型传染性 支气管炎病毒。与SEQIDNo.1基本相同是指，鸡肾型传染性支气管炎 病毒的核苷酸序列优选包含与SEQIDNo.1有85％-100％相同的序列， 优选在鸡肾型传染性支气管炎病毒并非本文所述鸡肾型传染性支气管 炎病毒的条件下，例如与作为参考病毒分离物的PLK株(CCTCCNO. V201442)相比，S1蛋白的核苷酸序列同源性低于91％，优选低于92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。鸡肾型传染性支气管炎病 毒核苷酸序列优选有超过80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％或89％，与SEQIDNo.1相同，同样优选在鸡肾型传染性支 气管炎病毒并非本文所述鸡肾型传染性支气管炎病毒的条件下，例如与 作为参考病毒分离物PLK株相比，S1蛋白的核苷酸同源性低于91％， 优选低于92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
术语“同源性”是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。 氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的 方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基 酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比 对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上 计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分 比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公 知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术 信息中心NCBI的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi， 或者见，例如，AltschulS.F.etal，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)； StephenF.etal，NucleicAcidsRes.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2 软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得： http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，HigginsD.G.etal， MethodsinEnzymology，266：383-402(1996)；LarkinM.A.etal， Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee 软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得： http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如， PoirotO.etal，NucleicAcidsRes.，31(13)：3503-6(2003)；NotredameC.et al，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可 以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参 数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
优选地，所述鸡肾型传染性支气管炎病毒株，其M蛋白具有如SEQ IDNo.3所示的基因序列，编码氨基酸序列SEQIDNo.4。
术语“M蛋白”是鸡肾型传染性支气管炎病毒的结构蛋白之一，由 224～225个氨基酸组成(张有峰，禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基 因VR1020和pVAX1的构建及免疫原性研究，四川农业大学硕士论文， 2008)。
进一步优选地，所述鸡肾型传染性支气管炎病毒株，其N蛋白具有 如SEQIDNo.5所示的基因序列，编码氨基酸序列SEQIDNo.6。
术语“N蛋白”是鸡肾型传染性支气管炎病毒的结构蛋白之一，由409 个氨基酸组成(张有峰，禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因VR1020 和pVAX1的构建及免疫原性研究，四川农业大学硕士论文，2008)。
作为本发明的一种实施方式，所述鸡肾型传染性支气管炎病毒PLK 株，保藏号为CCTCCNO.V201442。
鸡传染性支气管炎病毒PLK株(InfectiousBronchitisVirus,strain PLK)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201442， 保藏地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期为2014年12月9日。
本发明的另一方面涉及一种鸡肾型传染性支气管炎病毒的弱毒株， 其中，所述鸡肾型传染性支气管炎病毒弱毒株是基因编码序列为SEQID NO.2的蛋白的鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株通过在鸡胚中连续传代 至第110-140代次中任一代次的弱毒株；或者所述鸡肾型传染性支气管 炎病毒弱毒株是所述鸡肾型传染性支气管炎病毒PLK株通过在鸡胚中 连续传代至第110-140代次中任一代次的弱毒株。
本发明的另一方面涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包 括免疫量的所述的鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株抗原和药学上可接 受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株 抗原为灭活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、亚单位抗原。
作为本发明的一种实施方式，所述的疫苗组合物包括灭活前0.4× 106.7EID50/0.1ml的灭活的全病毒抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，所述灭活后的鸡肾型传染性支气 管炎病毒毒株是通过将所述鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株在鸡胚上 扩增获得的鸡胚液经灭活剂灭活所得。
作为本发明的一种优选实施方式，所述灭活后的鸡肾型传染性支气 管炎病毒毒株是通过将所述鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株在传代细 胞上培养扩增获得的培养物经灭活剂灭活所得。
作为本发明的一种实施方式，所述的疫苗组合物包括 1.0～7.0log10EID50减毒的全病毒抗原；优选地，所述的疫苗组合物包括 2.5～5.0log10EID50减毒的全病毒抗原；最优选地，所述的疫苗组合物包 括3.0～4.0log10EID50减毒的全病毒抗原。
本发明提供了鸡肾型传染性支气管炎病毒弱毒株，所述鸡肾型传染 性支气管炎病毒弱毒株是通过在鸡胚中将所述鸡肾型传染性支气管炎 病毒毒株传代110-140代而得来弱毒株，以使得当该经修饰的病毒给予 至易感染IBV的动物时，其无法引起IBV疾病的临床征象，但能诱导使 该免疫动物对IBV的病原性形式免疫的免疫反应。
本发明提供了鸡肾型传染性支气管炎弱毒活疫苗，所述弱毒活疫苗 含有所述鸡肾型传染性支气管炎病毒弱毒株和/或兽医学上可接受的载 体。
作为本发明的一种实施方式，所述鸡肾型传染性支气管炎病毒弱毒 株为将鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株PLK株经鸡胚连续传代致弱的 毒株，通过在鸡胚中将所述鸡肾型传染性支气管炎病毒PLK株传代 110-140代而得来弱毒株。
作为本发明的一种实施方式，所述载体包括冻干保护剂、佐剂，所 述冻干保护剂包括蔗糖脱脂牛奶和明胶及蔗糖；所述佐剂包括铝胶佐 剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基 丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、 RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂 质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽 或Gel佐剂中的一种或几种。
作为本发明的一种实施方式，疫苗组合物中鸡肾型传染性支气管炎 病毒传代至110-140代而得的弱毒株的含量通常为1.0～7.0log10EID50， 优选为2.5～5.0log10EID50，更优选为3.0～4.0log10EID50。
所述弱毒活疫苗还含有其他成分，所述其他成分包括粘合剂、着色 剂、干燥剂、消毒剂、稳定剂、赋形剂、吸附促进剂、脂肪酸、表面活 性剂、水及缓冲剂，优选为包括缓冲剂、消毒剂及表面活性物质。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种鸡肾型传染性支气管 炎亚单位疫苗，所述的疫苗组合物包括0.5～1.5μg/ml的S1蛋白、0.5～1.5 μg/ml的M蛋白或N蛋白，或0.5～1.5μg/ml的S1蛋白、0.25～0.75μ g/ml的M蛋白和0.25～0.75μg/ml的N蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种鸡肾型传染性支气管 炎亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包含SEQIDNo.2编码的S1蛋白、SEQ IDNo.4编码的M蛋白和/或SEQIDNo.6所编码的N蛋白。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种鸡肾型传染性支 气管炎亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包含0.5～1.5μg/ml的SEQIDNo.2 编码的S1蛋白、0.5～1.5μg/ml的SEQIDNo.4编码的M蛋白或0.5～1.5 μg/mlSEQIDNo.6所编码的N蛋白，或者0.5～1.5μg/ml的SEQIDNo.2 编码的S1蛋白、0.25～0.75μg/ml的SEQIDNo.4编码的M蛋白和 0.25～0.75μg/ml的SEQIDNo.6所编码的N蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述的疫苗组合物还包括佐 剂。
术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如QuilA、QS-21 (CambridgeBiotechIncorporation,CambridgeMA)、GPI-0100 (GalenicaPharmaceuticalsIncorporation，BirminghamAL)；油包水 乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物； 顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。
术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(EuropeanPharmacopea类 型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoidoil)，如角鲨烷 (squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或 醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸 酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂 肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。 乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇 (mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol) 的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬 脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还 有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。 参见Hunter等编写的《Thetheoryandpracticalapplicationof adjuvants》(Ed.byDESStewart-Tull,JohnWileyandSons,NewYork, 1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例 如，可使用PowellM和NewmanM编写的《Vaccinedesign,theSubunit andadiuvantapproach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT 乳剂及第183页描述的MF59乳剂。
术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲 基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这 些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol) (Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利 US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交 联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个 羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙 烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenicallyunsaturatedgroup)。 所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普 的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基 蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及 卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。
术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯 二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解 产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液， 能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。
术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Blockco-polymer(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron, EmeryvilleCA)、单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA)、Avridine 脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。
优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、 水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯 基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、 单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒 素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
在一些优选的实施方案中，所述灭活疫苗包含一种或多种非鸡肾型 传染性支气管炎病毒的灭活病原体，如：非鸡肾型传染性支气管炎病毒 灭活病原体可选自、鸡新城疫病毒(newcastlediseasevirus，NDV)、 禽痘病毒(avianpoxvirus，APV)、禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitisvirus,AEV)、传染性法氏囊病病毒(infectiousbursal diseasevirus，IBDV)、禽多杀性巴氏杆菌(avianpasteurella multocida,Pm)、禽流感病毒(avianinfluenzavirus，AIV)、产蛋下降 综合征(eggdropsyndrome-76virus,EDS-76virus)。
在一些实施方案中，所述灭活疫苗进一步包含一种或多种选自以下 的其他鸡传染性支气管炎病毒灭活病原体，诸如：M41株(购自中国 兽医药品监察所)。
本发明的另一方面在于提供所述鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株 的抗原蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明的鸡肾型传染性支气管炎病毒 毒株抗原蛋白为S1蛋白，所述蛋白编码SEQIDNO.2的氨基酸序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明的鸡肾型传染性支气管炎病毒 毒株抗原蛋白为M蛋白，所述蛋白编码SEQIDNO.4的氨基酸序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明的鸡肾型传染性支气管炎病毒 毒株抗原蛋白为N蛋白，所述蛋白编码SEQIDNO.6的氨基酸序列。
本发明的另一方面在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法。
作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：(1)扩增培养所述 鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株；(2)灭活所述扩增培养的鸡肾型传 染性支气管炎病毒毒株，加入药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：(1)在鸡胚上连续 传代所述鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株，传代至110-140代；(2)扩 增培养所述传代110-140代的致弱鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株； (3)在所述扩增培养的致弱鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株中加入药 学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：(1)分别克隆表达 所述鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株的S1蛋白、M蛋白、N蛋白；(2) 按比例加入所述表达的S1蛋白、M蛋白和/或N蛋白；(3)在上述鸡 肾型传染性支气管炎病毒抗原蛋白中加入药学上可接受的载体。
本发明的另一方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗 鸡肾型传染性支气管炎相关疾病中的应用。
术语“预防”指通过其与鸡肾型传染性支气管炎病毒相关的感染或疾 病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与鸡肾型传染性支气管炎病 毒相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
本发明的优点在于：
提供一株鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株，由该毒株制备的灭活疫 苗不仅能有效防治目前国内流行的鸡肾型传染性支气管炎，还能有效保 护呼吸型IBV强毒株的攻毒。
所提供的亚单位疫苗由提供毒株的S1、M及N基因进行表达后制 备获得，该亚单位疫苗对鸡肾型传染性支气管炎、呼吸型IBV强毒株的 攻毒能提供有效保护。
附图说明
图1为IBVPLK株S1基因PCR扩增产物电泳鉴定，其中，左边泳 道为DL2000Marker，右边泳道为IBVS1基因PCR扩增产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点 将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发 明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或 替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所采用的传染性支气管炎病毒PLK毒株，保藏号为 CCTCCNO.V201442，保藏日期为2014年12月09日，保藏单位为中 国典型培养物保藏中心。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
本发明实施例以体积比为1:1的冻干保护剂(8％(W/W)明胶、40％ (W/W)蔗糖)制备肾型鸡传染性支气管炎活疫苗，以体积比为46:54 (抗原：ISA206油佐剂)制备肾型鸡传染性支气管炎亚单位疫苗为例分 别进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限 定。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发 明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生 物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定、保藏及基因测序
1.1鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定、保藏
鸡肾型传染性支气管炎病毒于2013年年初由普莱柯生物工程股份 有限公司技术人员从疑似爆发传染性支气管炎鸡场患病鸡明显病变肾 脏组织(肿大，呈花斑样)中分离得到，鸡胚接种扩大培养获得病毒液， 所获取病毒液可引起接种鸡胚发生失水、蜷缩、发育小等传染性支气管 炎病毒典型病变；经负染电镜、RT-PCR检测证实所获得病毒为鸡传染 性支气管炎病毒。动物回归实验证明该毒株可引起鸡发生以肾脏肿大、 严重可见花斑肾样典型的鸡肾型传染性支气管炎临床症状。因而将其归 类为鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株，命名为PLK株。
PLK株的保藏信息为：保藏号为CCTCCNO.V201442，保藏日期 为2014年12月09日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
1.2鸡肾型传染性支气管炎病毒S1基因测序
通过RT-PCR反应扩增得到PLK株的S1基因(见SEQIDNo.1)， 然后进行基因克隆及序列测定，并对PLK株与H120、W93和LDT3-A 疫苗株S1基因进行S1基因序列进行对比分析。
PLK株S1基因序列测序结果详情SEQIDNo.1，与IBVH120，H52 和W93疫苗株S1基因序列进行多重比对，发现PLK株与H120、W93 和LDT3-A疫苗株S1基因的同源性分别为78％、77.8％、和85.2％，表 明：PLK株S1基因与上述传统疫苗株相比，存在多处核苷酸变异，并 导致了相应氨基酸序列的改变。
实施例2鸡肾型传染性支气管炎灭活疫苗的制备
2.1鸡传染性支气管炎病毒PLK株生产用种毒种子批的建立
取分离的PLK株，用灭菌生理盐水稀释100倍，接种于9～10日龄 SPF鸡胚尿囊腔内，每胚接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育。 弃去24h死胚，鸡胚观察至48h，将30～72h的鸡胚气室向上，置4℃冷 却4～24h。收获鸡胚尿囊液，将若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置灭菌 瓶中，在2～8℃保存，同时做无菌检验，依此方法使用SPF鸡胚对鸡传 染性支气管炎病毒强毒株PLK株进行了连续13代传代。按照《中华人 民共和国兽药典》(2010年版)对E2～E13代种毒进行鉴定，结果表明： 未发现细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染；病毒含量为106.0～ 107.3EID50/0.1ml；将E3、E7和E13代的病毒液制成灭活疫苗，免疫鸡 后28天即可产生完全保护。依据试验结果，建立了PLK株生产用种毒 的种子批。将PLK株P2代作为原始种子，PLKP3～P7作为基础种子， 生产用种子继代不超过3代。同时选择PLK株作为效检用毒株，将病毒 用灭菌生理盐水稀释至106.0ELD50/0.1ml，通过肌肉注射1ml/羽，同时滴 鼻点眼0.2ml/羽的剂量对10只2月龄SPF鸡攻毒，攻毒后观察14日， 死亡鸡及时记录、剖检，存活鸡观察14日后剖检，应至少有8只鸡发 生以肾肿、花斑肾为典型病变的症状。
2.2鸡传染性支气管炎病毒灭活疫苗的制备
2.2.1生产种子制备与检验
将PLK株P3、P4、P7冻干基础种毒复水后，使用灭菌生理盐水进 行稀释，经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1ml/胚，37℃培养观察48小时。无 菌收集24小时～48小时死亡鸡胚的尿囊液，混合作为生产种子。按照 《中华人民共和国兽药典》(2010年版)所述方法进行毒价测定、病毒 含量测定、特异性鉴定和纯净性检验。
使用PLK株P3、P4、P7代基础种毒各制备了1批生产种子，每批 100ml。检验结果为3批均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，病 毒含量分别为106.6、106.8和107.0EID50/0.1ml。
2.2.2制苗用毒液的制备
使用灭菌生理盐水将步骤2.2.1的生产种子进行100倍稀释，经尿 囊腔接种10～11日龄易感鸡胚，0.1ml/胚，37℃培养观察48小时，收 集24小时以后死亡胚及活胚，无菌收集鸡胚液，作为制苗用毒液。
使用上述3批生产种子各制备了1批病毒液，批号分别是1001、1002 和1003，每批约200ml，病毒含量分别是106.7、106.5、106.8EID50/0.1ml。
2.2.3病毒灭活及检验
向步骤2.2.2项制备的三批病毒液中，加入10％甲醛溶液，使甲醛 溶液的终浓度为0.2％(体积百分含量)，充分混匀后，37℃灭活16～ 18小时，期间每隔2～4小时振摇一次。灭活完成后，取样做灭活检验。 使用10日龄SPF鸡胚10枚，经尿囊腔接种0.2ml原液，37℃培养观察 5天，并照此方法，取胚液盲传一代，鸡胚无IBV典型病变为灭活完全。 结果表明：3批灭活后的病毒液在SPF鸡胚上连传2代，均不引起鸡胚 死亡，IBV典型病变。表明病毒灭活彻底。
2.2.4疫苗配制
用经步骤2.2.3项灭活处理的病毒液制备了三批疫苗1001、1002和 1003。
2.2.5油相制备
按注射用白油94容量份、司本-806容量份和硬脂酸铝1.5容量份 的比例配制油相。
取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化至半透明状再与全量 司本-80及注射用白油混合均匀，经116℃灭菌30分钟，冷却至室温备 用。
2.2.6水相制备
将96容量份步骤2.2.2项的病毒含量为106.7EID50/0.1ml(灭活前) 的IBV1001批病毒液，经步骤2.2.3灭活检验合格后，加入灭菌吐温-80 4重量份，充分振荡混匀，直到吐温-80完全溶解，得到水相。
按照油相和水相1.5:1的容量比，将油相加入匀浆杯中，低速转动 时，缓慢加入水相。加完水相后匀浆2～3分钟，停止乳化前加入乳剂 总重量的0.01％的硫柳汞，得到批号为1001的500ml疫苗。
重复2.2.2～2.2.6的方法，分别使用1002和1003批病毒液制备了 一批灭活疫苗，批号分别是1002和1003。
将批号分别为1001、1002和1003的500ml疫苗，定量分装，贴签 后，2～8℃保存。同时抽样按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版) 的规定做无菌检验、物理性状检验、甲醛含量和硫柳汞含量测定。结果， 3批疫苗均无菌生长；物理性状、甲醛和硫柳汞含量均符合规定。
2.3最小免疫剂量试验
使用1001和1002两批疫苗，各用0.5、0.25和0.13ml三个剂量， 各经皮下注射免疫10只40日龄(H120基础免疫后21天)的SPF鸡。 28天后，用PLK株P2代以106.0ELD50/0.1ml，通过肌肉注射1ml/羽， 同时滴鼻点眼0.2ml/羽的剂量进行攻毒，10只/组，攻毒后观察14日， 死亡鸡及时记录、剖检，存活鸡观察14日后剖检，判定是否发病。达 到拟订的HI效力标准的最小剂量作为最小免疫剂量，并确定使用剂量。 具体结果见表2。
结果表明，以0.25ml的剂量免疫鸡时，在免疫后28天，满足8/10 鸡保护的效检标准。说明，0.25ml的剂量为最小免疫剂量，为安全起见， 确定使用剂量为0.5ml。
表1IBV灭活疫苗最小免疫剂量测定结果
2.4免疫效力试验
使用1001、1002和1003共3批制品进行该试验，以使用剂量0.5ml， 各经皮下注射免疫10只40日龄(H120基础免疫后21天)的SPF鸡， 同时设立对照组，用M41株灭活疫苗经皮下注射免疫20只40日龄，此 外设立生理盐水对照组20只，皮下注射0.5ml生理盐水(经H120基础 免疫)。28天后，分别用PLK株P2代及M41株以106.0ELD50/0.1ml， 通过肌肉注射1ml/羽，同时滴鼻点眼0.2ml/羽的剂量进行攻毒，攻毒后 观察14日，死亡鸡及时记录、剖检，存活鸡观察14日后剖检，PLK攻 毒组观察是否有肾肿、花斑肾等典型症状，M41株攻毒组气管有无出血 及黏性、卡他性分泌物判定是否发病。具体结果见表2。结果表明，使 用PLK株灭活疫苗对40日龄的麻鸭进行免疫后28天，对M41株及PLK 株的攻击均能产生8/10以上的保护。
表23批IBV灭活疫苗的免疫效力试验结果
2.5安全性试验
取1001、1002和1003共3批疫苗，对14日龄非免疫SPF鸡进行 了单剂量、单剂量重复和超剂量安全性试验。结果见表3～表5。
表3IBV灭活疫苗的单剂量安全性试验结果
表4IBV灭活疫苗的单剂量重复安全性试验结果
表5IBV灭活疫苗的超剂量安全性试验结果
3批疫苗的安全性试验结果表明，除注射当天稍有减食，7天内局 部稍有结节外，未见全身不良反应。
实施例3鸡肾型传染性支气管炎病毒毒株弱毒株的制备
3.1试验过程
3.1.1病毒传代
将实施例1所分离的鸡肾型传染性支气管炎病毒PLK株进行连续传 代致弱，具体为：将PLK株在9～10日龄SPF鸡胚中连续传代，每个 代次毒经尿囊腔接种5枚SPF鸡胚，每次将上一代病毒液作100倍稀释， 每胚接种100μL，置37℃培养箱孵育48h(弃去24h死胚)，每日照胚 两次，死胚取出置于4℃，48h后将所有鸡胚取出置4℃，24h，观察记 录鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液进行下一次传代。选择病变典型， 尿囊液清亮的鸡胚进行传代。
3.1.2病毒滴度测定
取PLK株P5，P10，P25，P50，P80，P100，P110，P120和P130 代次毒的鸡胚尿囊液，分别依次用生理盐水作10倍系列稀释；选择5 个稀释倍数10-4～10-8的病毒稀释悬液分别接种5枚9～10日龄的SPF 鸡胚，每枚鸡胚接种100μL，将鸡胚置37℃温箱内孵育6天，每天照胚， 记录6天内鸡胚的死亡情况，接种后6天逐胚剖检，观察鸡胚病变情况， 按Reed-Muench法计算EID50。
3.1.3无菌检验和支原体检验
分别将PLK株P5，P10，P25，P50，P80，P100，P110，P120和 P130代次毒按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原 体检验。
3.1.4外源病毒检验
分别将PLK株P5，P10，P25，P50，P80，P100，P110，P120和 P130代次毒进行外源病毒检测。
3.1.4.1鸡胚法进行外源病毒检测
取病毒样品PLK株各代次毒，做适当稀释，与抗传染性支气管炎病 毒特异性抗血清混合，室温中和1小时，取9～10日龄SPF鸡胚20枚， 10枚鸡胚尿囊腔接种，每枚接种病毒血清混合液0.2m1，另10枚鸡胚 尿绒毛尿囊膜接种病毒血清混合液0.2m1，同时设正常对照组，孵化7 日，每日照胚，接种后24小时内的死亡鸡胚为非特异性死亡，弃去不 计，每组至少8/10存活，对所有接种24小时后存活的鸡胚进行剖检， 观察有无异常。对绒毛尿囊膜进行观察，检查有无异常，并对尿囊液进 行血凝抗原检测。
3.1.4.2用细胞培养物进行外源病毒检测
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，观察是否出现CPE和 红细胞吸附现象。
3.1.4.3COFAL试验(禽白血病病毒检验)
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行。
3.1.4.5PLK株的致弱评价
100只14日龄的SPF鸡随机分为9组(每组10只)，分别将10组鸡 饲养于9个负压隔离器中，鸡分别用PLK株P5，P10，P25，P50，P80， P100，P110，P120和P130代次毒用生理盐水做适当稀释进行接种，每 只滴鼻100μL(含103.5EID50)；第10组雏鸡作为对照组，每只滴鼻100μL 正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死 亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。
3.1.4.6PLK-130株的免疫效力
40只3日龄SPF鸡随机分为2组(每组10只)，分别饲养于负压隔 离器中，其中一组雏鸡使用PLK-130株(P130)进行接种，每只滴鼻100μL (含103.5EID50)；另一组雏鸡则作为对照组，每只滴鼻100μL正常尿 囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况， 并于免疫后14天采血，对每组采集血清用本实验室制备的传染性支气 管炎HI试验抗原进行测定，同时将两组雏鸡用同源强毒PLK株P5代 进行滴鼻攻击，每只100μL(含103.0EID50)；攻毒后，每日观察、记录 鸡群的发病情况、死亡情况，并于攻毒后5日采集气管棉拭，处理后接 胚，每个棉拭样品接种5枚鸡胚，37℃孵化6日，每日照胚，接种后24 小时内的死亡鸡胚为非特异性死亡，弃去不计，接种鸡胚后144h剖检 观察鸡胚病变。
3.2结果
3.2.1PLK株的传代致弱
随着对PLK株病毒传代次数的增加，其对鸡胚的适应性越来越强， 鸡胚死亡率逐渐升高，死亡时间逐渐缩短，鸡胚病变也更加明显。接种 病毒的鸡胚呈现明显发育障碍(侏儒胚)，蜷曲胚，胚体失水、出血等典 型的传染性支气管炎病毒感染的变化。每个代次的鸡胚尿囊液均不能凝 集鸡外周血红细胞，说明鸡胚尿囊液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的 禽的其它病毒。
3.2.2病毒滴度测定结果
PLK株鸡胚传代毒滴度测定结果见表6，PLK毒株可高度适应鸡胚， P5代的EID50高达106.5EID50/0.1m1，传代后病毒滴度逐渐升高，P100～ P130代趋于稳定，滴度约为106.90EID50/0.1m1。
表6PLK株鸡胚传代毒滴度测定结果
代次 P5 P10 P25 P50 P80 P100 P110 P120 P130 EID50/0.1m1 106.50 106.63 107.22 107.16 106.85 106.80 106.78 107.0 106.90
3.2.3无菌检验和支原体检验
鸡胚传代过程中的P5，P10，P25，P50，P80，P100，P110，P120 和P130代次毒经检验无细菌、霉菌和支原体污染。
3.2.4外源病毒检验
鸡胚传代过程中的P5，P10，P25，P50，P80，P100，P110，P120 和P130代次毒经检验无外源病毒的污染。
3.2.5PLK-130株的致弱评价
PLK-130株在鸡胚上连续传代后对SPF雏鸡的致病力逐渐减弱(见 表7)。P5，P10，P25，P50代毒对SPF雏鸡发病率均为100％，死亡率 由5/10逐渐降低至1/10，P80，P100代毒对SPF雏鸡发病率分别为100％ 及80％，但死亡率为0％。发病鸡表现为精神沉郁、缩脖、被毛粗乱、 两翅下垂、张口呼吸等症状。病死鸡剖检可见气管出血，两侧肾脏肿大， 纹理清晰，外观呈现典型的“花斑肾”，有尿酸盐沉积。所有对照组鸡状 态良好，无发病或死亡。而P110，P120和P130代毒对SPF雏鸡发病率 和死亡率则均为0％,剖检未见气管出血，肾脏肿大等特异性病理变化， 与对照组SPF鸡一致。
表7PLK株不同代次毒对SPF雏鸡的致病力
组别 代次 发病率 死亡率 1 P5 100％ 50％ 2 P10 100％ 40％ 3 P25 100％ 30％ 4 P50 100％ 10％ 5 P80 100％ 0％ 6 P100 80％ 0％ 7 P110 0％ 0％ 8 P120 0％ 0％ 9 P130 0％ 0％ 对照组 - 0％ 0％
3.2.6PLK-110、PLK-120、PLK-130株的的免疫效力
分别用PLK-110、PLK-120、PLK-130株，免疫3日龄SPF鸡，免 疫剂量为含3.5log10EID50/30微升，在免疫后14天，使用PLK株对免 疫组及对照组鸡攻击，攻击后观察5天，采集气管棉拭接种鸡胚后144h 剖检，发现对照攻毒组10/10发病，免疫组(PLK-110、PLK-120、PLK-130) 均为10/10保护。攻毒后观察14天，发现免疫组鸡状态良好，无发病症 状；而对照组发病明显，表现为精神沉郁、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼 吸等症状，且在攻毒后30％(7/10)鸡死亡(见表8)。
表8PLK-110、PLK-120、PLK-130株的免疫效力
组别 攻毒后发病率 攻毒后死亡率 攻毒后剖检病变 PLK-110 0/10 0/10 无特异性病变 PLK-120 0/10 0/10 无特异性病变 PLK-130 0/10 0/10 无特异性病变 对照组 10/10 3/10 死亡鸡花斑肾
实施例4鸡肾型传染性支气管炎病毒亚单位疫苗的制备
4.1重组杆状病毒表达载体的构建
根据实施例1所测PLK株S1蛋白(依次见SEQIDNo.1)制备IBV的 S1蛋白。设计的引物序列如下：
S1基因克隆用引物：
SF1：5‘-TATTGATTAGAGATGTTGGG-3’
SR1：5‘-CATAACTAACATAAGGGCAA-3’
根据NCBI公开的鸡肾型传染性支气管炎病毒流行性变异株M蛋白 序列，并部分替换核苷酸残基，人工合成了SEQIDNo.3的M蛋白的基 因序列。
按照余娟等(余娟等，鸭源性IBVZZ2004株S1和M基因在sf9昆虫细 胞中的表达及表达蛋白的抗原性研究，河南农业大学，2012.06)文献的 操作方法构建表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白、M蛋白的重组杆状病 毒表达系统，表达纯化获得S1蛋白、M蛋白。最终获得重组纯化后S1蛋 白浓度为3.1mg/ml，重组纯化后M蛋白浓度为1.8mg/ml。
根据NCBI公开的鸡肾型传染性支气管炎病毒流行性变异株N蛋白 序列，并部分替换核苷酸残基，人工合成了SEQIDNo.5的N蛋白的基 因序列。
按照刘胜旺等(刘胜旺等，鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因的克 隆及在杆状病毒系统中的表达，中国预防兽医学报，2001.06)文献的操 作方法构建表达鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的重组杆状病毒表达系 统，表达纯化获得N蛋白。最终获得重组纯化后N蛋白浓度为2.2mg/ml。
4.2亚单位疫苗的制备
利用鸡传染性支气管炎病毒重组S1、M及N蛋白，辅以佐剂，制备 鸡传染性支气管炎亚单位疫苗。
将S1、M及N3种蛋白分别用PBS(pH7.4)稀释至2～6微克/毫升后制备 成包含不同组分的抗原稀释物(见表9)：
表9不同组别抗原稀释物
组别 抗原蛋白组成 抗原配比 1 S1 - 2 S1、M 1:1
3 S1、N 1:1 4 S1、M、N 1:0.5:0.5
将上述3个组别的抗原稀释物，与油佐剂ISA206混合乳化。ISA206 佐剂经121℃、60min高压湿热灭菌，按照抗原：佐剂体积比例46:54混合。 使用德国产IKA2000/4型乳化机，先将佐剂加入乳化机佐剂料筒内，在 搅拌状态下(100r/min)缓缓将抗原水相滴入佐剂中，滴完后，继续搅 拌5min。用乳化机5000r/min，循环乳化4min，得到亚单位疫苗，各组别 抗原制备的亚单位疫苗批号见表10。
表10亚单位疫苗批次
组别 抗原蛋白组成 批次 1 S1 1402 2 S1、M 1403 3 S1、N 1404 4 S1、M、N 1405
制备好的疫苗经粘度检测、离心检测、剂型检测、稳定性检测后， 各项指标均符合规定。疫苗保存于4℃。
4.3IBV亚单位疫苗的效力检测(亚单位疫苗免疫SPF鸡后的IBV病 毒攻毒试验)
试验鸡为21日龄的无特异性病原(SPF)鸡70只，免疫组60只，对 照组10只，免疫组60只滴鼻接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)1 羽份，接种后21日，各组随机抽取10只各分别皮下注射亚单位疫苗1402、 1403、1404及14050.5ml，10只皮下注射免疫M41株灭活疫苗0.5ml，剩 余10只皮下注射无菌生理盐水0.5ml。SPF鸡在隔离器内饲养。注射后28 天，4组亚单位疫苗和M41灭活疫苗免疫组及对照组用PLK株以103.5EID50滴鼻途径进行攻毒，攻毒后5日，采集气管棉拭子接种10日龄SPF鸡胚， 接种后144小时观察鸡胚有无传染性支气管炎典型病变，判定试验鸡有 无感染传染性支气管炎，结果见表11。
表11不同组分IBV亚单位疫苗的主动免疫试验
结果表明，相比较于市场现有的M41株灭活疫苗，由S1基因、M 基因、N基因制备的亚单位疫苗能对肾型传染性支气管炎强毒株的攻毒 提供更有效的免疫保护。相比之下，三种不同抗原组分制备的亚单位疫 苗中，同时包含S1、M、N蛋白抗原组分制备的亚单位疫苗，其免疫效 果是最好的，对强毒株的攻毒可达到10/10保护。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式 上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本 发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内， 当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效 实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质 对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明 技术方案的范围内。