技术领域
本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶PHE14及其编码基因和应用。
背景技术
手性药物不同对映体往往会表现出截然不同的生理活性和毒性，如R型的“反应停”是 孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的“反应停”对胎儿则有致畸作用；巴比妥酸盐S-(-)异构 体具有抑制神经活动的作用，而R-(+)异构体却具有兴奋作用。所以在制药行业手性化合物的 合成具有非常重要的意义。为了减少有毒副作用的对映体，并降低其生物活性，光学纯手性 药物的合成研究一直是制药研究领域的焦点。此外，由于化工行业对于手性化学品需求量巨 大，手性化合物的合成在化学工业也至关重要。
乳酸酯，特别是乳酸甲酯，是重要的香料及工业溶剂，在食品、医药、农业、精细化工 等领域都得到广泛的应用。(S)-乳酸甲酯是合成一种重要的非甾体镇痛药布洛芬的药物中间 体，并且由(S)-乳酸甲酯合成的(S)-布洛芬的疗效要比(R)-布洛芬高28倍。但由于生产技术和 生产成本方面的原因，目前我国市售的布洛芬大多数是外消旋体。随着人们对手性药物不同 对映体的生理和药理性差异的了解，以及认识到合成和使用单一对映体药物的重要性，由光 学纯乳酸甲酯直接合成相应光学纯药物的研究将会受到越来越多的重视。
手性化合物的合成主要有化学法、色谱拆分、合成法以及生物酶拆分。其中，化学法， 即利用对映体的物理和化学性质的差异进行分离，通常有盐析法、包结法、以及组合拆分。 其缺点是要求对映体之间的性质差异要大，适用的化合物不多；色谱拆分，这种方法是利用 填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是设备昂贵，普及性较差；合成法，通过 设计反应来进行手性化合物的化学合成。这种方法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能 量，而且反应中使用大量有毒的有机溶剂；生物酶具有立体位点区域和底物的高度专一性， 利用酶促反应催化具有反应条件温和、位点选择性强、副反应少、光学纯度高以及环境污染 小等优点。生物酶拆分也是目前手性药物发展的一个朝阳方向，因此开发具有光学选择性的 酯酶具有重要的意义。
发明内容
本发明的针对现有技术中酯酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种新的酯酶 PHE14及其编码基因和应用。
本发明从一株海洋假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022中开发了一种新 的酯酶PHE14及其编码基因PHE14，构建了含有PHE14的重组表达载体和基因工程菌，培 养基因工程菌后获得酯酶PHE14，其可应用于制备手性乳酸甲酯。
本发明的第一个目的是提供一种酯酶PHE14，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶PHE14的酯酶基因PHE14。
优选，所述的酯酶基因PHE14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明还提供一种含有所述的酯酶基因PHE14的重组表达载体。所述的表达载体，优选 pET28a(+)载体。
本发明还提供一种含有所述的酯酶基因PHE14的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选 大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第三个目的是提供所述的酯酶PHE14在制备手性乳酸甲酯中的应用。
优选，酯酶PHE14在拆分(±)-乳酸甲酯制备得到(S)-乳酸甲酯中的应用。
进一步优选，其步骤为：取酯酶PHE14于pH为6.0-10.0的缓冲液中，再加入(±)-乳酸 甲酯，进行反应，得到(S)-乳酸甲酯。
所述的缓冲液，优选为柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸缓冲液、Tris/HCl和Gly/NaOH缓冲液中 的一种。
本发明还提供了酯酶PHE14在耐受有机溶剂或表面活性剂环境下进行催化的应用。
所述的有机溶剂优选为二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷、正葵 烷、甲醇、乙醇、正庚醇、正葵醇、丙酮、DMF、DMSO、甲苯或四氢呋喃。
所述的表面活性剂优选为Tween-20或三聚磷酸钠。
本发明的酯酶基因PHE14来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌 (Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本 发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans) HUP022中筛选得到酯酶基因PHE14，全长为645bp(从起始密码子到终止密码子)，其编 码的酯酶PHE14含有214个氨基酸。通过克隆编码酯酶PHE14的酯酶基因PHE14并将其连 接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达 的酯酶PHE14。酯酶PHE14可用于制备手性乳酸甲酯，利用重组表达的酯酶PHE14作为催 化剂，制备得到了光学纯度大于99％的(S)-乳酸甲酯。酯酶PHE14在生物化工和生物医药等 领域具有非常大的应用价值。
附图说明
图1是酯酶PHE14对不同侧链长度的对硝基苯酚酯的酶活。
图2是酯酶PHE14的最适pH及pH稳定性。
图3是酯酶PHE14的最适反应温度和温度稳定性。其中，A为最适反应温度曲线图，B 为温度稳定性曲线图。
图4是不同浓度NaCl或KCl对酯酶PHE14酶活性影响。其中，A为NaCl对酯酶PHE14 酶活性影响曲线图，B为KCl对酯酶PHE14酶活性影响曲线图。
图5是酯酶PHE14拆分(±)-乳酸甲酯反应GC图。A为(±)-乳酸甲酯气相图，B为酯酶 PHE14拆分(±)-乳酸甲酯反应1.0h后的气相图，其中S代表(S)-乳酸甲酯，R代表(R)-乳酸甲 酯。
图6是酯酶PHE14的蛋白表达纯化情况。其中，M为蛋白Marker，1和3为未经IPTG 诱导的含有pET-28a(+)-PHE14的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有 pET-28a(+)-PHE14的大肠杆菌BL21(DE3)，4为Ni柱纯化后得到的酯酶PHE14，5为经 过脱盐柱后的酯酶PHE14。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商 的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
本发明的酯酶基因PHE14来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌 (Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。
实施例1：酯酶基因PHE14引物设计及开放阅读框边界确定
提取假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022的基因组DNA，经测序验证 无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基 因PHE14的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长为645bp(从起始密码子 到终止密码子)，其编码的酯酶PHE14的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，共214个氨基酸， 该基因是一个全新的酯酶基因。根据分析得到的酯酶基因PHE14序列，设计引物如下：正 向引物：5′-CACGAATTCGTGCTGGAATCGCCTAGC-3′，下划线部分为EcoRI酶切位点； 反向引物：5′-CCGCTCGAGTTATTTTTTGCCGAGACGTGCC3′，下划线部分为XhoI 酶切位点。
实施例2：酯酶基因PHE14的克隆及载体构建
2.1PCR扩增
将实施例1设计的引物(正向引物：5′-CACGAATTCGTGCTGGAATCGCCTAGC-3′， 反向引物：5′-CCGCTCGAGTTATTTTTTGCCGAGACGTGCC-3′)送至上海生物工程有 限公司合成引物，合成的引物使用TE稀释到10μM，以提取的假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：
表1PCR反应体系
使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因PHE14：a.94℃变性3min；b.94℃变性30s，55～65℃ 退火0.5-1min，72℃延伸1min，进行20个循环；c.72℃延伸10min，冷却到10℃。
将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察。 回收645bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20μL无菌水洗 脱，得到纯化回收的PCR产物。
2.2酶切
将纯化回收的PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间1h。酶切体系为：EcoRI2μL， XhoI2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至30μL。酶切后纯化回收得到经过双酶切的PCR 产物。
质粒pET-28a(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28a(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过 夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoRI和XhoI按以下体系双酶切，酶切时间1h。 酶切体系为：EcoRI2μL，XhoI2μL，质粒DNA<1μg，灭菌的双蒸水加至20μL。酶切后纯 化回收得到经过双酶切的pET-28a(+)载体。上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生 产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，HipureGelPureDNA MicroKit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方 法按其使用说明书。
2.3连接
将经过双酶切的PCR产物和pET-28a(+)载体按照3∶1的摩尔比例进行连接。连接使用 的T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司，连接使用的酶量为5U/5μL连接体系，连接 温度为25℃，连接时间30min。
2.4转化及筛选
取5μL连接产物于50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，后于42℃水浴锅 热激90s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养1h。取 一定量的菌液涂布于含100μL/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于 5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为 阳性克隆。
2.5基因核苷酸序列测定
将筛选的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯酶基因 PHE14核苷酸序列进行比对，确认是将酯酶基因PHE14(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示) 插入到pET-28a(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因PHE14的pET-28a(+)质粒 (命名为pET-28a(+)-PHE14)，可用于进行下一步试验。
实施例3：酯酶基因PHE14在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达
3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备
1、将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mLLB试管液中，37℃过夜摇培，250rpm；
2、按1％体积比的接种量将过夜摇培后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种到300mlLB 摇瓶中，37℃摇培3-4h(≥300rpm)，得到原培养物；
3、将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，将原培养物分装至冰预冷的离心管(50mL)， 冰置数分钟；
4、4℃，4000rpm离心10min回收细胞，去上清；
5、用冰预冷的10mL0.1M的CaCl2重悬细胞，4℃，4000rpm离心10min回收细胞；
6、重复5，用10mL0.1M的CaCl2重悬细胞，冰浴1h以上；
7、4℃，4000rpm离心10min回收细胞；
8、每50mL原培养物得到的细胞用2mL含体积分数15％DMSO的0.1MCaCl2来重悬， 分装于1.5mL离心管，100μL每管，-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细 胞。
3.2转化
取实施例2中得到的pET-28a(+)-PHE14质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感 受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激45s，冰浴2min后加入500μLLB液体培养 基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板，培养过15h后 挑选单菌。由此得到含有pET-28a(+)-PHE14的大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例4：酯酶PHE14的表达和纯化
4.1蛋白诱导
含有pET-28a(+)-PHE14的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中37℃培养至OD600为 0.5左右，加IPTG至终浓度0.2mM，20℃培养20个小时。300mL菌液4000rpm，4℃离心 10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，4000rpm，10min收集菌体。用30mL(50mM， pH7.5)PBS缓冲液重悬菌体，超声400w，超4s，停6s，破碎10min，4℃，10000rmp离心 20min，收集上清。
4.2酯酶PHE14的纯化
用镍离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行纯化得纯化的酯酶PHE14(图6)，纯 化的蛋白大小约27kD，符合理论预期。具体实施方案如下：使用10mM的咪唑洗脱5个柱体 积，30mM咪唑洗脱30个柱体积，最后使用100～1000mM咪唑洗脱5个柱体积，收集中间 3.5mL。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。
4.3酯酶PHE14酶活测定
酯酶PHE14活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①配制10mM的对硝基苯酚酯； ②在1mL反应体系中加入940μLTris-HClbuffer(50mM，pH8.0)，40μL乙醇，10μL浓度 为0.40～0.86mg/mL酯酶PHE14纯酶液；③于35℃下，3～5min后，410nm测定吸光度。
酶活单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一 个酶活单位。
实施例5：酯酶PHE14的酶学性质
5.1水解不同长度的对硝基苯酚酯
按照4.3的测定条件，比较酯酶PHE14作用不同侧链长度的对硝基苯酚酯，结果如图1， 说明酯酶PHE14对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链对硝基苯酚酯的作用效果较好， 最佳的底物是C2，即对硝基苯酚乙酸酯。
5.2最适pH和pH稳定性
配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM：
表2不同pH的缓冲溶液
将4.3中测定条件所述的缓冲液(Tris/HClbuffer)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换， 底物为对硝基苯酚乙酸酯，测定不同PH的缓冲溶液对酯酶PHE14的酶活力的影响，结果说 明酯酶PHE14酶活在Tris/HClPH为9.0时活性最高(图2)，PH高于9.0、小于9.0活性都 会急剧下降。
重组酯酶PHE14在不同的缓冲液中4℃处理12h，按4.3中测定条件(以对硝基苯酚乙酸 酯作为底物)测定酯酶PHE14酶活，结果说明酯酶PHE14可以长时间在不同的pH条件下 保持较高酶活，其对pH的耐受性较强，在pH为9.0缓冲液中稳定性最高(图2)。
5.3最适温度和温度稳定性
在pH9.0、50mMTris/HCl作为缓冲溶液，按4.3中的反应体系(以对硝基苯酚乙酸酯作 为底物)置于不同的温度(20～70℃)下处理1h后，加入等量的酯酶PHE14，在各自的温度 下反应1～5min，405nm测定酶活。结果说明，酯酶PHE14最适反应温度在60℃(图3A)。
将酯酶PHE14在20～70℃经不同时间预处理，于60℃，pH9.0、50mMTris/HCl的缓冲 溶液中，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定酯酶PHE14酶活。结果说明， 酯酶PHE14在20℃-30℃的稳定性最好，随着温度升高，稳定性逐渐降低，50℃处理40min 后酶活基本为0(图3B)。
5.4NaCl(KCl)浓度对酯酶PHE14酶活性的影响
将酯酶PHE14分别加入到含有不同浓度NaCl或KCl的pH9.0、50mMTris/HCl的缓冲 溶液中，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)在各自的温度下反应1～5min，405nm 测定酶活。结果说明，酯酶PHE14在0.5M的NaCl溶液反应酶活残余122.62％，当NaCl浓 度升到4M时，酯酶PHE14酶活力残余仍大于60％(图4A)；酯酶PHE14在0.2M的KCl 溶液反应酶活残余101.94％，当KCl浓度升到4M时，酯酶PHE14酶活力残余仍大于30％ (图4B)。说明酯酶PHE14是耐钠盐和钾盐的酯酶。
5.5金属离子抑制
以pH8.0、50mM的Tris/HCl缓冲溶液为溶剂配制如表3所示的不同金属离子溶液，每 种金属离子浓度均为1mM，将酯酶PHE14酶液在各种金属离子溶液中4℃下处理12h；以不 加金属离子的pH8.0、50mM的Tris/HCl缓冲溶液为对照(control)。再按照4.3中的测定方 法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定酶活，结果见表3，其中Cu2+、Ni2+、Zn2+对酯酶 PHE14酶活有明显的抑制作用，其它金属离子对酯酶PHE14活性均没有明显影响。
表3金属离子对酯酶PHE14酶活力的影响
5.6有机溶剂、变性剂和抑制剂对酯酶PHE14酶活性的影响
将酯酶PHE14加入到表4中的有机溶剂、变性剂和抑制剂中处理12h(对照为蒸馏水， 其他溶液的浓度为体积分数)，然后按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物) 测定酶活。结果表明有机溶剂除了正丁醇，其他大部分有机溶剂能极大地促进酯酶PHE14酶 活，最高达到136.18±4.48；表面活性剂Tween-20和三聚磷酸钠对酯酶PHE14的酶活具有促 进作用。
表4有机溶剂、变性剂和抑制剂对酯酶PHE14酶活性的影响
实施例6：酯酶PHE14在拆分(±)-乳酸甲酯中的应用
本法在水相中拆分(±)-乳酸甲酯。
1)在优化的条件下，即在0.5mL50mMpH9.0的Tris/HCl缓冲溶液中，加入20μL 0.368mg/mL的酯酶PHE14纯酶液，于30℃，200rpm条件下，拆分60mM的(±)-乳酸甲酯(图 5A)，在1.0h内可得到大于99％光学纯度的(S)-乳酸甲酯，转化率为50.61％(图5B)。
具体分析条件为：采用福立气相色谱仪，配有手性柱(30m×0.25mmCyclosilBchirl column)和氢离子火焰检测器。仪器分析条件设置为：注射器温度220℃，检测器温度250℃， 载气为N2，流速1.2mL/min，采用梯度升温进行分析：80℃保持1min，15℃/min，120℃保 持1min，10℃/min到220℃，保持1min。