技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种肉类成分四重PCR的检测方法及应用。
背景技术
随着生活水平的提高，人们对动物源性产品质量的安全意识也在不断增强。北京作为全国的政治文化中心和大型消费性城市，动物及动物产品安全不仅关系到人民群众的身体健康和生命安全，而且直接影响着首都的形象和我国的国际声誉。动物卫生监督作为国家动物卫生监督和管理部门，依照法律和法规要求，对动物防疫及动物产品安全实施监督检查和管理的活动，是一种政府管理的行政行为，目的在于发现、制止、纠正、处理违法行为。因此，建立简洁、快速、有效且适应动物卫生监督工作实际的快速鉴别检验技术，将有利于对食品进行动物源性成分鉴定，对加工肉制品的质量进行把关，有利于维护消费者利益，保障人民生命安全，为打击此类违法行为提供有力技术支撑，也有利于肉类及相关产业的健康发展。同时鉴别动物源性成分对于解决某些因食品问题引起的民族矛盾和纠纷都十分重要。
当前，北京地区乃至全国动物卫生监督管理实际中动物源性成份的检测仅可依靠传统感官鉴别，存在无法准确判定其实际成份的迫切需要和关键性技术问题。本研究针对当前北京地区某些市场上动物产品交易过程中以次充好、存在欺诈的现象，将着眼点放在动物源性肉类食品快速鉴别检验方法的建立和应用上，以猪肉、羊肉、牛肉、狗肉等动物源性肉类食品为研究对象，以分子生物学为基础，研究采用PCR特异性扩增检测手段，建立简洁、快速、有效且适应动物卫生监督工作实际的动物源性肉类食品快速鉴别检验方法。研究成果将为动物源性食品安全保障和质量监督提供有力技术支撑，具有一定市场推广应用价值。对保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展具有积极作用。
形态学、解剖学鉴定方法是以动物肉、骨骼、淋巴结的外剖形态特征为基础，通过观察动物肌肉色泽、嫩度、肌纤维形状；脂肪的色泽、肌间脂肪分布；固有气味；骨骼、淋巴结解剖特征等对动物肉类品种进行鉴别区分。理化学鉴定则主要包括脂肪熔点的测定、糖原测定反应；作为动物源性肉市场交易环节中重要的鉴别方法，形态学、解剖学及理化鉴定简便、易行，检测成本低。但是，形态学及解剖学鉴定主要依靠检测人员实践经验的积累，判定指标模糊，对于冻肉等经初加工的动物源性肉类凭感官鉴别确认难度较大。
以蛋白质为基础的检测方法主要有：免疫学方法和电泳学方法。免疫学技术是以抗原和抗体特异性结合反应为基础，再辅以免疫放大技术来鉴别动物源性成分种 类的方法。
酶联免疫的原理是抗体与抗原发生免疫反应，将酶分子与抗体分子结合形成酶标记分子。当它与固相免疫吸附剂中相应的抗原或抗体、或抗原抗体结合物相遇时形成酶抗原抗体结合物，加入酶底物，结合物中的酶水解底物，生成有色的反应物，根据颜色的深浅进行判断。利用抗原-抗体反应的特异性，进行成分的鉴别和血清学分型。目前商业使用的ELISA检测试剂盒主要用于肉类食品检验，利用肉类在热处理过程中具有热稳定性的肌钙蛋白I(TnI)作为区分动物种类的标记蛋白，从而可以区分蛋白来源，在肉类原料来源鉴别具有很好的效果。免疫技术简单、方便而且能够对微量的蛋白进行检测，ELISA需要分离品种特异性的蛋白，但品种接近的蛋白间能够发生交叉反应，甚至其它品种的微量蛋白常常能够掩盖品种特异性的条带，因此会产生假阳性结果。从20世纪90年代末至今，大量研究报道了应用免疫学方法对各种动物源性成分的鉴定技术，相应的酶联免疫分析(ELISA)试剂盒与免疫层析试纸条也已面世。商品化的ELISA试剂盒与免疫层析试纸条等免疫学鉴定技术具有检测时间短、操作简便等优势，但同时也存在着特异性较低、受样品基质影响大的局限。目前，尚未有一种商品化的免疫种属鉴定方法通过美国FDA或AOAC等权威机构的认证。
除免疫学方法外，根据蛋白质分布特征区分动物种属是动物源性肉本质鉴别的另一思路。利用高效液相色谱(HPLC)法检测检测脊椎动物组织中天然含有的组氨酸二肽、肌肽、鹅肌肽和蛇肉肽的分布特征，可有效地对反刍动物来源的肉制品进行鉴定。此外，通过十二磺基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管凝胶电泳(CE)和等电聚焦电泳(IEF)等电泳技术对肉制品提取物中的蛋白质分布特征进行定性、定量分析，从而鉴别肉类的方法也屡见报道。然而，动物源性肉中蛋白质含量变化范围广、干扰因素多，导致此类技术准确度低，易产生假阳性结果，标准化与推广应用的前景均受到很大局限。
分子生物学方法主要是利用DNA分析技术，根据基因组中的DNA序列来确定物种，并且对于经过热加工的食品仍能很好地区分动物来源。DNA的热稳定性与酸碱稳定性均优于蛋白质，以动物种属间遗传信息的差异作为物种鉴别的检测靶点具有特异性高、方法便捷、不受组织类别限制等诸多优势，已逐渐成为食品中肉类成分鉴别的主流方法。以检测DNA为基础的方法主要有：核酸探针杂交、限制性片段长度多态性扩增(PCR-RPLF)、DNA指纹分析、PCR特异扩增。近十多年来，聚合酶链式反应(PCR)技术的迅速发展为物种鉴别开辟了新的途径，逐步成为动物源性肉类种属鉴定的核心方法。其基本的实验思路为：根据不同物种细胞或线粒体基因组序列中的特征位点设计物种特异性引物，利用PCR反应实现食品中目标基因片段的指数级扩增，继而通过电泳或荧光检测鉴别食品中可能的物种来源。相较其他分析方法，PCR特异扩增法操作简便、准确、灵敏度高，因此在实际检测工作中应用最为广泛。但由于动物源性肉中DNA成分复杂，加之PCR技术的高灵敏度，使得应用PCR扩增方法来鉴定物种具有因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。此外，对于未知基因序列的物种，也难以应用上述的常规思路设计PCR鉴定流程。因此， 以PCR为基础、应用改良的引物设计策略或新型验证手段的鉴定方法已逐步成为了动物源性肉定性鉴别的新方向。
近红外方法(Near infrared spectroscopic method，NIBS)在饲料工业中广泛地用于饲料的质量控制分析，如对水分、蛋白、脂肪、灰分、糖、淀粉、纤维等的测定。该方法的原理是组成分析样品中的分子在不同电磁波的吸收不同。近红外方法的优点是快捷，使用中无有害物质，样品用量少，具有良好的可重复性。Murray等采用NIRS方法检测了含有3％、6％、9％肉骨粉的90种鱼粉，该项结果表明，NIRS能够区分出来自于两种不同动物的动物蛋白。但该方法的最大缺点是非直接的，因此需要大量具有权威性的标准样品以形成标准或判别模式。
超声波技术、电特性技术、光谱分析技术等是根据不同的工作原理对肉品质指标进行检测的，均具有无损、快速、实时、在线检测的能力，对它们的研究、开发、应用，能够极大地提高对肉类品质检测的准确度、效率、可靠性，节约成本，具有很大的实用推广价值和广阔的应用前景。但随着对这些技术的深入研究发现，上述各种检测技术在所检测具体肉品质各指标的能力上也是各有优劣，它们往往仅对肉类品质某一两项指标有较好的预测判别能力，对多种信息综合指标的评价能力还是不足的。
发明内容
鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种肉类成分四重PCR的检测方法及应用，本方案以现实应用为目标，建立准确、快速的多种肉类成分四重PCR检测技术。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种肉类成分四重PCR的检测方法，包括以下步骤：
1)依据猪、牛、羊、狗、鸭基因序列，自设可扩增的特异性条带引物，根据引物设计拟扩增目标长度，合理选择引物组合模式，建立四重PCR方法；检测各组引物有无扩增反应，且扩增产物是否为特异性四个条带；若为四个条带，检测是否符合设计目标长度；
2)取PCR反应产物5μL，用2％琼脂糖凝胶电泳20min，电压180v，置紫外凝胶成像系统中观察并拍照保存结果。
进一步地，该肉类成分四重PCR的检测方法具体是指猪、牛、羊、狗四重PCR的检测方法，或者，猪、鸭、牛、狗四重PCR的检测方法，或者，猪、牛、羊、鸭四重PCR的检测方法。
进一步地，PCR反应体系如下：ddH2O 9μL，2×EasyTaq PCR super Mix 25μL，上游引物1μL×4，下游引物1μL×4，组织DNA模板2μL×4，总体积50μL。
进一步地，PCR反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃终末延伸10min。
进一步地，猪、牛、羊、狗四重PCR的检测方法采用的引物组合为：上游引物如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19所示，下游引物如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20所示；或者，上游引物如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17所示，下游引物如 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20所示。
进一步地，猪、鸭、牛、狗四重PCR的检测方法采用的引物组合为：上游引物如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19所示，下游引物如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20所示；或者，上游引物如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19所示，下游引物如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20所示。
进一步地，猪、牛、羊、鸭四重PCR的检测方法采用的引物组合为：上游引物如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：27所示，下游引物如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：30所示。
本发明还公开了一种由上述的肉类成分四重PCR的检测方法在多种动物组织样本、涮肉片及调理生肉制品、卤肉制品、火腿肠类样本中肉类成分的鉴别检验中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)建立了猪、牛、羊、狗四重PCR方法；猪、鸭、牛、狗四重PCR方法，进一步完善了多种肉类成分多重PCR方法检测体系。
2)对71份市售不同类型肉类食品的检测结果表明，本研究所建立的方法-多种肉类成分多重PCR方法检测体系，适用于多种动物组织样本、涮肉片及调理生肉制品、卤肉制品、火腿肠类样本中肉类成分的鉴别检验，适用范围广、可靠性高。
3)应用建立的猪、牛、羊、狗四重PCR方法对市售71份实际样本进行检测，结果显示，市售食品中动物组织样本、卤肉制品未见掺假情况，合格率100％；肉类掺假情况多发生于涮肉片及调理生肉制品，掺假率为28.6％；火腿类制品与标识不符的情况突出，不合格率为69.6％。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明猪、牛、羊、狗的四重PCR特异性试验；其中，M:100bp DNA Ladder；2、7、12、17：猪；3、8、13、18：牛；4、9、14、19：羊；5、10、15、20：狗；1、6、11、16：猪+牛+羊+狗；
图2是本发明猪、鸭、牛、狗的四重PCR特异性试验；其中，M:100bp DNA Ladder；2、7、12：猪；3、8、13：鸭；4、9、14：牛；5、10、15：狗；1、6、11：猪+鸭+牛+狗；
图3是本发明猪、牛、羊、鸭的四重PCR特异性试验；其中，M：100bp DNALadder；2、7、12、17：猪；3、8、13、18：牛；4、9、14、19：羊；5、10、15、20：鸭；1、6、11、16：猪+牛+羊+鸭；
图4是本发明猪、牛、羊、狗四重PCR特异性的试验；其中，M:100bp DNA Ladder；1：猪+牛+羊+狗；2：猪；3：牛；4：羊；5：狗；6：鸭；7：鸡；10：阴性对照；11：0.1μg/μL；12：0.01μg/μL；13：0.001μg/μL；14：1×10-4μg/μL；15：1×10-5μg/μL；16：1×10-6μg/μL； 17：1×10-7μg/μL；18：1×10-8μg/μL；19：1×10-9μg/μL；20：H2O(阴性对照)；
图5是本发明猪、鸭、牛、狗四重PCR特异性的试验；其中，M：100bp DNA Ladder；1：猪+鸭+牛+狗；2：猪；3：鸭；4：牛；5：狗；6：羊；7：鸡；10：阴性对照；11：0.1μg/μL；12：0.01μg/μL；13：0.001μg/μL；14：1×10-4μg/μL；15：1×10-5μg/μL；16：1×10-6μg/μL；17：1×10-7μg/μL；18：1×10-8μg/μL；19：1×10-9μg/μL；20：H2O(阴性对照)；
图6是本发明样本的猪、鸭、牛、狗四重PCR鉴别检验试验(a)；其中，M:100bp DNA Ladder；1-21：实际检测样本；
图7是本发明样本的猪、鸭、牛、狗四重PCR鉴别检验试验(b)；其中，M:100bp DNA Ladder；36-55：实际检测样本；P：阳性对照；N：阴性对照；
图8是本发明样本的猪、鸭、牛、狗四重PCR鉴别检验试验(a)；其中，M:100bp DNA Ladder；22-33是实际检测样本；
图9是本发明样本的猪、鸭、牛、狗四重PCR鉴别检验试验(b)；其中，M:100bp DNA Ladder；56-71实际检测样本；P：阳性对照；N:阴性对照。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1四重PCR方法的建立
1材料及设备
1.1试验组织及材料
猪肉、牛肉、羊肉、狗肉、鸭肉，均购于超市及农产品批发市场。
1.2主要试剂
2×EasyTaq PCR superMix：购自北京全式金生物技术有限公司；100bp DNA Ladder：购自北京全式金生物技术有限公司；电泳上样缓冲液：购自北京全式金生物技术有限公司；电泳级琼脂糖购自琼脂糖：购自北京泰科兰博有限公司。
1.3试验所用溶液的配置
(1)0.01M PBS(pH7.4)：0.27gKH2PO4、1.42gNa2HPO4、8gNaCl、0.2gKCl加800ml蒸馏水充分搅拌溶解，再加适量浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
(2)50×TAE缓冲液：TRIS碱121g，冰乙酸28.55ml，0.5MEDTA(pH8.0)50ml加双蒸水混合，定容至500ml。工作液浓度为1×TAE
(3)2％琼脂糖凝胶：取2.0g琼脂糖加1×TAE100ml加热融化，待冷却至50-60℃时加入5μL核酸染料混匀，倒入模具制成琼脂糖凝胶。
(4)蛋白酶K(20mg/mL)：用灭菌的50mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1.5mmol/L乙酸钙溶解，配置成浓度为20mg/ml的溶液，分装-20℃保存。
(5)1M Tris-HCl(pH8.0)：121.1gTris碱溶于800mL水中加浓HCl调节pH值至8.0，定容至1L。
(6)EB(10mg/mL)储存液：将适量EB溶于蒸馏水中，稀释成10mg/mL，剧烈搅 拌，待完全溶解后，于室温避光保存。
1.4试剂盒
血液、组织、细胞基因组DNA提取试剂盒：购自TIANGEN公司，货号：DP304。
普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：购自TIANGEN公司，货号：DP209-02。
1.5试验设备与耗材
BS 124s电子天平：Sartorius公司产品；MLS-3020型高压灭菌锅：SANYO公司产品；-80℃超低温冰箱：海尔集团有限公司产品；HH-B11 600-S电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂产品；MilliQ超纯水仪：Milipore公司产品；SIM-F140制冰机：SANYO公司产品；台式离心机：Eppendorf公司产品；Centrifuge5810R低温高速冷冻离心机：Eppendorf公司产品；YJ-875SA医疗净化工作台：苏州净化设备公司产品；DDHZ-300多用途台式恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂产品；电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司产品；S1000型PCR仪：BIO-RAD公司产品；Gel Doc2000型凝胶成像仪：BIO-RAD公司产品；微量可调移液器(1mL、200μL、100μL、10μL)：Eppendorf公司产品。
1.6生物信息学分析软件
序列对比工具：ClustalX 2.0、Genedoc；序列下载工具：Lasergene 7.0；引物设计软件：Primer Premier 5.0；引物特异性评价工具：Oligo 7.0。
1.7引物合成及产物测序
引物合成由北京三博远志生物技术有限责任公司完成；产物测序由生工生物工程(上海)有限公司北京测序部完成。
2试验方法
2.1动物组织中总DNA的提取
分别使用TIANGEN公司血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒、SDS-蛋白酶K法提取猪肉组织、牛肉组织、羊肉组织、狗肉组织、鸡肉组织、鸭肉组织、马肉组织、驴肉组织、涮肉片中的总DNA。其中TIANGEN公司血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒法，按照说明书操作；SDS-蛋白酶K法参照《分子克隆》第三版；SDS-蛋白酶K法使用酚/氯仿抽提进行核酸纯化。1g样品的总DNA溶解于200μL TE缓冲液中，测定OD260、OD280吸光度值，计算DNA浓度和纯度。
2.1.1试剂盒提取法
参照TIANGEN公司血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。
2.1.2SDS-蛋白酶K法提取法
(1)组织经pH 7.2PBS匀浆后，反复冻融三次，然后10,000rpm离心10min，取上清。
(2)取250μL上清，加入250μL组织裂解液与10μL蛋白酶K，50℃消化2h，加入等体积的饱和酚，剧烈振荡，12,000rpm离心10min。
(3)取上层水相转入一个干净离心管中与等体积的有机混合液(酚：氯仿：异戊醇：体积比为25:24:1)混匀后，12，000rpm离心10min。
(4)取上层水相加2倍体积预冷无水乙醇(-20℃)并加入10％体积的NaAC(3mol/L)，放入-20℃沉淀2h。
(5)12，000rpm离心15min，弃上清液，加入70％乙醇1mL。
(6)8500rpm离心5min，弃上清液，室温风干。
(7)加入25mL TE缓冲液，产物储存于-80℃备用。
2.2目的基因的筛选
本试验主要参考国家标准及相关参考文献，同时查看基因的同源性，筛选猪、牛、羊、
狗、鸭高度保守的线粒体基因作为候选目的基因。
2.3引物的设计与合成
从NCBI网站(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes)下载猪(登录号：KF472178.1)、牛(登录号：KF163094.1)、狗(登录号：JF342863.1)、鸭(登录号：EU755252.1)的线粒体完整基因组，再通过ClustalX 2.0、Genedoc软件获得目的基因的序列。再用Primer premier5.0软件设计PCR引物，采用200bp、300bp、450bp、600bp为目标长度，每种动物设计一条共用下游引物，四条特异性上游引物，筛选无措配、无发夹结构、无引物二聚体的引物对，同时初步评价引物的特异性。由北京三博远志生物技术有限责任公司完成引物合成。引物序列与扩增片段大小见表1。
表1引物信息表
2.4多种动物四重PCR方法的建立
2.4.1猪、牛、羊、狗四重PCR方法的建立
依据自设猪、牛、羊、狗自设引物特异性条带位置，根据200bp、300bp、450bp、600bp的自设目标长度，合理选择引物组合模式，建立四重PCR方法，检测各组引物有无扩增反应且扩增产物是否为特异性四重条带；若为四重条带是否符合设计目标长度；
反应体系(μL)：
94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃终末延伸10min。取PCR反应产物5μL，用2％琼脂糖凝胶电泳20min(电压180V)，至紫外凝胶成像系统中观察并拍照保存结果。重复上述试验2次，设立对应动物组织DNA做模板的阳性对照。
2.4.2猪、鸭、牛、狗四重PCR方法的建立
根据猪、鸭、牛、狗自设引物特异性条带位置，合理选择引物组合模式，建立猪、鸭、牛、狗四重PCR，方法参照2.4.1。
2.4.3猪、牛、羊、鸭四重PCR方法的建立
根据猪、牛、羊、鸭自设引物特异性条带位置，合理选择引物组合模式，建立猪、牛、羊、鸭四重PCR，方法见2.4.1。
2.5方法评价
选择猪、牛、羊、狗四重PCR方法和猪、牛、狗、鸭四重PCR中的优秀引物组合作为待选方法验证自设引物组合的特异性、灵敏度。同时，对扩增产物电泳后割胶回收纯化、鉴定，并委托测序。测序结果与GenBank上的已知序列进行比对。
2.5.1特异性试验
使用已知牛、羊、猪、狗、鸭阳性肉类DNA为模板，对建立、优化的猪、牛、羊、狗四重PCR方法和猪、鸭、牛、狗四重PCR方法；参照2.4.1的反应体系和扩增条件进行四重PCR，以判定方法的特异性。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，至紫外凝胶成像系统中观察并拍照保存结果。
2.5.2检测灵敏度试验
使用已知猪、牛、羊、狗、鸭肉类DNA，于OD260/280测定吸光度值，计算DNA浓度，将DNA模板调整为0.1μg/μL(2.01×1011copies/μL)，然后对所得DNA进行10倍倍比稀释，得到9个稀释度样品。参照2.4.1的反应体系和扩增条件进行四重PCR，以判定方法的检测 下限。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，至紫外凝胶成像系统中观察并拍照保存结果。
2.6PCR产物回收及测序
2.7.1PCR产物的回收
参照TIANGEN公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行操作。
2.7.2PCR产物的测序
将回收的PCR产物，送生工生物工程(上海)有限公司北京测序部进行测序，测序结果与GenBank上的已知序列进行比对，对建立的双重PCR方法进行验证。
3试验结果
3.1多种动物四重PCR方法的建立
3.1.1猪、牛、羊、狗四重PCR方法的建立
依据猪、牛、羊、狗自设引物扩增条带位置选择引物组合模式，见表2(a)和表2(b)。以猪、牛、羊、狗肌肉组织提取的DNA为模板进行扩增，由图1可见，1、6可观察到明亮的特异性条带，选其为后续试验组合。同时，以人为制成的生鲜肉四种混合物提取的DNA为模板扩增，与DNA四重混合物为模板的PCR结果相同。因此在后续试验中，将以DNA混合物为模板进行四重PCR方法的建立。
表2(a)猪、牛、羊、狗四重PCR引物组合
表2(b)猪、牛、羊、狗四重PCR引物组合
3.1.2猪、鸭、牛、狗四重PCR方法的建立
依据猪、鸭、牛、狗自设引物扩增条带位置选择引物组合模式，见表3(a)和表3(b)。以猪、鸭、牛、狗肌肉组织提取的DNA为模板进行扩增，由图2可见，1、11观察到明亮的特异性条带，6可观察到较暗的特异性条带，选1、11为后续试验组合，6为备选组合。
表3(a)猪、鸭、牛、狗四重PCR引物组合
表3(b)猪、鸭、牛、狗四重PCR引物组合
3.1.3猪、牛、羊、鸭四重PCR方法的建立
依据猪、牛、羊、鸭自设引物扩增条带位置选择引物组合模式，见表4(a)和表4(b)。以猪、牛、羊、鸭肌肉组织提取的DNA为模板进行扩增，由图3可见，1观察到明亮的特异性条带，选1为后续试验组合。
表4(a)猪、牛、羊、鸭四重PCR引物组合
表4(b)猪、牛、羊、鸭四重PCR引物组合
3.2方法评价
综合试验中的四重PCR方法建立及快速检验实际应用需求，选择猪、牛、羊、狗四重PCR方法中的1为待选方法；猪、鸭、牛、狗四重PCR方法中的11为待选方法，验证自设引物组合的特异性(引物组合见表2(a)、表2(b)、表3(a)、表3(b))。同时，对扩增产物回收纯化、鉴定，并委托生工生物工程(上海)有限公司北京测序部测序。测序结果与GenBank上的已知序列进行比对。
3.2.1猪、牛、羊、狗四重PCR方法的特异性及灵敏度
特异性试验中，使用建立的优化的四重PCR方法对牛、羊、猪、狗、鸭、目标肉类DNA进行扩增，由(图4)可见在1处可同时观察到猪、牛、羊和狗四条特异性条带，在2处可观察到猪的特异性条带、在3处可观察到牛的特异性条带。在4处可观察到羊的特异性条带、在5处可观察到狗的特异性条带，鸭、鸡、马、驴处未见特异性条带。
灵敏度试验中，将0.1μg/μL的样本肉类DNA 10倍梯度稀释，可见目标DNA在稀释 到0.01μg/μL后，使用PCR检测方法进行检测，可观察到特异性扩增，在0.001μg/μL处未见特异性条带，方法灵敏度确定为0.01μg/μL，结果见(图4)。
3.2.2猪、鸭、牛、狗四重PCR方法的特异性及灵敏度
特异性试验中，使用建立的优化的四重PCR方法对牛、羊、猪、狗、鸭、目标肉类DNA进行扩增，由(图5)在1处可同时观察到猪、鸭、牛和狗四条特异性条带，在2处可观察到猪的特异性条带、在3处可观察到鸭的特异性条带。在4处可观察到牛的特异性条带、在5处可观察到狗的特异性条带，羊、鸡、马、驴处未见特异性条带。
灵敏度试验中，将0.1μg/μL的样本肉类DNA 10倍梯度稀释，可见目标DNA在稀释到0.01μg/μL后，使用PCR检测方法进行检测，可观察到特异性扩增，在0.001μg/μL处未见特异性条带，方法灵敏度确定为0.01μg/μL，结果见图5。
3.3PCR产物回收及测序
3.3.1猪、牛、羊、狗四重PCR方法测序鉴定
目的片段经胶回收，送生工生物工程(上海)有限公司北京测序部进行测序，得到如下序列(SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:34)测序结果与GenBank上的已知序列进行比对，与预期结果相符。
3.3.2猪、鸭、牛、狗四重PCR产物测序
目的片段经胶回收，送生工生物工程(上海)有限公司北京测序部进行测序，得到如下序列(SEQ ID NO:35-SEQ ID NO:38)。测序结果与GenBank上的已知序列进行比对后，同源性为100％。
4讨论
4.1多种动物四重PCR方法的建立
本试验分别建立的猪、牛、羊、狗四重PCR方法；猪、鸭、牛、狗四重PCR方法；猪、牛、羊、鸭四重PCR方法；并综合考虑现实需求、已建立的双重PCR方法、三重PCR方法，对猪、牛、羊、狗四重PCR方法，猪、鸭、牛、狗四重PCR方法进行了系统的方法评价。所建立的3种多种动物四重PCR方法均可作为肉类成分特异性鉴定的试验依据。四重PCR方法引物组合汇总见(表5)。
表5四重PCR方法引物组合汇总
4.5小结
建立了猪、牛、羊、狗四重PCR方法；猪、鸭、牛、狗四重PCR方法；猪、牛、羊、鸭四重PCR方法；所建立的四重PCR方法均具有较好的特异性，检测灵敏度为0.01μg/μL。
实施例2四重PCR方法的应用
1材料及设备
1.1试验组织及材料
猪肉及其他组织(心脏组织、肠道组织、脑组织、肝脏组织、肾脏组织、骨组织)、牛肉、羊肉、狗肉、鸡肉、鸭肉、涮肉片及调理生肉制品、卤肉制品、火腿肠类制品等，均购于北京超市及农产品批发市场。
1.2主要试剂
详见实施例1中的1.2。
1.3试验所用溶液的配置
详见实施例1中的1.3。
1.4试剂盒
详见实施例1中的1.4。
1.5试验设备与耗材
详见实施例1中的1.5。
1.6生物信息学分析软件
详见实施例1中的1.6。
1.7引物合成及产物测序
详见实施例1中的1.7。
2试验方法
2.1动物组织中总DNA的提取
详见实施例1中的2.1。
2.2引物的设计与合成
详见实施例1中的2.3。
2.3市售样本的检测
采用2.1.1的方法对71份(动物组织样本19份、涮肉片及调理生肉制品样本14份、卤肉制品样本15份、火腿肠类样本23份)市售动物源性制品样本进行核酸提取，运用所建立的多种肉类成分多重PCR方法进行检测。对猪的肌肉组织、心脏组织、肠道组织、脑组织、肝脏组织、肾脏组织、骨组织进行检测，以验证所建立方法的特异性和适用性；对涮肉片及调理生肉制品进行检测以检测市售涮肉片及调理生肉制品的掺假率；对卤肉制品及火腿肠类制品进行检测，以检测市售卤肉制品及火腿肠类制品标签标识合格率。
2.3.1猪、牛、羊、狗四重PCR方法的应用
依据所建立的猪、牛、羊、狗四重PCR方法，引物选择为：18+24+27+46+21+26+33+47，反应体系(μL)：
94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃ 终末延伸7min。
取PCR产物5μL反应产物，用2％琼脂糖凝胶电泳20min(电压180V)，至紫外凝胶成像系统中观察并拍照保存结果。每组试验设立对应动物组织DNA做模板的阳性对照，以及水为模板的阴性对照。
2.3.2猪、鸭、牛、狗四重PCR方法的应用
依据所建立的猪、鸭、牛、狗四重PCR方法，引物选择为：19+54+22+46+21+57+26+47。反应体系(μL)：
94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃终末延伸10min。
取PCR反应产物5μL，用2％琼脂糖凝胶电泳20min(电压180V)，至紫外凝胶成像系统中观察并拍照保存结果。每组试验设立对应动物组织DNA做模板的阳性对照，以及水为模板的阴性对照。
3结果
3.1市售样本的采集
参考中华人民共和国农业行业标准(NY/T763-2004)猪肉、猪肝、猪尿抽样方法，中华人民共和国农业行业标准(NY/T5344.6-2006)无公害食品产品抽样规范，第6部分：畜禽产品方法，于北京几大批发市场，随机采集来自13个动物产品屠宰加工企业19份动物组织样本；5个动物产品生产厂家的6份涮肉片样本，无生产厂家的6份涮肉片样本；2个厂家生产的2种调理生肉制品。北京几家超市随机采集来自9个食品加工企业的15种卤肉类制品，以及来自14个食品加工企业的23种火腿肠类动物制品。
3.2市售样本的鉴别检测结果
使用上述建立的猪、牛、羊、狗四重PCR检测方法及猪、鸭、牛、狗四重PCR检测方法对市售71份动物源性制品样本进行了肉类的鉴别检验，样本的鉴别检测结果见图6-图9。
21份猪组织样本中，肌肉组织、心脏、肠道、脑、肝脏、肾脏、骨组织的四重PCR检测均出现特异性条带，检出率为100％。
在检测的14份涮肉片及调理生肉制品样本中，包括涮肉片样本8个(无生产厂家样本6个，有生产厂家样本2个)，肥牛片样本2个(生产厂家2个)，羊肉片样本2个(生产厂家2个)，羊肉串样本1个、骨肉相连样本1个(生产厂家2个)，全部14个样品中，13份样本出现特异性条带，涮肉片样本未表现明显特异性，检出率为92.57％，采用建立 的四重PCR检测方法，对涮肉片及调理生肉制品样本进行特异性鉴别检验。
在检测的15份卤肉制品样本中，包括牛肉(熟)、培根、烤肉、酱肘、梅花肉、盐水鸭、酱狗肉等(生产厂家9个)，15份样本均出现特异性条带，检测特异性率在100％，卤肉制品可作为采集验证的样本。
3.2.4市售肉类食品成分的鉴定
19份动物组织样本鉴别检测中，未出现非目标特异性结果，未见掺假情况，合格率100％。
14份涮肉片样本及调理生肉制品鉴别检测中，1个涮肉片样品，经营者认定肥牛片样本未检出牛肉成分，1个涮肉片样本未检出牛肉、羊肉成分，1个涮肉片号样本检出含有牛、猪、鸭成分，1个羊肉串样品未检出羊肉成分，掺假率为28.6％，合格率为71.4％。
15份卤肉制品样本鉴别检测中，未检出非目标特异性结果，未见掺假情况，合格率100％。
23份火腿类样本标签标识均为混合动物制品，其中标识含有猪源成分18种，鉴别检验出猪肉成分样本6个，合格率为33％；标识含有牛源成分2种，鉴别检验出牛肉成分样本1个，合格率为50％；
肉类掺假情况多发生于涮肉片中，掺假率为28.6％。火腿类制品与标识不符的情况突出，合格率为30.4％。
4讨论
4.1多种肉类成分多重PCR方法检测体系的现实应用
本研究所建立的多种肉类成分多重PCR方法检测体系适用于多种动物组织样本、涮肉片及调理生肉制品、卤肉制品、火腿肠类样本中肉类成分的鉴别检验，引物汇总见(表6)。本研究选择猪、牛、羊、狗四重PCR方法；猪、鸭、牛、狗四重PCR方法组成多种肉类成分多重PCR方法检测体系，重点考虑了动物源性食品安全监管的实际需求，各有侧重，相互印证，形成体系，以期提升所建立方法的综合效率、准确性、稳定性和可重复性、为动物源性食品流通领域监督执法提供确证和技术支撑。
肉类制品的掺假本质上是由于利益的相关驱动，多存在于一种廉价肉类代替或掺入另一种价格较高的肉类中混合出售，或将禁止出售的未经检疫的、淘汰的种畜禽经过加工处理，作为其他动物产品进行出售或以次充好。
4.1.1猪、牛、羊、狗四重PCR方法
将动物源性食品中消费量最大的猪、牛、羊三类动物制品来源进行有机组合，同时加入有较高社会关注度的狗源性动物产品检测。通过该方法实现猪、牛、羊、狗源动物产品同批次鉴别检验，可有效查证打击以淘汰种母猪肉冒充牛肉，以淘汰小公牛肉冒充羊肉，以狗肉冒充羊肉的违法行为。同时，可作为羊肉片、牛肉片、涮肉片、调理生肉制品(羊肉串)等动物源性产品鉴别检验中牛、羊源性的确证检验。
4.1.2猪、鸭、牛、狗四重PCR方法
猪、鸭、牛、狗四重PCR方法的建立是以羊肉片、肥牛片、涮肉片、调理生肉制品(羊肉串、猪肾脏、狗肾脏)等动物源性制品的鉴别检验和确证需求为基础。通过该方法可有效实现对冒充羊肉片、羊肉串及羊肉制品的鉴别检验，对各种冒充羊源性制品的违法 行为实现有效查证打击。同时有效实现对肥牛片及牛肉制品的确证检验，多重PCR方法引物组合汇总如表6所示。
表6多重PCR方法引物组合汇总
5小结
应用建立的多种肉类成分多重PCR方法检测体系验证市售肉类食品的成分，结果显示，市售食品中动物组织样本、卤肉制品未见掺假情况，合格率100％；肉类掺假情况多发生于涮肉片及调理生肉制品，掺假率为28.6％；火腿类制品与标识不符的情况突出，不合格率为69.6％。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施案例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。