技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种含有马唐的丝状真菌液体发酵培 养基及其制备方法。
背景技术
丝状真菌(Filamentousfungi)在生活中无处不在，是一类能形成分枝繁茂肉眼 可见的菌丝体，可以通过无性孢子，例如分生孢子和厚垣孢子进行性无性繁殖的一类重要 的微生物。丝状真菌涵盖面广，与农业、工业和医药等多个领域存在这广泛的联系。例如，一 些优良菌株被广泛应用于工业生产生物酶、生物激素和有机酸等物质；农业中许多作物的 病害都由丝状真菌的侵染造成，如小麦赤霉病；同时，多种丝状真菌被筛选出来用于生物防 治领域，例如对植物病虫草害的生物防治等。同时由于丝状真菌的广泛代表性，往往会被筛 选出来作为“模式生物”进行广泛研究，例如稻瘟菌，粗糙脉孢菌等。因此，对于丝状真菌高 效培养基的筛选对于该类真菌的研究和开发具有重要意义。
获得无性孢子或次级代谢产物是大多数丝状真菌发酵的最终目的，而这一过程伴 随着大量液体培养基的使用。到目前为止，许多研究人员开展了液体发酵过程的生物学和 工程学影响因素方面的研究；同时也有部分研究人员致力于新型高效液体发酵培养基的筛 选工作。低廉的原料成本是发酵培养基的应用的重要基础。目前，对于丝状真菌液体发酵培 养基原料的研究主要以粮食作物，例如小麦、玉米、大豆和马铃薯等为应用原料，或以化学 试剂为主要原料，例如葡萄糖、蛋白胨和酵母浸粉等。截至目前为止，对以田间杂草为原料 的发酵培养基研究则少之又少。
我国田间杂草资源丰富，但是利用率却很低。在经过了初期的化学防治之后，剩余 的杂草多被浪费在田间地头。这对于含有大量生物质资源的杂草群体来说，无疑是巨大的 浪费。因此，研究以杂草为基础的微生物发酵培养基，最大化的开发杂草资源，较少浪费，对 于优化微生物培养基组成，降低配制成本都有重要的意义。
发明内容
本发明目的是针对现有培养基的缺点，提供了一种适用于丝状真菌液体发酵培养 的优良培养基，采用该培养基能够快速有效的得到大量丝状真菌发酵产物。本发明降低了 丝状真菌发酵培养成本，通过在培养基中添加田间常见杂草，研究出广泛用于丝状真菌液 体发酵的优良培养基。
本发明采用了如下技术方案：
一种含有马唐的丝状真菌液体发酵培养基，配制1000ml培养基的配方如下：马唐50g- 150g，玉米茎叶5g-15g、葡萄糖1.0g、蛋白胨1.0g和磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水加至1000ml，调 节pH为6.0-8.0。
优选的，马唐50g，玉米茎叶10g。
优选的，pH为6.0。
一种含有马唐的丝状真菌液体发酵培养基的制备方法为：
将马唐去除根部洗净，玉米茎叶洗净，进行人工切碎，茎叶片段小于5厘米，加入蒸馏 水，煮沸25-35分钟，纱布过滤，收集过滤后所获得汁液；
加入葡萄糖，酵母提取物，磷酸二氢钾；
加蒸馏水，调节pH，定容；
将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
一种含有马唐的丝状真菌液体发酵培养基的应用：将培养基倒入培养瓶，培养温 度为22-31℃，通过液体摇瓶小量培养法培养4-7天。
优选的，培养温度为25℃。
优选的，培养时间为7天。
一种含有马唐的丝状真菌液体发酵培养基的应用：适用于稻瘟菌、胶孢炭疽菌、厚 垣孢镰刀菌等丝状真菌菌株。
本发明的有益之处是：
1.以田间杂草为基础材料，原材料极易获得，达到了废物利用的目的；
2.配方简单，成本便宜；
3.配制方法简便，操作简便，不需要特殊设备；
4.本培养基以杂草马唐和玉米茎叶为主要原料，对培养温度要求低，能够用于较宽温 度跨度的培养条件；
5.本培养基可被广泛应用于多种丝状真菌的培养；
6.真菌培养效果优良，采用该培养基能够快速、大量的培养制备所培养真菌的菌丝体 和分生孢子。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不应解释为局限于这些 实施例。
本发明中实施例中具体用到的丝状真菌菌株包括：F1：稻瘟菌；F2：胶孢炭疽菌； F3：厚垣孢镰刀菌。
丝状真菌培养方法为：PDA培养基活化保存的真菌菌株，5天后，选取生长一致的 菌落，打取直径为5mm的菌饼，接种到100ml各供试培养基内（500ml培养瓶）。将接种菌块的 培养基放置到培养箱内，并将培养条件设定为，180rpm，25℃，黑暗培养。
观察方法为：自第3天开始，每天取出3瓶液体摇培后的菌体，摇均后吸取一定量液 体，血球计数板技术孢子数量；双层纱布过滤收集菌丝，80℃烘箱烘烤6小时后称量菌丝干 重，统计菌丝量。
实施例1本发明所提供培养基的配制
取50g马唐和10g玉米茎叶，对材料进行人工切碎，切碎至茎叶片段小于5厘米，沸水煮 30分钟，纱布过滤得到汁液。液体中加入葡萄糖1.0g、蛋白胨0.5g和磷酸二氢钾0.5g，溶 解后定容至1升，并将pH值调节到6.0。将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭 菌20分钟，灭菌后备用。根据组成成分，将该培养基定名为马唐葡萄糖培养基（DDP）。
实施例2本发明所提供培养基与其它常用真菌培养基的培养效果对比
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：土豆200g，人工切成约2×2厘米的土豆块，沸水煮30分 钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，并定容至1000ml。 将定容后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
胡萝卜培养基（CA）：胡萝卜200g，人工切成约2×2厘米的胡萝卜块，沸水煮30分钟， 纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g琼脂，并定容至1000ml。将定容后的溶液 于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
葡糖糖蛋白胨培养基（DPA）：葡糖糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml；将定容 后的溶液于121℃，1.05×105Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。
表1本发明所提供培养基与其它常用真菌培养基的培养效果对比
培养基 DDP PDA CA DPA 菌丝（g） 6.8±0.1a 7.2±0.5a 6.9±0.3a 6.1±0.2b 产孢量(108/ml) 29.4±1.5a 11.9±4.2b 4.2±0.7c 0.9±0.1d
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上 差异显著。
本研究中所选用的真菌为厚垣孢镰刀菌，液体摇培9天后的产菌丝和分生孢子量。 综合菌丝产量和分生孢子产量的上分析结果，可以得到本发明所提供的培养基（DDP）显著 优于其它目前在真菌培养中应用比较广泛的培养基。
实施例3本发明中培养基配方的优化
以本发明所提供的培养基为基础，采用正交设计，对培养基内的材料马唐和玉米茎叶 含量进行梯度筛选，在保证对菌株高效培养前提下尽量降低所用材料量，降低成本。具体配 比见表2。对不同配比下丝状真菌生长情况进行测定。
表2多因素的正交设计表
试验 马唐（g） 玉米茎叶（g） 1 50 5 2 50 10 3 50 15 4 100 5 5 100 10 6 100 15 7 150 5 8 150 10 9 150 15
根据多因素的交叉设计，参考其他丝状真菌发酵研究因素，本实施例共设计9组处理， 每组处理同时开展3个重复。
表3不同实验配比下真菌菌丝体和分生孢子产量结果
试验 菌丝（g） 分生孢子（108/ml） 1 6.2±0.3c 16.1±0.7b 2 6.6±0.1ab 22.1±1.1a 3 6.3±0.3b 20.3±1.9a 3 --> 4 6.2±0.1b 16.3±3.5b 5 7.0±0.2a 22.6±3.9a 6 6.9±0.3a 21.6±2.3a 7 6.7±0.4a 22.1±2.9a 8 7.1±0.1a 19.8±3.6a 9 7.0±0.3a 22.4±1.9a
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差 异显著。
对所得的数据用SPSS软件进行方差分析。通过对本发明所提供的培养基（DDP）内 各配方进行对比，并根据不同对比下所培养真菌的菌丝和分生孢子产生量，可以得出，本发 明所提供培养基内杂草马唐的含量对菌丝和分生孢子产量构成主要影响，而当马唐含量达 到50g及以上时，真菌培养效果较佳；玉米茎叶的影响相对于马唐较小，但是任然对真菌生 长和分生孢子产量构成影响，在综合分析下，优选马唐含量为50g和玉米茎叶10g每升的配 方。
实施例4液体发酵培养基中pH优化实验
参照实施例1中培养基的配制方法，待培养基配置成功后，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液 调节培养基pH值，并设置4、5、6、7、8、9、10等7组pH梯度。每组进行3次重复试验处理。
表4：不同pH下液体发酵培养基中培养差异
pH 菌丝（g） 分生孢子（108/ml） 4 0.3±0.1e 0.09±0.01e 5 2.9±0.2c 0.7±0.1c 6 6.8±0.4a 19.7±2.9a 7 7.2±0.3a 18.9±3.3a 8 7.1±0.4a 20.6±1.8a 9 3.9±0.1b 4.6±0.6b 10 0.9±0.2d 0.4±0.08d
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差 异显著。
综合以上分析结果（表4），可见本发明所提供培养基的最佳培养pH范围为6-8，考 虑到较低的pH值对于液体发酵过程中的抑制细菌污染有重要作用，因此，本发明中的推荐 pH值为6.0。
实施例5液体发酵培养过程中温度的选择
参照实施例1中培养基的配制方法，在液体摇培过程中分别设置了16、19、22、25、28、31 和34℃等7个温度梯度。每组进行3次重复试验处理，。
表5：不同pH下液体发酵培养基中培养差异
温度（℃） 菌丝（g） 分生孢子（108/ml） 16 1.9±0.1e 3.6±0.7d 19 3.9±0.2c 3.9±1.0d 22 6.3±0.4a 10.7±1.1c 4 --> 25 7.4±0.3a 20.2±1.3a 28 7.1±0.4a 19.4±2.8a 31 7.2±0.1b 20.7±0.5a 34 6.3±0.2d 16.4±0.8b
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差 异显著。
综合以上分析结果（表5），可见本发明所提供培养基的适宜培养温度范围为22-31 ℃，综合考虑产菌丝和分生孢子量，并考虑到较低的温度培养对于液体发酵过程中的降低 成本有重要作用，因此，本发明中的最佳培养温度为25℃。
实施例6液体发酵培养过程中发酵时间与真菌产物量的关系
参照实施例1中培养基的配制方法，在液体摇培过程中分别于第3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12天取3个培养瓶，双层纱布过滤收集菌丝体。
表6：不同pH下液体发酵培养基中培养差异
培养时间（天） 菌丝（g） 3 0.7±0.2f 4 2.0±0.3e 5 3.5±0.3d 6 5.6±0.8c 7 7.7±0.6b 8 7.7±0.7b 9 7.9±0.5b 10 8.1±0.6a 11 8.0±0.2a 12 8.3±0.2a
注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差 异显著。
综合以上分析结果（表6），可得所培养菌株的对数生长期开始于第4天，持续在第 4-7天，结束于发酵起始后的第8天。
实施例7多种丝状真菌在本发明培养基中的培养情况
以筛选得到的最优配方为依据，参照实施例1的方法配置本发明所提供培养基。检测各 种丝状真菌（F1：稻瘟菌;F2：胶孢炭疽菌;F3：厚垣孢镰刀菌）在本发明所提供培养基内的生 长速率和分生孢子产量。
表7不同菌株在本发明培养基上的生长速率
菌株 稻瘟菌 胶孢炭疽菌 厚垣孢镰刀菌 菌丝重量（g） 6.1±0.2 4.2±0.1 7.5±0.7 产孢量(108) 6.7±1.2 186.4±11.3 25.1±4.7
综合以上分析结果，3中被测试丝状真菌在本发明所提的培养基内均生长迅速，并产生 大量分生孢子。这也说明，本发明所提供的培养基是一种可被广泛应用于丝状真菌培养的 液体发酵培养基。