《吡喃酮phomoneD及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《吡喃酮phomoneD及其制备方法和应用.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710260475.8 (22)申请日 2017.04.20 (83)生物保藏信息 CGMCC No.13200 2016.12.21 (71)申请人 沈阳药科大学 地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路 103号 (72)发明人 裴月湖桑夏楠陈刚王海峰 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 靳玲 (51)Int.Cl. C07D 309/36(2006.01) C12P 17/06(2006.01) A61K 31/366(200。
2、6.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 -吡喃酮phomoneD及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明属于医药技术领域， 涉及新的-吡 喃酮phomoneD及其制备方法和在制备治疗癌症 药物中的应用。 本发明以体外抗肿瘤实验模型， 采用HL-60、 PC3、 HCT116细胞模型考察phomoneD 对三种肿瘤细胞生长抑制作用情况， 结果显示 phomoneD能够有效地三种肿瘤细胞的生长， 且 具有较低的用药剂量。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 107176937 A 。
3、2017.09.19 CN 107176937 A 1.具有如下结构的 -吡喃酮phomone D： 2.一种权利要求1所述的 -吡喃酮phomone D的制备方法， 其特征在于： 该方法包括如 下步骤： (1)植物内生真菌Phoma sp.YN02-P-3的大米培养基培养后用溶剂提取， 回收溶剂得粗 提物； (2)步骤(1)所得粗提物经水扩散后， 使用乙酸乙酯进行萃取得到乙酸乙酯层浸膏； (3)步骤(2)所得乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱法分离， 以石油醚和乙酸乙酯混合溶 剂， 或石油醚和丙酮混合溶剂为洗脱溶剂梯度洗脱； (4)上述步骤(3)中所得馏分经重结晶后， 得到phomone D。 3.。
4、按照权利要求2所述的 -吡喃酮phomone D的制备方法， 其特征在于： 所述植物内生真菌Phoma sp .YN02-P-3是从云南西双版纳植物园中植物缅桐 (Sumbaviopsis J.J.Smith)的叶片中分离得到的。 4.按照权利要求2所述的 -吡喃酮phomone D的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)中所述 的提取方法为超声提取13次， 所用溶剂为95乙醇、 甲醇、 乙酸乙酯、 丙酮中的一种， 溶剂 体积为植物内生真菌Phoma sp.YN02-P-3的大米培养基重量的2-5倍。 5.按照权利要求2所述的 -吡喃酮phomone D的制备方法， 其特征在于： 步骤(3)中所。
5、述 洗脱剂中， 石油醚和乙酸乙酯混合溶剂， 或石油醚和丙酮混合溶剂的体积比例为100： 1-1： 1。 6.按照权利要求2所述的 -吡喃酮phomone D的制备方法， 其特征在于： 步骤(4)中所述 重结晶的馏分为洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯混合溶剂， 或石油醚和丙酮混合溶剂的体积比 例为100： 10-100： 30洗脱的流分。 7.按照权利要求2所述的 -吡喃酮phomone D的制备方法， 其特征在于： 步骤(4)的重结 晶溶剂为： 甲醇。 8.一种药物组合物， 包含权利要求1所述的 -吡喃酮phomone D或药学上可接受的载 体。 9.权利要求1所述的 -吡喃酮phomone D或权利。
6、要求8所述的药物组合物在制备预防或 治疗癌症药物中的应用。 10.按照权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述的癌症为白血病、 胰腺癌或结肠癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107176937 A 2 -吡喃酮phomone D及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及 -吡喃酮phomone D及其制备方法和应用。 背景技术 0002 植物内生菌具有独特的生存环境与生存方式， 使其能够产生结构多样的活性物 质， 且部分植物内生菌能够产生于寄主植物结构完全不同的新颖天然化合物， 因而作为药 物先导化合物的重要来源逐步受到人们的广泛关注。 本发明所得结构新。
7、颖的 -吡喃酮类成 分来自缅桐的植物内生菌。 缅桐为产自印度东部， 缅甸， 我国云南等地的灌木或者乔木植 物。 所得化合物phomone D具有新颖的结构和很强的抗肿瘤活性， 将为日益增加的肿瘤创新 药物的市场需求提供一个可行的候选方案。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供结构新颖化合物 -吡喃酮phomone D及其制备方法和医药 用途。 0004 本发明提供了新的 -吡喃酮， 其具有如下结构： 0005 0006 本发明还提供了所述新的 -吡喃酮phomone D的制备方法， 该方法包括如下步骤： 0007 (1)植物内生真菌Phoma sp.YN02-P-3(CGMCC:13200。
8、)的大米培养基培养30天后用 溶剂提取， 回收溶剂得粗提物； 0008 (2)步骤(1)所得粗提物经水扩散后， 使用乙酸乙酯进行萃取得到乙酸乙酯层浸 膏； 0009 (3)步骤(2)所得粗提物经硅胶柱色谱法分离， 以洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯混合 溶剂， 或石油醚和丙酮混合溶剂梯度洗脱； 0010 (4)上述步骤(3)中所得馏分经过重结晶得到phomone D。 0011 本发明提供的所述新的phomone D的制备方法中， 0012 步骤(1)中的培养方法为静置培养； 0013 所述溶剂为： 95乙醇、 甲醇、 乙酸乙酯、 丙酮中的一种； 溶剂体积为植物内生真菌 Phoma sp.YN02-P。
9、-3的大米培养基重量的2-5倍。 0014 所述大米培养基组成为： 大米： 水的重量体积比为80:10080:120。 0015 本发明提供的所述新的phomone D的制备方法中， 0016 步骤(3)中所述石油醚和乙酸乙酯混合溶剂， 或石油醚和丙酮混合溶剂， 混合溶剂 的比例为100： 11： 1。 0017 步骤(4)中所述的馏分为石油醚： 丙酮100:10100： 30洗脱得到的馏分。 说明书 1/4 页 3 CN 107176937 A 3 0018 步骤(4)中重结晶溶剂为： 甲醇。 0019 本发明以体外抗肿瘤实验模型， 采用HL-60、 PC3、 HCT116细胞模型考察pho。
10、mone D 对三种肿瘤细胞生长抑制作用情况， 结果显示phomone D 能够有效地三种肿瘤细胞的生 长， 且具有较低的用药剂量。 0020 因此， 本发明中制备的新化合物phomone D可在开发抗肿瘤疾病药物方面应用。 0021 本发明使用的YN02-P-3菌株已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)保藏。 保藏地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所。 保藏日期2016年12月21日， 保藏编号为CGMCC No.13200， 分类命名为茎点霉(Phoma sp.) 附图说明 0022 图1本发明phomone D的1H NMR谱； 00。
11、23 图2本发明phomone D的13C NMR谱； 0024 图3本发明phomone D的HSQC谱； 0025 图4本发明phomone D的HMBC谱。 具体实施方式 0026 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制本发明。 0027 实施例1 0028 (1)植物内生真菌Phoma sp.YN02-P-3的大米培养基室温静置培养 30天后用甲醇 溶剂提取， 回收甲醇提取液得粗提物； 0029 (2)步骤(1)所得粗提物经水扩散后， 使用乙酸乙酯进行萃取得到乙酸乙酯层浸膏 100.0g， 0030 (3)上述步骤(2)中所得的乙酯层浸膏100g， 经石油醚： 丙酮。
12、100:1 100:100梯度 洗脱， 收集石油醚： 丙酮100:10100:30部分， 回收溶剂的浸膏5.2g； 0031 (4)上述(3)中所得5.2g浸膏， 取出100mg经石油醚/乙酸乙酯1:1 混合液体溶 解， 静置析出结晶后取出溶剂。 结晶用二氯甲烷溶解后回收溶解得phomone D 10mg。 0032 (5)上述(4)中所得phomone D经高效液相色谱分析， 85甲醇水系统洗脱， phomone D色谱峰面积占总色谱峰面积为91。 0033 根据phomone D的理化性质和波谱数据鉴定了其结构(phomone D的核磁谱图见附 图1-4)。 0034 phomone D的。
13、结构鉴定数据如下： 0035 0036 表1phomone D的NMR数据 说明书 2/4 页 4 CN 107176937 A 4 0037 0038 实施例2phomone D的体外抗肿瘤活性测试 0039 (1)实验原理 0040 细胞成活率测定采用MTT分析法， 以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐 (3-(4， 5- dimethyl-2thiahiazoy1)-3， 5-di-phenyl-tetrazolium bromide， MTT) 为基础。 MTT为黄 色化合物， 是一种接受氢离子的染料， 可作用于活细胞线粒体中的呼吸链， 在琥珀酸脱氢酶 和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂， 生。
14、成蓝色的Formazan结晶， Formazan结晶的生成量仅 与活细胞数目成正比。 死细胞中此酶消失， 不能和20的十二烷基磺酸钠(pH4.7)的MTT溶 解液中溶解， 利用酶标仪测定492nm出的光密度OD值， OD值的大小与所生成的Formazan结晶 的量成正比， 从而反应出药物对细胞成活率的影响。 0041 (2)实验方法 0042 实验细胞株来源及培养方法 0043 人早幼粒急性白血病细胞HL-60、 人胰腺癌PC3、 人结肠癌细胞HCT116 均购自 ATCC。 0044 取对数生长期的癌细胞， 以内含10(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum) 的 RPMI-。
15、1640培养液稀释为6103个/L的细胞悬浮液， 接种于96孔板中， 100 L/孔， 置于37 、 饱和湿度、 5CO2培养箱中培养48h。 0045 药物配置 0046 样品均为粉末状， 使用DMSO溶解。 配成浓度为100mg/mL的母液， 储存于-20。 临用 时用相应的培养液将其稀释， 稀释为100 g/mL、 10 g/mL、 1 g/mL及0.1 g/mL进行实验。 说明书 3/4 页 5 CN 107176937 A 5 DMSO配置的样品进行实验时， DMSO的终浓度为1。 0047 MTT法检测受试药物的细胞毒活性 0048 取对数生长期的细胞， 调整适当的细胞密度， 接种。
16、于96孔板内， 100 l/well， 培养 于37， 5CO2的培养箱内。 培养24h后加药， 作用48h。 分设空白组、 给药组和阳性对照组， 每组设6个复孔。 药物作用48h后， 将细胞与0.25mg/ml MTT于37下共同孵育3-4h， 离心， 小 心吸除培养液后每孔加入100 l二甲基亚砜(DMSO)， 完全溶解后使用酶标仪于492nm测定其 光密度OD值。 最后以空白组OD值为100， 计算各组细胞抑制率。 0049 0050 统计方法 0051 全部资料采用SPSS(16.0)统计软件包进行检验分析。 各组数据用均值标准误 (MeanS.E.)表示， 采用One-Way ANO。
17、VA评价整体性差异， 并进行Dunnett或Dunnett s T3 检验进行组间比较。 0052 IC50的计算方法 0053 将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。 0054 (3)实验结果： phomone D对HL-60的IC50值为0.65 M； 对PC-3 细胞的IC50值为1.09 M； 对HCT-116细胞的IC50值为2.31 M。 说明书 4/4 页 6 CN 107176937 A 6 图1 说明书附图 1/4 页 7 CN 107176937 A 7 图2 说明书附图 2/4 页 8 CN 107176937 A 8 图3 说明书附图 3/4 页 9 CN 107176937 A 9 图4 说明书附图 4/4 页 10 CN 107176937 A 10 。