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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201511005988.1 (22)申请日 2015.12.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105506088 A (43)申请公布日 2016.04.20 (73)专利权人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 谢青梅陈伟国蔺文成舒鼎铭 李昕键 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/。
2、11(2006.01) (56)对比文件 CZ 20130046 ,2014.08.06, CN 104152445 A,2014.11.19, C.T.LIAO等.single nucleotide polymorphism variants within tva and tvb receptor genes in chinese chickens. POULTRY SCIENCE .2014,第2482-2489页. 谢青梅等.地方鸡种A/B/D/E亚群禽白血病 遗传抗性评估和建议. 第十六次全国家禽学术 讨论会 .2014,第507页. 审查员 罗洋 (54)发明名称 鸡 B 亚 群 禽。
3、 白 血 病 抗 性 分 子 标 记 tvb3667-3668insAG及其分子诊断方法 (57)摘要 本发明属于抗性品种选育技术领域， 具体公 开了一种鸡B亚群禽白 血 病抗性分子标记 tvb3667-3668insAG及其分子诊断方法。 本发明首次 分析了中国鸡种tvb受体基因的遗传变异， 发现 中国鸡种中tvb受体基因第3667与3668位存在AG 插入突变， 发明人从体外、 体内实验两个层面证 实了该自然突变引起宿主对ALV-B的感染产生遗 传抗性， 另外发明人以此建立抗B亚群禽白血病 遗传标记的分子诊断方法， 该方法可应用于筛选 ALV-B遗传抗性鸡品种 （系） 的育种素材， 从而开。
4、 展ALV-B遗传抗性鸡品种 （系） 的选育。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105506088 B 2018.09.18 CN 105506088 B 1.鸡B亚群禽白血病病毒抗性分子标记， 其特征在于， 所述分子标记的序列是引物P4-F 和引物P4-R从TVB受体基因， Genebank登陆号为NC_006109. 3上扩增的序列， 并且所述扩增 的序列的第633与634位之间插入AG； 其中， 引物P4-F的核苷酸序列为： CTCCACGTCTCGGCAGCAC； 引物P4-R的核苷酸序列为： CTCTCCATCATCCCCTGCAAG。 2.权利要求1所述的分子标记在制备。
5、诊断B亚群禽白血病病毒抗性鸡的试剂中的应用。 3.引物P4-F 和引物P4-R在制备诊断B亚群禽白血病病毒抗性鸡的试剂中的应用， 其 中， 引物P4-F的核苷酸序列为： CTCCACGTCTCGGCAGCAC， 引物P4-R的核苷酸序列为： CTCTCCATCATCCCCTGCAAG。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506088 B 2 鸡B亚群禽白血病抗性分子标记tvb3667-3668insAG及其分子诊断 方法 技术领域 0001 本发明涉及抗性品种选育技术领域， 更具体地， 涉及鸡B亚群禽白血病抗性分子标 记tvb3667-3668insAG及其分子诊断方法。 背景技术 00。
6、02 禽白血病是由禽白血病病毒 （Avian Leukosis Virus， ALV） 引起的一种免疫抑制 性肿瘤性传染病， 该病能引起多种具有传染性的良性和恶性肿瘤。 感染鸡的禽白血病病毒 包括ALV A-E和J共6个亚群。 B亚群禽白血病病毒 （ALV-B） 是我国禽白血病的主要病原之一， 能使感染鸡群发生免疫抑制、 生产性能下降及特征性肿瘤而死亡， 给世界养禽业造成巨大 的经济损失。 目前， 该病尚无商品化疫苗和有效的治疗方法， 主要通过淘汰阳性鸡来净化种 鸡群和加强生物安全措施进行预防。 然而， 现有措施并不能控制AVL-B在中国的发生与流 行。 近年的流行病学调查结果显示， AVL-。
7、B在我国商品肉鸡、 蛋鸡、 地方品系鸡和野生鸟类中 普遍存在， 已成为威胁我国养鸡业 （尤其是种鸡业） 持续健康发展的重大疾病之一。 因此， 急 需研发更适合我国实情的禽白血病防控新策略。 国外已有研究证实， 从宿主遗传抗性方面 研究禽白血病的遗传抗病育种已成为防控该病的有效策略。 0003 发掘禽白血病遗传抗性功能基因或基因位点， 并应用于筛选禽白血病遗传抗性特 异种质以培育禽白血病抗性鸡品种 （系） 是实现禽白血病遗传抗病育种的关键。 发明内容 0004 本发明为了克服现有技术的上述不足， 提供一种鸡B亚群禽白血病抗性分子标记。 0005 本发明的另一个目的是提供一种诊断B亚群禽白血病抗性。
8、鸡的方法。 0006 为了实现上述目的， 本发明是通过以下方案予以实现的： 0007 一种鸡B亚群禽白血病抗性分子标记， 所述分子标记为tvb受体基因第3667与3668 的AG插入突变。 该位点简称为tvb3667-3668insAG突变位点。 0008 本发明首次分析了中国鸡种tvb受体基因的遗传变异， 发现中国鸡种中tvb受体基 因第3667与3668位存在AG插入突变， 发明人从体外、 体内实验两个层面证实了该自然突变 引起宿主对ALV-B的感染产生遗传抗性。 具体原因在于tvb受体基因第3667与3668位存在AG 插入突变位于tvb受体基因第4外显子， 从而导致tvb受体基因发生移。
9、位编码， 推测其可能导 致tvb受体基因表达一个不适宜作为病毒受体的缺陷蛋白， 从而引起宿主对ALV-B的感染产 生遗传抗性。 0009 因此， 本发明保护如上所述分子标记在诊断B亚群禽白血病抗性鸡中的应用。 0010 依据tvb受体基因第3667与3668的AG插入突变， 本发明建立了一种诊断B亚群禽白 血病抗性鸡的方法， 具体包括如下步骤： 0011 S1.提取待测鸡血液DNA， 以SEQ ID NO： 78所示P4引物扩增包含tvb3667-3668insAG突 变位点的tvb受体基因片段， 测序后判断待测鸡的基因型； 说明书 1/5 页 3 CN 105506088 B 3 0012 。
10、S2.如待测鸡的基因型为tvbinsAG/insAG， 则为B亚群禽白血病抗性鸡， 如待测鸡的基 因型为tvbS/insAG或tvbS/S， 则为B亚群禽白血病易感性鸡。 0013 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0014 本发明首次发现在中国鸡种中tvb受体基因第3667与3668位存在AG插入突变， 而 且本发明首次验证该突变引起宿主对ALV-B的感染产生遗传抗性。 因此， 将该突变位点作为 鉴定鸡B亚群禽白血病抗性的分子标记是非常准确的。 以此突变位点建立的抗B亚群禽白血 病遗传标记的分子诊断方法， 可应用于筛选ALV-B遗传抗性鸡品种 （系） 的育种素材， 从而开 展ALV。
11、-B遗传抗性鸡品种 （系） 的选育。 附图说明 0015 图1为本发明的研究思路。 0016 图2为RCASBP(B)病毒感染tvb3667-3668insAG位点不同基因型CEF细胞。 具体实施方式 0017 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述， 所述实施例 只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。 下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明， 均为常规方法； 所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂 和材料。 0018 实施例1tvb受体基因的遗传变异分析 0019 根据tvb受体基因已知DNA序列(GenBank登录号： NC_00。
12、6109.3)， 设计5对引物扩增 tvb基因全长序列5425bp， 引物序列、 位置及PCR扩增片段大小如表1所示。 0020 表1 为tvb受体基因全长序列PCR扩增信息 0021 0022 提取中国鸡种血液样品的基因组DNA， 用该5对引物扩增tvb受体基因全长序列。 PCR反应体系组成： 模板1L， 10buffer 2.5L， dNTPs 2 L， 上下游引物各 1 L， KOD-FX 说明书 2/5 页 4 CN 105506088 B 4 0.25 L， 无菌水补至25L。 PCR反应程序： 94预变性3min， 1个循环； 94 45s， 5865 （不同引物退火温度） 90s。
13、， 72 60s， 35个循环； 72后延伸10min。 PCR产物在2%琼脂糖凝 胶电泳检测时可观察到P1P5引物各自扩增的特异性条带， 将PCR扩增产物进行克隆测序， 分析tvb受体基因的遗传变异。 发明人随机分析了多个中国鸡品种 （系）tvb受体基因的遗传 变异， 发现中国鸡种tvb受体基因第3667与3668核苷酸位置中存在AG插入突变 （简称tvb3667 -3668insAG） 。 0023 实施例2 tvb3667-3668insAG突变致宿主抗ALV-B感染的功能验证。 0024 1、 体外细胞的功能验证： 构建RCASBP(B)EGFP表达质粒， 转染DF-I细胞7天后， 收。
14、集 细胞上清液 （上清液含携带EGFP荧光蛋白的RCASBP(B)病毒， 即ALV-B病毒， 可随后感染DF-I 和CEF细胞） ， 测定病毒感染单位 （IU） 后， 分装保存于-80。 RCASBP(B)病毒感染tvb3667 -3668insAG突变位点不同基因型CEF， 包括野生型tvb S/S CEF （对ALV-B易感） 、 杂合突变型tvbS /insAGCEF以及纯合突变型tvbinsAG/insAG CEF， 感染后1、 2、 4、 7 天， 利用流式细胞技术检测不同 时间点tvb 3667-3668insAG突变不同基因型CEF感染RCASBP(B)病毒后的阳性细胞率， 确定。
15、 tvb3667-3668insAG突变不同基因型CEF体外感染RCASBP(B)EGFP病毒的趋势。 体外细胞实验结果 表明： 野生型tvbS/S CEF和杂合突变型tvbS/insAGCEF对ALV-B易感， 而纯合突变型tvbinsAG/ insAGCEF抗ALV-B的感染， 证实tvb受体基因自然突变tvb3667-3668insAG导致宿主抗ALV-B的感 染， 见图2。 0025 2、 体内攻毒试验的功能验证： 携带tvb3667-3668insAG突变位点不同基因型的小鸡随机 分组， 饲养于隔离器， 1日龄和5日龄分别腹腔注射等量ALV-B野毒。 体内攻ALV-B野毒1个月 后，。
16、 采集tvb3667-3668insAG突变位点不同基因型鸡的血样， 利用TRIZOL试剂盒抽提血样总RNA。 RT-PCR扩增ALV-B的env基因编码序列， 设计ALV-B-env的RT-PCR扩增上游引物和下游引物： 0026 env-F： 5 - CCTGGAAAGGTGAGCAAG-3 ； 0027 env-R： 5 - TGGAGGGAGAATCGTGAA-3 ； 0028 RT-PCR扩增片段长度为966bp。 利用PrimeScriptROne Step RT-PCR Kit Ver. 2 试剂盒进行RT-PCR扩增， PCR反应程序： 50反转录30 min； 94 30s，。
17、 56 60s， 72 60s， 30个循环； 72后延伸10min。 PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如观察到966bp的目的条 带， 则该样品发生病毒血症 （ALV-B阳性） ， 如无目的条带的扩增， 则该样品没有发生病毒血 症 （ALV-B阴性） 。 体内攻毒试验结果表明：tvb3667-3668insAG突变位点野生型tvbS/S小鸡 （16只） 攻ALV-B野毒后均为ALV-B阳性， 杂合突变型tvbS/insAG小鸡 （26只） 攻ALV-B野毒后也均为 ALV-B阳性， 而纯合突变型tvbinsAG/insAG小鸡 （18只） 攻ALV-B野毒后均为ALV-B阴性， 见表2。
18、。 0029 表2 为tvb3667-3668insAG突变位点不同基因型1日龄小鸡 0030 攻ALV-B野毒1个月后 ALV-B阳性率 0031 说明书 3/5 页 5 CN 105506088 B 5 0032 备注： ALV-B为B亚群禽白血病病毒 （下同） 0033 实施例3 建立ALV-B遗传抗性鸡的鉴定标准 0034 利用表1中的P4引物PCR扩增包含tvb3667-3668insAG突变位点的tvb受体基因区域， 根 据P4引物PCR扩增产物测序结果， 制定判定B亚群禽白血病遗传抗性鸡的方法标准 （见表3） 。 0035 表3 B亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准 0036 00。
19、37 备注： 如果被检测的鸡带有A， 则这只鸡判定为对ALV-B的感染产生遗传抗性。 0038 建立的B亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准为： 1、 假如某只鸡在tvb3667-3668insAG 突变位点的基因型为tvbinsAG/insAG， 则这只鸡对ALV-B感染产生遗传抗性。 0039 实施例4 ALV-B遗传抗性鸡的筛选与运用 0040 用建立的B亚群禽白血病遗传抗性鸡鉴定方法评估10个地方鸡种和8个商业肉鸡 品系共989个样品抗ALV-B的遗传改良潜力， 结果见表4。 表4结果表明康乐鸡、 东乡绿壳蛋 鸡、 宁都黄鸡和济宁百日鸡等地方鸡种以及C01、 C03和C08等商业肉鸡品系具。
20、有良好的抗 ALV-B遗传改良潜力， 可从这些品种 （系） 中筛选出培育抗ALV-B感染的育种素材， 并运用于 ALV-B遗传抗性鸡品种 （系） 的选育， 以防控B亚群禽白血病。 0041 表4 中国鸡种tvb3667-3668insAG突变位点的基因型频率 说明书 4/5 页 6 CN 105506088 B 6 0042 0043 备注： CB01- CB08等代表8个商业肉鸡品系。 0044 表4的结果表明，tvb受体基因第3667与3668核苷酸位置中存在AG插入突变只存在 部分鸡品种 （系） 中， 而且， 即使是同一鸡品种 （系） ， 也不是所有的鸡都是发生突变的。 例如 检测的52只康乐鸡， 其中26只是没有突变的， 剩下的26中， 有一些是纯合突变， 而一些是杂 合突变。 说明书 5/5 页 7 CN 105506088 B 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 105506088 B 8 。