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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810638692.0 (22)申请日 2018.06.20 (71)申请人 四川瑞兴和弘健康咨询有限公司 地址 610000 四川省成都市高新区天府大 道西段399号10栋6层607P-1号 (72)发明人 熊仲川 (74)专利代理机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 代理人 李崧岩 (51)Int.Cl. C12N 5/078(2010.01) A61K 35/16(2015.01) A61P 17/14(2006.01) (54)发明名称 一种细胞培养液。
2、、 利用该细胞培养液制备富 血小板血浆的方法及制得的富血小板血浆 (57)摘要 本发明属于生物医药技术领域， 公开了一种 细胞培养液， 主要由以下体积百分数的组分组 成： 2.5的维生素C、 2.5的N-乙酰氨基酸、 1.5的支链氨基酸， 余量为常规细胞培养基。 本 发明还提供了利用该细胞培养液提取血小板血 浆的方法。 本发明提供的细胞培养液配方简单， 成本低， 可有效促进血液中的血小板及白细胞分 泌有益生长因子。 该细胞培养液与本发明提供的 富血小板血浆的制备方法相结合， 可快速制备含 有大量有益生长因子并且无污染可直接注射的 富血小板血浆， 可有效治疗脂溢性脱发。 权利要求书1页 说明书4。
3、页 附图1页 CN 108795857 A 2018.11.13 CN 108795857 A 1.一种细胞培养液， 其特征在于， 主要由以下体积百分数的组分组成： 2.5的维生素 C、 2.5的N-乙酰氨基酸、 1.5的支链氨基酸， 余量为细胞培养基。 2.根据权利要求1所述的细胞培养液， 其特征在于： 所述N-乙酰氨基酸中的氨基酸为L- 蛋氨酸、 L-苏氨酸、 L-组氨酸、 L-谷氨酰胺、 L-异亮氨酸、 L-亮氨酸、 L-赖氨酸、 L-苯丙氨酸、 L-色氨酸或L-缬氨酸， 所述支链氨基酸为亮氨酸。 3.根据权利要求1或2所述的细胞培养液， 其特征在于： 所述细胞培养基为DMEM培养基、 。
4、H3无血清培养基或RPMI-1640培养基。 4.一种富血小板血浆的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1： 取外周血， 向外周血中加入权利要求1-3任意一项所述的细胞培养液， 混匀， 得到混 合液一； S2： 将上述混合液一静置培养， 得到混合液二； S3： 将步骤S2所述的混合液二离心， 取上清液和中间细胞层， 即得到所述富血小板血 浆。 5.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于： 所述步骤S1中外周血的体积与所述细 胞培养液的比例为20:1。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于： 所述步骤S2中培养的温度为37， 培 养时CO2浓度为5， 培养时间为4h。 7.。
5、根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 所述步骤S3中离心时离心力为26G， 离 心时间为15min。 8.一种通过权利要求4-7任意一项所述的制备方法制备的富血小板血浆。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108795857 A 2 一种细胞培养液、 利用该细胞培养液制备富血小板血浆的方 法及制得的富血小板血浆 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种细胞培养液、 利用该细胞培养液制 备富血小板血浆的方法及制得的富血小板血浆。 背景技术 0002 脂溢性脱发的患者往往由于雄激素在局部组织中代谢异常， 通过5 还原酶的作用 使活性低的睾酮转化为活性高的二氢睾酮(DH。
6、T)， 而DHT与雄激素受体有很强的亲和力， 可 与雄激素受体结合而进入细胞核起作用， 使毛囊过早成熟， 生长期缩短而提前进入休止期， 毛囊渐变小， 毛发变得细短， 进而脱发， 目前对于脱发的治疗一般是采用植发， 还没有有效 的手段可使脱发患者在短时间内生发。 富血小板血浆(PRP)是利用自身血液制作的富含血 小板的高浓度血浆， 其中包含多种生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)、 转化生长因子 TGF- 1、 血小板衍生生长因子(PDGF)、 胰岛素样生长因子IGF-I、 IGF-II、 纤维蛋白、 纤维结 合蛋白分子、 促进炎症反应、 细胞增殖和分化等的因子， 在创面损伤修复中应用较广。 。
7、0003 然而， 目前PRP的提取主要是二次离心法， 主要存在以下缺点： 开放式的制备体系 容易受到外界污染， 提取PRP时在多个容器间转移， 增加了血小板被污染和激活的机率， 操 作人员的个人操作习惯极大地影响了PRP中血小板的浓度， 以上因素导致制备的PRP中血小 板获取率较低且各指标变异系数大， 极大程度地限制了PRP的应用。 因此， 急需开发一种能 快速提取含有大量有益成分且不易污染的PRP的方法。 发明内容 0004 为了解决现有技术存在的上述问题， 本发明目的在于提供一种细胞培养液、 利用 该细胞培养液制备富血小板血浆的方法及制得的富血小板血浆。 0005 本发明所采用的技术方案为。
8、： 0006 本发明提供了一种细胞培养液， 主要由以下体积百分数的组分组成： 2.5的维生 素C、 2.5的N-乙酰氨基酸、 1.5的支链氨基酸， 余量为常规细胞培养基。 0007 具体的， 上述细胞培养液， 所述N-乙酰氨基酸中的氨基酸L-蛋氨酸、 L- 苏氨酸、 L- 组氨酸、 L-谷氨酰胺、 L-异亮氨酸、 L-亮氨酸、 L-赖氨酸、 L-苯丙氨酸、 L-色氨酸或L-缬氨酸， 所述支链氨基酸为亮氨酸。 0008 具体的， 上述细胞培养液， 所述细胞培养基为DMEM培养基、 H3无血清培养基或 RPMI-1640培养基。 0009 本发明还提供了一种富血小板血浆的制备方法， 包括以下步骤：。
9、 0010 S1： 取外周血， 向外周血中加入前述的细胞培养液， 混匀， 得到混合液一； 0011 S2： 将上述混合液一静置培养， 得到混合液二； 0012 S3： 将步骤S2所述的混合液二离心， 取上清液和中间细胞层， 即得到所述富血小板 血浆。 说明书 1/4 页 3 CN 108795857 A 3 0013 具体的， 上述制备方法， 所述步骤S1中外周血的体积与所述细胞培养液的比例为 20:1。 0014 具体的， 上述制备方法， 所述步骤S2中培养的温度为37， 培养时的CO2浓度为 5， 培养时间为4h。 0015 具体的， 上述制备方法， 所述步骤S3中离心时离心力为26G， 。
10、离心时间为 15min。 0016 一种通过前述制备方法制备的富血小板血浆。 0017 本发明的有益效果为： 0018 本发明提供的细胞培养液配方简单， 成本低， 可有效促进血液中的血小板及白细 胞分泌有益生长因子。 利用本发明提供的细胞培养液并结合本发明提供的富血小板血浆的 制备方法， 可快速制备含有大量有益生长因子并且无污染可直接注射的富血小板血浆， 该 富血小板血浆可有效治疗脂溢性脱发。 附图说明 0019 图1是本发明提供的富血小板血浆治疗严重脂溢性脱发的效果图； 0020 图2是本发明提供的富血小板血浆治疗普通脂溢性脱发的效果图。 具体实施方式 0021 下面结合附图及具体实施例对本。
11、发明做进一步阐释。 0022 实施例1 0023 本实施例的目的在于提供一种细胞培养液， 主要由以下体积百分数的组分组成： 2.5的维生素C、 2.5的N-乙酰-L-谷氨酰胺、 1.5的支链氨基酸亮氨酸， 余量为细胞培 养基， 细胞培养基为市面上现有的培养基， 优选为gibic、 hyclone、 lonza、 stemcell、 BI、 sigma或takara公司的DMEM培养基、 H3无血清培养基或RPMI-1640培养基。 0024 实施例2 0025 本实施例的目的在于提供一种细胞培养液， 主要由以下体积百分数的组分组成： 2.5的维生素C、 2.5的N-乙酰-L-组氨酸、 1.5的。
12、支链氨基酸缬氨酸， 余量为细胞培养 基， 细胞培养基为市面上现有的培养基， 优选为gibic、 hyclone、 lonza、 stemcell、 BI、 sigma 或takara公司的DMEM培养基、 H3无血清培养基或RPMI-1640培养基。 0026 实施例3 0027 本实施例的目的在于提供一种细胞培养液， 主要由以下体积百分数的组分组成： 2.5的维生素C、 2.5的N-乙酰-L-赖氨酸、 1.5的支链氨基酸异亮氨酸， 余量为细胞培 养基， 细胞培养基为市面上现有的培养基， 优选为gibic、 hyclone、 lonza、 stemcell、 BI、 sigma或takara公。
13、司的DMEM培养基、 H3无血清培养基或RPMI-1640培养基。 0028 蛋白质中的三种常见氨基酸， 亮氨酸、 缬氨酸和异亮氨酸统称支链氨基酸 (BCAA)， 所以又可称复合支链氨基酸， 其中以亮氨酸最优。 这类氨基酸以两种特殊方式促进 合成代谢(肌肉增长)： 促进胰岛素释放， 促进生长激素释放。 支链氨基酸中最重要的是 亮氨酸。 除了上述三种N-乙酰氨基酸， 还可以使用L-异亮氨酸、 L-亮氨酸、 L-蛋氨酸、 L-苯丙 氨酸、 L-苏氨酸、 L-色氨酸或L- 缬氨酸， 是维持细胞生长的生物活性物质， 在细胞代谢中起 调节及控制作用。 说明书 2/4 页 4 CN 108795857 A。
14、 4 0029 由本发明提供的细胞培养液培养的细胞生长状态良好， 可用于目前市面上的多种 细胞系及一些较难攻克的原代细胞的培养。 0030 实施例4 0031 本实施例的目的在于提供一种富血小板血浆， 该富血小板血浆由以下步骤制备而 成(以下培养操作均置于无菌操作台上操作)： 0032 S1： 取人体的外周血100ml， 均分至10个15ml细胞培养管(eagle mediumthermo 厂出产)中， 细胞培养管中预先加有抗凝剂， 每个细胞培养管中加入0.5mL实施例1中所述的 培养液， 混匀， 得到混合液一； 0033 S2： 将混合液一于细胞培养箱中静置培养， 培养的温度为37， 培养时。
15、 CO2浓度为 5， 培养时间为4h， 得到混合液二； 0034 S3： 将步骤S2所述的混合液二离心， 离心力为26G， 离心时间为15min， 取上清液和 中间细胞层， 即得到所述富血小板血浆。 0035 所述富血小板血浆制备过程中， 步骤S3所得的中间细胞层包含大量的白细胞、 血 小板以及一定量的间充质干细胞， 上清液中含有自体全血的血浆中的所有非细胞成分， 例 如细胞因子、 生长因子、 趋化因子、 免疫调节因子、 酶、 激素等； 生长因子包括胰岛素样生长 因子IGF-1， 转化生长因子TGF- ， 碱性呈纤维细胞生长因子FGF-b和血管内皮细胞生长因子 VEGF等。 由于本发明提供的富。
16、血小板血浆制备方法， 先采用本发明提供的细胞培养液进行 培养， 使外周血中的细胞尽量多地释放有益的非细胞成分， 使这些有益的非细胞成分， 主要 是各类生长因子快速活化增生， 培养完成后， 进行一次离心， 收集得到的富血小板血浆含有 的各类生长因子的数量远远高于传统方法制备出来的富血小板血浆中的有效成分， 并且该 培养方法仅经过一次离心， 中间步骤少， 全程在无菌操作台上操作， 安全性更高， 制得的富 血小板血浆可直接注射进病人体内。 每 100mL外周血可抽出包含上清液和中间细胞层共约 40mL的液体， 注射到头皮内即可用于生发。 所用离心机为kubota2800型离心机。 0036 效果例1。
17、 0037 征集100名脂溢性脱发患者(普通性脱发62名患者， 严重性脱发患者38 名)， 抽取 前述患者的外周血， 按照实施3所述的富血小板血浆的制备方法培养收集各个患者的富血 小板血浆， 并将收集的富血小板血浆对应注入各个患者的头皮中， 普通性脱发患者和严重 性脱发患者均经1次治疗后的三个月内即开始生发， 生发率达到100， 即1次治疗后的三个 月内均能长出头发。 治疗周期因人而异， 经过实践得知， 按照本发明提供的富血小板血浆的 制备方法制得的富血小板血浆， 其新生发覆盖率(新生发面积与脱发面积比例)如表1所示， 普通性脱发患者一般经过3-4次治疗新生发覆盖率即可达到90以上(普通性脱发。
18、患者的 治疗效果图如图2所示， 其中编号为1-4的图分别表示治疗前、 一次治疗后第三周、 二次治疗 后第三周和三次治疗第三周的效果图)， 严重性脱发患者一般经过6-9次治疗后新生发覆盖 率即可达到90以上(严重性脱发患者的治疗效果图如图1所示， 其中编号为1-4的图分别 表示治疗前、 一次治疗后、 二次治疗后和六次治疗的效果图)。 0038 表1 说明书 3/4 页 5 CN 108795857 A 5 0039 0040 由此可见， 实施例2提供的富血小板血浆中的细胞和生长因子可以刺激脂溢性脱 发患者已经休眠老化的毛囊， 让这些毛囊重新生发， 首次治疗后生发率为100， 本发明提 供的富血小板血浆的培养方法有别于一般生发治疗或生发药剂， 传统的生发治疗多为植 发， 无法根治脱发， 本发明提供的富血小板血浆可从根本上治疗患者脱发， 使其不断长出新 的头发。 0041 本发明不局限于上述可选的实施方式， 任何人在本发明的启示下都可得出其他各 种形式的产品。 上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制， 本发明的保护 范围应当以权利要求书中界定的为准， 并且说明书可以用于解释权利要求书。 说明书 4/4 页 6 CN 108795857 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 108795857 A 7 。