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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810647412.2 (22)申请日 2018.06.22 (71)申请人 苏州良辰生物医药科技有限公司 地址 215613 江苏省苏州市张家港市华昌 路沙洲湖科创园D-1栋12楼 （良辰） (72)发明人 殷文静 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 汪青周敏 (51)Int.Cl. C12N 9/94(2006.01) (54)发明名称 一种胰酶的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种胰酶的制备方法， 将胰腺磨 碎， 然后加入过氧。
2、化氢得到混合物， 其中， 所述的 过氧化氢在所述的混合物中的质量百分浓度为 0.1%2%， 搅拌18h， 加入触酶反应0.52h， 然后 经脱脂、 激活、 沉淀、 干燥制得胰酶。 本发明的过 氧化氢可以在较短时间内和病毒充分接触从而 达到病毒灭活的目的， 另外， 残留的过氧化氢通 过触酶分解成水和氧气， 从而使得胰酶中无过氧 化氢的残留， 从而极大的增强了药物的病毒安全 性， 使得胰酶产品可以符合各国药典和动物来源 的生化药物法规方面的苛刻要求。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 108795920 A 2018.11.13 CN 108795920 A 1.一种胰酶的制备方法， 其。
3、特征在于： 将胰腺磨碎， 然后加入过氧化氢得到混合物， 其 中， 所述的过氧化氢在所述的混合物中的质量百分浓度为0.1%2%， 搅拌18h， 加入触酶反 应0.52h， 然后经脱脂、 激活、 沉淀、 干燥制得胰酶。 2.根据权利要求1所述的胰酶的制备方法， 其特征在于： 所述的胰腺磨碎后， 自溶416h 后， 加入所述的过氧化氢。 3.根据权利要求1所述的胰酶的制备方法， 其特征在于： 所述的混合物在215下进行 所述的搅拌。 4. 根据权利要求1所述的胰酶的制备方法， 其特征在于： 每1mg过氧化氢加入1001000 u的触酶。 5.根据权利要求1所述的胰酶的制备方法， 其特征在于： 所述的。
4、触酶为来自细菌或霉菌 的代谢产物。 6.根据权利要求1所述的胰酶的制备方法， 其特征在于： 加入所述的触酶后， 在515 下进行反应2060min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108795920 A 2 一种胰酶的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种胰酶的制备方法。 背景技术 0002 胰酶是从猪、 牛、 羊等哺乳动物的胰脏中提取得到的一种混合酶制剂， 主要成分为 胰蛋白酶、 胰淀粉酶、 胰脂肪酶， 还有羧肽酶、 糜蛋白酶、 弹性蛋白酶、 激肽释放酶和核糖核 酸酶等。 早至1938年， 胰酶产品就已经被用于囊泡性纤维症和慢性胰腺炎， 且大多数病人需 要终。
5、身服用。 目前， 胰酶已是各国药典收载的助消化药品， 临床上用于治疗消化不良、 食欲 不振及肝胰疾患引起的消化障碍。 由于胰酶中含有多种活性物质， 可作为原料药从中提取 所需生化物质。 此外， 胰酶还被广泛用于细胞培养以生产治疗用生物制品如单抗、 细胞因子 等。 0003 由于胰酶来源于动物的提取物， 其原料中存在病毒污染的风险。 FDA、 CFDA、 EMA等 各国法规中均有明确规定， 必须进行病毒灭活和病毒安全评价。 2006年， FDA出版Guidance for Industry on Exocrine Pancreatic Insufficiency Drug Products， 其。
6、中对胰酶产 品的病毒安全性作出如下描述 （1） 制造商需要对其进行完整的病毒风险评估 （2） 按照ICH Q5A的要求验证生产工艺的病毒去除/灭活能力。 0004 而现有技术中， 胰酶的生产过程包括： 胰脏磨浆、 丙酮脱脂、 激活、 丙酮沉淀提取、 烘干， 由于制造工艺的限制， 胰酶生产中的丙酮脱脂和烘干条件很难灭活一些理化抵抗力 较高的非脂包膜病毒如PPV （猪细小病毒） 、 PCV （猪圆环病毒） 和HEV （戊型肝炎病毒） ， 使得以 胰酶作为API、 细胞培养原料大大增加了病毒污染的风险。 而传统的病毒灭活方法如强碱、 高温加热、 辐照均会对酶活产生较大的影响。 0005 在专利 “在。
7、生产胰酶制剂过程中减少或灭活病毒和微生物内容物的方法 （CN 107849552 A） ” 中， 公开了用过乙氧酸预先处理猪胰腺， 然后清洗去掉残留的过氧乙酸， 并 从经处理的腺体组织中提取胰酶。 上述用过氧乙酸处理的方法中， 由于病毒是寄生于细胞 内部， 该专利所述的方法只能灭活腺体组织表面的微生物， 对于细胞内部的病毒灭活效果 十分有限， 具有一定的缺陷。 0006 专利US 2011/0268844 A1中公开了用4000、 5000或6000巴的超高压处理5分钟处 理胰酶制剂以灭活病毒。 该方法的缺陷是高压处理对某些病毒的灭活作用是不确定的， 而 且， 超高压设备成本昂贵， 生产费用高。
8、， 在生产实践中基本是不可取的。 发明内容 0007 本发明的一个目的是提供一种病毒灭活效果好的胰酶的制备方法。 0008 为解决以上技术问题， 本发明采用如下技术方案： 一种胰酶的制备方法， 将胰腺磨碎， 然后加入过氧化氢得到混合物， 其中， 所述的过氧 化氢在所述的混合物中的质量百分浓度为0.1%2%， 搅拌18h， 加入触酶反应0.52h， 然后 经脱脂、 激活、 沉淀、 干燥制得胰酶。 说明书 1/4 页 3 CN 108795920 A 3 0009 优选地， 所述的胰腺磨碎后， 自溶416h后， 加入所述的过氧化氢。 0010 优选地， 所述的混合物在215下进行所述的搅拌。 00。
9、11 优选地， 每1mg过氧化氢加入1001000 u的触酶。 0012 优选地， 所述的触酶为来自细菌或霉菌的代谢产物， 例如， 购自泰安信得利生物工 程有限公司的50000u/ml液体酶或南宁庞博生物100000U/g酶粉。 0013 优选地， 加入所述的触酶后， 在515下进行反应2060min。 0014 由于胰腺磨碎后， 细胞内部的活性酶渗透到细胞外部， 可以产生对腺体的自溶作 用， 使胰腺溶解成流动的、 较均匀的液体状态， 有利于灭活剂和病毒的充分接触。 因此， 本发 明在发生一定自溶后的胰浆中加入过氧化氢， 从而可以灭活细胞内部的病毒， 从而使得灭 活效果更加彻底。 0015 另。
10、外， 由于过氧化氢可以在触酶的作用下分解成水和氧气， 从而可以避免胰酶中 过氧化氢的残留。 而触酶对胰酶产品的影响较小， 另外， 在后续的脱脂、 激活、 沉淀、 干燥步 骤中， 触酶大部分被除去， 因此， 即便胰酶中有触酶的残留， 残留量也很小。 0016 本发明中的脱脂、 激活、 沉淀、 干燥步骤采用制备胰酶时的常规方法即可。 0017 由于以上技术方案的实施， 本发明与现有技术相比具有如下优势： 本发明的过氧化氢可以在较短时间内和病毒充分接触从而达到病毒灭活的目的， 另 外， 残留的过氧化氢通过触酶分解成水和氧气， 从而使得胰酶中无过氧化氢的残留， 从而极 大的增强了药物的病毒安全性， 使。
11、得胰酶产品可以符合各国药典和动物来源的生化药物法 规方面的苛刻要求。 附图说明 0018 附图1为感染PPV病变的ST细胞； 附图2为正常的ST细胞； 图3为正常的Vero细胞； 图4 感染EMCV病变的Vero细胞。 0019 具体实施方式 0020 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 应理解， 这些实施例是用于说 明本发明的基本原理、 主要特征和优点， 而本发明不受以下实施例的限制。 实施例中采用的 实施条件可以根据具体要求做进一步调整， 未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 0021 实施例1、 胰酶的制备包括依次进行的如下步骤： （1） 将 100g胰腺和5g十二指肠刨片。
12、后， 加入 20g无水丙酮搅拌混合， 然后用胶体磨磨 碎， 自溶4h； （2） 加入0.5g质量浓度为30%的市售过氧化氢溶液过氧化氢， 在2下搅拌8h； （3） 加入100000u单位触酶， 在5下搅拌2h； （4） 将经步骤 （3） 处理后的处理液放入脱脂桶中， 加入温度为05、 比重密度0.800 的预冷的原丙酮， 脱脂2h， 打开阀门放出脱脂丙酮； 说明书 2/4 页 4 CN 108795920 A 4 （5） 向经步骤 （4） 处理后的处理液中加入氯化钙作为激活剂激活， 搅拌均匀， 放入提取 罐内， 温度5， 激活20h； （6） 将激活完毕的提取液用分离机分离、 过滤， 收集胰乳。
13、滤液， 将胰乳滤液加入沉淀罐 内， 加入比重小于0.850的预冷至-70的丙酮， 搅拌30min， 用比轻计测沉淀液比重在0.85 0.89之间时完成沉淀， 得到沉淀液； （7） 将沉淀液干燥、 粉碎得到胰酶粉， 其中， 胰蛋白酶1500u/g， 胰脂肪酶10000u/g， 经检 测， 无触酶残留。 0022 病毒灭活效果的检测方法 在上述步骤 （1） 之后， 步骤 （2） 之前， 加入6.5 log10TCID50/0.1ml滴度的指示病毒PPV （猪细小病毒， 病毒液加入量为自溶液体积的5%， 100g胰腺约加入5ml病毒液） 。 0023 分别取出加入过氧化氢前和加入触酶反应后的样品， 。
14、分别接种至ST细胞培养物 中， 观察细胞病变 （CPE） ， 加入过氧化氢前的样品对细胞病变的影响见图1， 加入触酶反应后 的样品对细胞病变的影响见图2， 计算病毒滴度以及病毒滴度的下降值， 病毒滴度为2.1 log10， 病毒滴度的下降值4.4 log10。 0024 实施例2 与实施例1基本相同， 不同之处在于： 加入8g质量浓度为30%的市售过氧化氢溶液， 触酶 的添加量为500000u。 经检测， 制得的胰酶粉中胰蛋白酶1500u/g， 胰脂肪酶10000u/g， 无触 酶残留。 0025 病毒灭活效果的检测方法 在步骤 （1） 之后， 步骤 （2） 之前， 加入6.5 log10TC。
15、ID50/0.1ml滴度的指示病毒EMCV （脑 心肌炎病毒， 病毒液加入量为自溶液体积的5%， 100g胰腺约加入5ml病毒液） 。 0026 分别取出加入过氧化氢前和加入触酶反应后的样品， 分别接种至Vero细胞培养物 中， 观察细胞病变 （CPE） ， 加入过氧化氢前的样品对细胞病变的影响见图4， 加入触酶反应后 的样品对细胞病变的影响见图3， 计算病毒滴度以及病毒滴度的下降值， 病毒滴度为1.1 log10， 病毒滴度的下降值5.4 log10。 0027 对比例1 与实施例1基本相同， 不同之处在于： 步骤 （1） 磨碎后， 就加入过氧化氢， 而不待腺体自 溶。 0028 病毒灭活效。
16、果的检测方法同实施例1， 经检测病毒滴度为4.5log10， 病毒滴度的下 降值1log10。 0029 对比例2 与实施例1基本相同， 不同之处在： 各步骤的顺序依次为 （1） 、（4） 、（5） 、（2） 、（3） 、（6） 、 （7） 。 经检测， 胰酶粉中有触酶残留。 0030 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的人士能 够了解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围， 凡根据本发明精神 说明书 3/4 页 5 CN 108795920 A 5 实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 108795920 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 108795920 A 7 图3 图4 说明书附图 2/2 页 8 CN 108795920 A 8 。