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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810609500.3 (22)申请日 2018.06.13 (83)生物保藏信息 CGMCC No： 14537 2017.08.18 (71)申请人 中国科学院南海海洋研究所 地址 510301 广东省广州市海珠区新港西 路164号 (72)发明人 张偲王琳李洁 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) E02D 3/00(2006.01) C12R 1/01(2006。
2、.01) (54)发明名称 一株产胞外多糖可固沙的溶杆菌SCSIO 17111及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种产胞外多糖可固沙的溶 杆菌SCSIO17111及其应用。 本发明的溶杆菌 SCSIO17111于2017年8月18日保藏于中国微生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员会 普 通 微 生 物 中 心 (CGMCC)， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3 号， 中国科学院微生物研究所， 保藏编号： CGMCC NO.14537。 本发明所提供的溶杆菌SCSIO17111 可以使沙粒团聚并保持相对稳定的状态， 从而起 到固沙的效果， 可以应用于防治干旱、 半干旱地 区沙漠化和岛礁生。
3、物土壤结皮的构建。 相较于物 理固沙、 化学固沙和植被的培植， 利用微生物结 皮固沙作为新型固沙方式， 具有适应性强、 成本 低、 见效快等优势。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 108795807 A 2018.11.13 CN 108795807 A 1.溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111， 其保藏编号： CGMCC No.14537。 2.权利要求1所述的溶杆菌SCSIO 17111在固沙和/或建立生物土壤结皮中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 是先培养溶杆菌SCSIO 17111的菌液， 然后 菌液接种到需要固沙的。
4、区域。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的培养溶杆菌SCSIO 17111的菌液是 用TSB培养基培养溶杆菌SCSIO 17111， 获得菌液， 所述的TSB培养基为： 胰蛋白胨17.0g/L， 大豆蛋白胨3.0g/L， 葡萄糖2.5g/L， 氯化钠5.0g/L， K2HPO4 2.5g/L， 溶剂为水， pH7.30.2。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108795807 A 2 一株产胞外多糖可固沙的溶杆菌SCSIO 17111及其应用 技术领域： 0001 本发明属于微生物领域， 具体涉及一株产胞外多糖， 具有固沙能力的溶杆菌SCSIO 17111及其应用。 背景技。
5、术： 0002 溶杆菌属(Lysobacter)属于变形菌门、 -变形菌纲、 黄单胞菌目、 黄单胞菌科。 溶 杆菌属菌株细胞呈细杆状， 大小一般为0.20.51.015(有些能达到70) m， 无鞭毛， 具 滑行能力， 可弯曲， 为革兰氏阴性、 好氧细菌， 其基因组DNA中G+C含量高， 达到61.7 70.7。 溶杆菌属菌落具有较强黏性， 颜色一般为奶油色、 粉红色或黄褐色。 0003 近二、 三十年来， 随着人口数量增加， 城市规模不断扩大， 人类经济活动的加剧， 对 土地资源的不合理利用和破坏， 使干旱、 半干旱和具有干旱灾害的半湿润地区的土地发生 退化， 即土地退化， 也叫 “沙漠化”。
6、 。 在人类诸多的环境问题中， 荒漠化是最为严重的灾难之 一， 全球沙化土壤正以每年57万平方公里的速度扩展， 有10亿以上的人、 40以上的陆地 表面受到荒漠化的影响。 0004 干旱、 半干旱地区沙漠化的扩张越来越严重， 导致土地退化， 土壤肥力、 生物多样 性降低， 极端环境和社会经济因素加剧了土地的退化。 目前防沙固沙的主要方法是物理固 沙、 化学固沙和植被的培植， 但成本相对较高， 且干旱半干旱地区降水不足、 蒸发强烈， 植树 造林的成活率较低。 利用微生物结皮固沙作为新型固沙方式， 具有适应性强、 成本低、 见效 快等优势。 沙漠结皮中的微生物既是结皮形成的参与者， 又是结皮的重要。
7、组成部分， 具有增 强土壤团聚稳定性、 改善表层土壤水分状况、 防止土壤侵蚀等作用。 已有研究表明， 土壤结 皮之所以能形成， 与微生物以及它所分泌的多糖类物质有着密不可分的关系。 细菌在土壤 结皮形成的初期， 起到了重要作用， 在其代谢过程中会分泌大量的胞外聚合物即胞外多糖。 多糖物质能胶结土壤颗粒使之成为团聚体， 在团聚体的形成与稳定过程中起到了粘结作 用。 有关细菌固沙的研究已有报道， Pan等将从新疆古尔班通古特沙漠生物土壤结皮底层分 离出来的一株寡营养细菌制成菌剂喷洒于沙漠表面， 可以起到固沙和减缓土壤水分蒸发的 效果， 从而对沙漠环境起到了一定的改善作用。 张雪梅等将从古尔班通古特。
8、沙漠中分离纯 化得到的一株产胞外多糖的固氮细菌(Azotobacter sp.)制成菌液喷洒在流沙表面形成了 一层微生物结皮， 对中麻黄、 乌拉尔甘草等多年生干旱荒漠植物有保水、 保苗作用。 Wu等将 从沙漠生物结皮中分离出的细菌接种到野外沙田后， 刺激了表层土壤中异养微生物的聚 集， 细菌、 放线菌的数量及总磷、 速效氮、 速效磷含量显著增加， 对土壤具有固沙、 保水、 防化 学侵蚀的作用， 同时对生物结皮的恢复起到有效的作用。 0005 现阶段， 已用于固沙的微生物主要集中在蓝藻门， 主要包括丝状蓝藻， 如念珠藻属 (Nostoc)、 颤藻属(Oscillatoria)、 柱孢藻属(Cyl。
9、indrospermum)和席藻属(Phormidium) 等。 蓝藻作为土壤调节剂的使用已被断断续续地研究了几十年， 随着人们逐渐认识到蓝藻 在生物结皮形成过程中的重要性， 最近又重新成为关注的重点。 将蓝藻接种到沙地表面， 可 通过藻丝对沙粒的机械缠绕和细胞多糖等有机物的粘附作用形成团聚体， 由团聚体构成的 说明书 1/4 页 3 CN 108795807 A 3 生物结皮能起到固沙作用。 科研人员摸索研发在野外流沙上接种蓝藻的技术方法， 取得了 一定的成果， 相关技术应用于修复荒漠化生境。 溶杆菌虽可产生胞外多糖， 但目前未见对溶 杆菌的固沙能力的相关研究报道。 发明内容： 0006 本。
10、发明的目的是提供一株从中国海南省三沙市南沙岛礁生物土壤结皮中分离获 得的产胞外多糖并能够固沙的溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111菌株， 为固沙和生物 土壤结皮提供新的微生物资源。 0007 本发明的溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111于2017年8月18日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3 号， 中国科学院微生物研究所， 保藏编号： CGMCC No.14537。 0008 本发明根据苯酚-硫酸法(Phenol-SulphuricAcidMethod)， 利用葡萄糖标准曲线，。
11、 测定菌株SCSIO 17111胞外多糖产量， 结果显示其胞外多糖产量为0.080.01mg/ml。 用溶 杆菌SCSIO 17111的TSB培养液均匀的喷洒在粒径小于1.25mm且大于0.20mm的无菌珊瑚沙 时， 经过55天的培养， 发现其能够有效地促进结皮的形成， 形成的结皮厚度为6 .00 1.32mm； 当培养液均匀地喷洒在粒径小于0.20mm的无菌珊瑚沙上时， 经过55天的培养， 形成 的结皮厚度为2.330.58mm。 虽然后者的结皮厚度不如前者， 但是后者的土壤团聚物稳定 性更强， 即对土壤团聚物进行干筛时， 后者的团聚物能保持较好的稳定性， 而前者更易破 碎。 0009 因此。
12、， 本发明的第二个目的是提供溶杆菌SCSIO 17111在固沙和/或建立生物土壤 结皮中的应用。 0010 优选应用方法是先培养溶杆菌SCSIO 17111的菌液， 然后菌液接种到需要固沙的 区域。 0011 进一步优选， 所述的培养溶杆菌SCSIO 17111的菌液是用TSB培养基培养溶杆菌 SCSIO 17111， 获得菌液， 所述的TSB培养基为： 胰蛋白胨17.0g/L， 大豆蛋白胨3.0g/L， 葡萄 糖2.5g/L， 氯化钠5.0g/L， K2HPO42.5g/L， 溶剂为水， pH7.30.2。 0012 本发明所提供的溶杆菌SCSIO 17111可以使沙粒团聚并保持相对稳定的状。
13、态， 从 而起到固沙的效果， 可以应用于防治干旱、 半干旱地区沙漠化和岛礁生物土壤结皮的构建。 相较于物理固沙、 化学固沙和植被的培植， 利用微生物结皮固沙作为新型固沙方式， 具有适 应性强、 成本低、 见效快等优势。 本发明首次公开了对溶杆菌固沙能力的定性定量研究。 0013 本发明的溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111于2017年8月18日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3 号， 中国科学院微生物研究所， 保藏编号： CGMCC No.14537。 附图说明： 0014 图1是菌株SCSIO 17。
14、111对粒径小于1.25mm且大于0.2mm的无菌珊瑚沙的固沙效 果。 0015 图2是菌株SCSIO 17111对粒径小于0.2mm的无菌珊瑚沙的固沙效果。 说明书 2/4 页 4 CN 108795807 A 4 具体实施方式： 0016 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0017 实施例1： 溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111的分离 0018 1.样品采集 0019 生物土壤结皮样品于2016年11月采自中国南海岛礁。 样品采集后， 迅速装入无菌 的聚乙烯采样袋中， 阴干， 保存于室温。 0020 2.分离培养基 0021 分离培养基为。
15、TSA(胰蛋白大豆琼脂)培养基： 市售产品(BD)， 胰蛋白胨15.0g/L， 大 豆蛋白胨5.0g/L， 氯化钠5.0g/L， 琼脂15.0g/L， 溶剂为水， pH7.30.2。 其配制方法是将上 述组分按其含量混合均匀， 调pH值至pH7.30.2， 灭菌消毒即得。 0022 3.菌株的分离筛选 0023 将结皮样品进行充分研磨并混匀， 然后取2g置于装有18ml无菌去离子水的锥形瓶 中， 锥形瓶中放有一些已灭菌的小玻璃珠， 30、 200r/min振荡摇匀30min， 静置1min后取 1ml的样品悬液进行梯度稀释， 分别取200 l原液及稀释10倍、 100倍、 1000倍、 100。
16、00倍、 100000倍、 1000000倍的样品涂布于分离培养基上， 每一处理设3个重复。 30培养2-4天， 根 据菌落的形态， 从平板上挑出单菌落， 并在新鲜的培养基上进行四区划线纯化。 由此分离纯 化获得菌株SCSIO 17111。 0024 对菌株SCSIO 17111使用EasyPure Bacteria Genomic DNAKit(全式金)进行基因 组DNA抽提， 然后用通用引物27F/1492R扩增16S rRNA基因片段并测序， 其序列如SEQ ID No.1所示。 对16S rRNA基因序列通过EZBioCloud网站的在线比对， 发现与其亲缘关系最近 的是菌株PB-62。
17、50T， 菌种名为Lysobacterfirmicutimachus， 相似度为99.78。 因此， 本发 明的菌株SCSIO 17111属于溶杆菌Lysobacter属， 将其命名为溶杆菌(Lysobacter sp.) SCSIO 17111， 该菌于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(CGMCC)， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 保藏编号： CGMCC No.14537。 0025 本发明的 溶杆菌 (Lysobacter sp .) SCSIO 17111与现有技术中的 Lysobacterfirmicutima。
18、chus PB-6250T具有很多区别， 如Lysobacterfirmicutimachus PB-6250T在42不生长， 以及没有记录可在10生长， 但是本发明的溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111能在42和10下生长， 同时本发明的溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111的最适生长温度是28-32， 而Lysobacterfirmicutimachus PB-6250T的最适生长温 度是25-28。 L.firmicutimachus PB-6250T仅能在NaCl浓度(w/v)小于等于0.5时生长， 而本发明的溶杆菌(Lysobacter 。
19、sp.)SCSIO 17111可在NaCl浓度(w/v)为1时生长； 此外， 目前未见Lysobacter属已知种固沙效果相关介绍， 而本发明的这一新菌株具有固沙效果， 因此本发明的溶杆菌(Lysobacter sp.)SCSIO 17111是Lysobacter属的一个新株。 0026 实施例2： 溶杆菌SCSIO 17111胞外多糖产量的测定 0027 将溶杆菌SCSIO 17111接种于TSB培养基(BD)中， 培养基成分为胰蛋白胨17.0g/L， 大豆蛋白胨3.0g/L， 葡萄糖2.5g/L， 氯化钠5.0g/L， K2HPO42.5g/L， 溶剂为水， pH7.30.2， 其 配制方。
20、法是将上述成分按其含量混合均匀， 调pH值， 然后再灭菌即得。 30、 180r/min条件 说明书 3/4 页 5 CN 108795807 A 5 下， 培养45h。 将培养液经11603g离心20min去除菌体， 然后将上清液再通过0.22 m的滤膜过 滤， 充分去除残余的微生物细胞。 接着将滤液倒入试管中， 加入4倍体积的体积分数95乙 醇水溶液， 4沉淀过夜。 然后将混合液经2057g离心20min， 去除上清液， 收集沉淀物。 所获 得的沉淀物经丙酮、 无水乙醇依次洗涤， 洗涤后的沉淀然后再加入体积分数为80的三氯 乙酸4ml， 用于去除蛋白质。 最后将液体除去， 将沉淀物置于烘箱。
21、中60干燥30h， 获得胞外 多糖样品。 0028 采用苯酚-硫酸法对胞外多糖样品进行多糖含量的测定。 首先制作单糖标准曲线： 准确称取葡萄糖(分析纯)10mg于50ml烧杯中， 加去离子水充分溶解， 并将水溶液倒入250ml 容量瓶中， 加去离子水定容， 分别吸取0.2ml、 0.3ml、 0.4ml、 0.5ml、 0.6ml、 0.7ml、 0.8ml于试 管中， 各补水至1.0ml。 然后加入6苯酚0.5ml及浓硫酸(分析纯， 95.5)2.5ml， 静置 10min， 摇匀， 室温放置20min后用分光光度计于490nm测吸光度， 以1.0ml去离子水按同样显 色操作为空白对照。 横。
22、坐标为葡萄糖质量， 纵坐标为光吸收值， 绘制标准曲线。 然后将制备 的溶杆菌SCSIO 17111的胞外多糖样品重新溶于与原菌株培养液等体积的去离子水中， 制 成溶液。 从样品溶液中移取0.8ml放进试管中， 然后加水补至1.0ml。 然后加入6苯酚0.5ml 及浓硫酸(分析纯， 95.5)2.5ml， 静置10min， 摇匀， 室温放置20min后利用分光光度计在 490nm下测吸光度， 以1.0ml去离子水按同样显色操作为空白对照， 测出吸光度， 根据标准曲 线计算出多糖含量。 检测结果表明溶杆菌SCSIO 17111用TSB培养基培养45h， 其胞外多糖产 量为0.080.01mg/ml。
23、。 0029 实施例3： 溶杆菌SCSIO 17111固沙能力的测定 0030 将珊瑚沙依次过16目(筛孔1.25mm)和80目(筛孔0.20mm)筛具， 分别获得粒径小于 1.25mm且大于0.20mm的珊瑚沙和粒径小于0.20mm的珊瑚沙， 将其分别装于不同的培养皿 中， 每种规格沙质均做3个重复， 然后将其121灭菌25min， 置于烘箱中60烘干并拌至松 散均匀。 将溶杆菌SCSIO 17111接种于TSB培养基(同实施例2)中， 30、 180r/min条件下， 振 荡培养48h后， 将菌液装于无菌的小喷壶中， 均匀的喷洒于珊瑚沙上， 以灭菌的TSB培养基为 空白对照。 于30， 培。
24、养55天后， 对结皮的厚度进行测量。 检测结果表明溶杆菌SCSIO 17111 能够有效地促进结皮的形成， 当培养液均匀的喷洒在粒径小于1.25mm且大于0.20mm的无菌 珊瑚沙上时， 形成的结皮厚度为6.001.32mm(图1)； 当培养液均匀的喷洒在粒径小于 0.20mm的无菌珊瑚沙上时， 形成的结皮厚度为2.330.58mm(图2)。 虽然后者的结皮厚度不 如前者， 但是后者的土壤团聚物稳定性更强， 即对土壤团聚物进行干筛时， 后者的团聚物能 保持较好的稳定性， 而前者更易破碎。 而作为对照的TSB培养基喷洒到珊瑚沙后， 两种粒径 大小的珊瑚沙都没有结皮。 由此可见， 本发明所提供的溶。
25、杆菌SCSIO 17111可以使沙粒团聚 并保持相对稳定的状态， 从而起到固沙的效果， 可以应用于防治干旱、 半干旱地区沙漠化和 岛礁生物土壤结皮的构建。 相较于物理固沙、 化学固沙和植被的培植， 利用微生物结皮固沙 作为新型固沙方式， 具有适应性强、 成本低、 见效快等优势。 说明书 4/4 页 6 CN 108795807 A 6 序列表 中国科学院南海海洋研究所 一株产胞外多糖可固沙的溶杆菌SCSIO 17111及其应用 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 1390 DNA 溶杆菌SCSIO 17111(Lysobacter sp.) 1 atgcagtcga acg。
26、gcagcac agaggagctt gctccttggg tggcgagtgg cggacgggtg 60 aggaatacgt cggaatctgc ctatttgtgg gggataacgt agggaaactt acgctaatac 120 cgcatacgac ctacgggtga aagtggggga ccgcaaggcc tcacgcagat agatgagccg 180 acgtcggatt agctagttgg cggggtaaag gcccaccaag gcgacgatcc gtagctggtc 240 tgagaggatg atcagccaca ctggaactga ga。
27、cacggtcc agactcctac gggaggcagc 300 agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa 360 ggccttcggg ttgtaaagca cttttgtccg gaaagaaaag cttagggtta ataaccttga 420 gtcatgacgg taccggaaga ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgaagggtgc aagcgttact cggaattact gggcgtaaag cgtgcgtagg 。
28、tggtttgtta 540 agtctgatgt gaaagccctg ggctcaacct gggaatggca ttggaaactg gcttactaga 600 gtgcggtaga gggtagcgga attcccggtg tagcagtgaa atgcgtagat atcgggagga 660 acatccgtgg cgaaggcggc tacctggacc agcactgaca ctgaggcacg aaagcgtggg 720 gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatgcgaa ctggatgttg 780 ggggc。
29、aactt ggccctcagt atcgaagcta acgcgttaag ttcgccgcct gggaagtacg 840 gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagtatgtgg 900 tttaattcga tgcaacgcgc agaaccttac ctggccttga catccacgga actttccaga 960 gatggattgg tgccttcggg aaccgtgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020 tcgtgagatg ttgggttaag tc。
30、ccgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgccagcac 1080 gtaatggtgg gaactctaag gagaccgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140 tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgta ctacaatggt agggacagag 1200 ggctgcaaac ccgcgagggc aagccaatcc cagaaaccct atctcagtcc ggattggagt 1260 ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt 1320 gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttt gttgcaccag 1380 aagcaggtag 1390 序列表 1/1 页 7 CN 108795807 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 108795807 A 8 。