利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇和生物乙醇的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810605666.8 (22)申请日 2018.06.13 (71)申请人 冯国青 地址 311400 浙江省杭州市富阳区春江街 道春江工业功能区裕丰村23号杭州茂 益环保科技有限公司 (72)发明人 冯国青应鹏欢方彦钟银珊 应建航 (51)Int.Cl. C12P 39/00(2006.01) C12P 7/10(2006.01) C12P 7/16(2006.01) C12R 1/685(2006.01) C12R 1/885(2006.01) C12R 1/145(。

2、2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生物丁 醇和生物乙醇的方法 (57)摘要 本发明属于发酵技术领域， 公开了利用玉米 秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇和生物乙醇 的方法， 其包括如下步骤： 步骤1） 处理秸秆， 步骤 2） 制备发酵培养基， 步骤3） 产醇。 本发明原料成 本低廉， 产醇效率高。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 108588166 A 2018.09.28 CN 108588166 A 1.利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇和生物乙醇的方法， 其包括如下步骤： 步骤1） 处理秸秆， 步骤2） 。

3、制备发酵培养基， 步骤3） 产醇。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤： 步骤1） 处理秸秆： 首先将玉米秸秆粉碎至5cm以内， 置于压力1.5-2MPa、 停留时间10- 15min的条件下进行蒸汽爆破预处理， 然后进行爆破； 将经过蒸汽爆破处理的玉米秸秆过50 目筛， 收集筛下物， 然后将筛下物添加到1.5-2倍重量的水中， 加热至60， 保温条件下 100rpm搅拌90min， 然后加热至121， 保温10min， 自然冷却至室温， 得到培养液； 步骤2） 制备发酵培养基： 将康氏木霉种子液和黑曲霉种子液按照2-3:1-2的体积比混 合， 然后按照6-8%。

4、的接种量接种到培养液中， 培养96h， 培养时控制搅拌速度为100rpm， 培养 温度为32， 通过流加氨水控制培养过程的pH为4-5； 培养完成后， 超声处理， 再调整温度为 55， 添加溶菌酶， 保温条件下， 酶解12小时； 然后121灭酶5min， 最后自然冷却至室温， 即 得发酵培养基； 步骤3） 产醇： 将丙酮丁醇梭菌种子液接入到含有发酵培养基得厌氧发酵罐中进行培 养， 温度为30-32， 培养时间为24-36h， 然后接种粗糙脉孢菌种子液， 继续培养48-72h， 培 养结束后， 取发酵液， 以8000rpm离心10min， 收集上层液体。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在。

5、于， 所述康氏木霉种子液的密度为1108cfu/ mL。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述黑曲霉种子液的密度为1108cfu/mL。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述超声的处理时间为40min， 超声的频率 为30KHz。 6.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述溶菌酶的添加量为2万U： 1L溶液。 7.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述丙酮丁醇梭菌种子液的接种量为5- 7。 8.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述粗糙脉孢菌种子液的接种量均为8- 10。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108588166 A 2 利用玉米。

6、秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇和生物乙醇的 方法 0001 技术领域 0002 本发明属于发酵技术领域， 具体涉及利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇 和生物乙醇的方法。 背景技术 0003 丁醇是无色液体， 有酒味， 与乙醇、 乙醚及其他多种有机溶剂混溶， 蒸气与空气形 成爆炸性混合物， 爆炸极限1.45-11.25 （体积） 。 主要用于制造邻苯二甲酸、 脂肪族二元酸及 磷酸的正丁酯类增塑剂， 它们广泛用于各种塑料和橡胶制品中， 也是有机合成中制丁醛、 丁 酸、 丁胺和乳酸丁酯等的原料。 生物丁醇是与生物乙醇相似的生物燃料。 其原料和生产工艺 与生物乙醇相似， 但生物丁醇的蒸汽压力低， 。

7、与汽油混合时对杂质水的宽容度大， 而且腐蚀 性较小， 与现有的生物燃料相比， 能够与汽油达到更高的混合比， 而无需对车辆进行改造。 0004 丁醇可采用与乙醇相似的发酵流程制取。 不过， 与乙醇相比， 丁醇生产的成本要高 得多， 也就是说， 生产丁醇需用较大的蒸发、 加热、 冷却等设施， 投资费用较高。 因此， 实现生 物丁醇商业化的关键是提高原料加工成丁醇的转化率， 加快转化过程。 这取决于高效生物 催化剂的开发和生产工艺设计的优化。 同乙醇一样， 生物丁醇传统生产方法也会消耗大量 农产品， 为此， 正在研究利用多种生物基废料生产丁醇的新技术， 解决与人争粮的问题。 传 统的生物丁醇的制备方。

8、法是以玉米、 麦类、 大豆等谷物粮食为原料通过发酵制备而成的。 但 以粮食为原料生产生物燃料不仅不能满足社会需求， 而且会危及粮食安全。 有研究人员指 出， 即使美国种植的所有玉米和大豆都用于生产生物能源， 也只能分别满足美国社会汽油 需求的12和柴油需求的6。 而玉米和大豆首先要满足粮食、 饲料和其他经济需求， 不可 能都用来生产生物燃料。 专家表示， 以非粮作物为原材料生产生物丁醇是未来发展的方向， 将来能源行业可望使用作物纤维素， 如谷物秸秆来生产生物丁醇。 目前， 生物丁醇产业还处 于初级阶段。 近年来， 由于石油价格不断攀升， 不少有战略眼光的企业参与了生物丁醇的研 究。 0005 。

9、生物乙醇是指通过微生物的发酵将各种生物质转化为燃料酒精。 它可以单独或与 汽油混配制成乙醇汽油作为汽车燃料。 目前的工业化生产的燃料乙醇绝大多数是以粮食作 物为原料的， 从长远来看具有规模限制和不可持续性。 以木质纤维素为原料的第二代生物 燃料乙醇是决定未来大规模替代石油的关键。 0006 中国专利 “CN102796692A” 公开了一种对丙酮丁醇梭菌进行基因改造， 能够更高效 地利用木糖和阿拉伯糖， 更高浓度的丁醇、 乙醇以及丙酮等溶剂。 中国专利 “CN103409470A” 公开了采用先接种丙酮丁醇梭菌后接种酵母菌， 混合发酵生产丁醇、 乙醇以及丙酮的方法。 0007 玉米秸秆属于农业。

10、废弃， 大多被随意丢弃或者焚烧， 但是焚烧会造成环境污染， 已 经被国家明令禁止， 目前， 很多企业在研究玉米秸秆的利用方法。 由于原玉米秸秆中纤维 说明书 1/5 页 3 CN 108588166 A 3 素、 半纤维素和木质素致密复杂的结构， 纤维素较难被酶水解成单糖， 如何对玉米秸秆进行 处理以利于菌株发酵生产乙醇是我们研究的方向。 利用木质纤维素等生物质发酵丁醇已成 为当前研究的一个热点。 选择产醇菌进行改进和配伍， 以提高醇产率是一个突破口。 发明内容 0008 本发明的目的是解决现有技术中秸秆利用困难、 生物发酵产醇成本高以及效率低的缺 陷， 提供了利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生。

11、物丁醇和生物乙醇的方法。 0009 本发明是通过如下技术方案来实现的： 利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇和生物乙醇的方法， 其包括如下步骤： 步 骤1） 处理秸秆， 步骤2） 制备发酵培养基， 步骤3） 产醇。 0010 进一步地， 所述方法包括如下步骤： 步骤1） 处理秸秆： 首先将玉米秸秆粉碎至5cm以内， 置于压力1.5-2MPa、 停留时间10- 15min的条件下进行蒸汽爆破预处理， 然后进行爆破； 将经过蒸汽爆破处理的玉米秸秆过50 目筛， 收集筛下物， 然后将筛下物添加到1.5-2倍重量的水中， 加热至60， 保温条件下 100rpm搅拌90min， 然后加热至121， 保。

12、温10min， 自然冷却至室温， 得到培养液； 步骤2） 制备发酵培养基： 将康氏木霉种子液和黑曲霉种子液按照2-3:1-2的体积比混 合， 然后按照6-8%的接种量接种到培养液中， 培养96h， 培养时控制搅拌速度为100rpm， 培养 温度为32， 通过流加氨水控制培养过程的pH为4-5； 培养完成后， 超声处理， 再调整温度为 55， 添加溶菌酶， 保温条件下， 酶解12小时； 然后121灭酶5min， 最后自然冷却至室温， 即 得发酵培养基； 步骤3） 产醇： 将丙酮丁醇梭菌种子液接入到含有发酵培养基得厌氧发酵罐中进行培 养， 温度为30-32， 培养时间为24-36h， 然后接种粗糙。

13、脉孢菌种子液， 继续培养48-72h， 培 养结束后， 取发酵液， 以8000rpm离心10min， 收集上层液体。 0011 优选地， 所述康氏木霉种子液的密度为1108cfu/mL。 0012 优选地， 所述黑曲霉种子液的密度为1108cfu/mL。 0013 优选地， 所述超声的处理时间为40min， 超声的频率为30KHz。 0014 优选地， 所述溶菌酶的添加量为2万U： 1L溶液。 0015 优选地， 所述丙酮丁醇梭菌种子液的接种量为5-7。 0016 优选地， 所述粗糙脉孢菌种子液的接种量均为8-10。 0017 本发明实施方式选用的具体菌株为康氏木霉ATCC18649， 黑曲霉。

14、ATCC1015， 丙酮丁 醇梭菌ATCC824， 粗糙脉孢菌ATCC44317； 各菌株的种子液可以按照教科书或文献记载得常 规培养方式获得。 说明书 2/5 页 4 CN 108588166 A 4 0018 与现有技术相比， 本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面： 本发明在制备发酵培养基的工艺中， 采用超声辅助溶菌酶对菌体进行破壁处理， 破壁 效果好， 避免采用有机溶剂对后续菌株生长造成影响； 蒸汽爆破预处理使半纤维素和木质素部分降解， 且破坏了木质素与半纤维素对纤维素 的包裹作用， 使纤维素的结晶区受到破坏， 原料的孔隙率和内表面积增大， 因而更有利于后 续纤维素的酶水解作。

15、用进行。 0019 本发明对农业废弃物秸秆进行了粉碎和爆破处理， 可以为康氏木霉和黑曲霉提供 正常的生长条件， 原料相对低廉， 能够降低企业成本； 采用康氏木霉和黑曲霉处理玉米秸 秆， 然后酶解菌体， 得到含有还原糖和菌体蛋白的培养基， 供后续的菌株厌氧产醇使用， 提 高了发酵效率， 并且利用了农业废弃物， 降低了成本。 本发明利用超声波的空化作用， 产生 局部高压高温， 对菌体细胞进行冲击， 导致细胞变形和破裂， 利用溶菌酶辅助进行破壁溶解 获得菌体蛋白， 制备的菌体蛋白液浓度高， 适合厌氧发酵， 并且降低了成本。 0020 康氏木霉发酵产内切葡聚糖酶活力较高， 但所产的纤维素酶中普遍存在 。

16、-葡萄糖 苷酶活力低的缺陷， 而黑曲霉产 -葡萄糖苷酶能力较高， 产内切和外切葡聚糖酶能力较低。 将二者进行协同发酵秸秆， 滤纸酶和 -葡萄糖苷酶的活性均大幅提高， 发酵液中的还原糖 产量也相应提高。 纤维素经过水解后产生以葡萄糖为主的六碳糖， 而半纤维素水解后得到 以木糖为主的五碳糖， 但是五碳糖较难以被微生物利用产醇， 本发明选择可以利用葡萄糖 的丙酮丁醇梭菌用来产丁醇和乙醇， 而采用粗糙脉孢菌利用木糖产乙醇； 首先接种丙酮丁 醇梭菌可以利用葡萄糖发酵产醇， 但是不能利用木糖， 待葡萄糖降低到一定浓度时， 此时丙 酮丁醇梭菌已经是优势菌群， 接入粗糙脉孢菌， 其可以利用高浓度的木糖产乙醇，。

17、 而不会与 丙酮丁醇梭菌竞争利用葡萄糖， 二者可以协同发酵， 共同产生丁醇和乙醇。 附图说明 0021 图1： 不同菌株的产酶活性； 图2： 不同菌株发酵方式对产醇量的影响； 图3： 混合发酵时间对产醇量的影响。 具体实施方式 0022 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发 明。 本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发 明内容、 精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合， 来实现和应 用本发明技术。 为了进一步理解本发明。

18、， 下面结合实施例对本发明进行详细说明。 0023 实施例1 利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇和生物乙醇的方法， 其包括如下步骤： 首先将玉米秸秆粉碎至5cm以内， 然后置于压力1.5MPa、 停留时间15min的条件下进行 蒸汽爆破预处理， 然后进行爆破； 将经过蒸汽爆破处理的玉米秸秆过50目筛， 收集筛下物， 然后将筛下物添加到2倍重量的水中， 加热至60， 保温条件下100rpm搅拌90min， 然后加热 至121， 保温10min， 自然冷却至室温， 得到培养液； 说明书 3/5 页 5 CN 108588166 A 5 将康氏木霉种子液 （密度为1108cfu/mL） 和黑曲霉。

19、种子液 （密度为1108cfu/mL） 按 照2:1的体积比混合， 然后按照6-8%的接种量接种到培养液中， 培养96h， 培养时控制搅拌速 度为100rpm， 培养温度为32， 通过流加氨水控制培养过程的pH为5； 培养完成后， 超声处理 40min， 超声频率为30KHz， 再调整温度为55， 添加溶菌酶， 溶菌酶的添加量为2万U： 1L溶 液， 保温条件下， 酶解12小时； 然后121灭酶5min， 最后自然冷却至室温， 即得发酵培养基； 将丙酮丁醇梭菌种子液 （密度为3108cfu/mL） 按照7 （体积比） 的接种量接入到含有 发酵培养基的厌氧发酵罐中进行培养， 温度为32， 培养时。

20、间为36h， 然后接种粗糙脉孢菌 种子液 （密度为3108cfu/mL） ， 接种量均为10 （体积比） ； 继续培养72h， 发酵结束后， 取发 酵液， 以8000rpm离心10min， 收集上层液体， 然后气相色谱检测液体中丁醇和乙醇的含量。 0024 实施例2 利用玉米秸秆为主要原料发酵生产生物丁醇和生物乙醇的方法， 其包括如下步骤： 首先将玉米秸秆粉碎至5cm以内， 然后置于压力2MPa、 停留时间10min的条件下进行蒸 汽爆破预处理， 然后进行爆破； 将经过蒸汽爆破处理的玉米秸秆过50目筛， 收集筛下物， 然 后将筛下物添加到1.5倍重量的水中， 加热至60， 保温条件下100rp。

21、m搅拌90min， 然后加热 至121， 保温10min， 自然冷却至室温， 得到培养液； 将康氏木霉种子液 （密度为1108cfu/mL） 和黑曲霉种子液 （密度为1108cfu/mL） 按 照3:2的体积比混合， 然后按照6-8%的接种量接种到培养液中， 培养96h， 培养时控制搅拌速 度为100rpm， 培养温度为32， 通过流加氨水控制培养过程的pH为4.5； 培养完成后， 超声处 理40min， 超声频率为30KHz， 再调整温度为55， 添加溶菌酶， 溶菌酶的添加量为2万U： 1L溶 液， 保温条件下， 酶解12小时； 然后121灭酶5min， 最后自然冷却至室温， 即得发酵培养基。

22、； 将丙酮丁醇梭菌种子液 （密度为2108cfu/mL） 按照7 （体积比） 的接种量接入到含有 发酵培养基的厌氧发酵罐中进行培养， 温度为30， 培养时间为24h， 然后接种粗糙脉孢菌 种子液 （密度为2108cfu/mL） ， 接种量均为10 （体积比） ； 继续培养72h， 发酵结束后， 取发 酵液， 以8000rpm离心10min， 收集上层液体， 然后气相色谱检测液体中丁醇和乙醇的含量。 0025 实施例3 爆破对玉米秸秆主要成分的变化， 具体见表1： 表1 指标爆破前爆破后 半纤维素和纤维素%61.248.9 木质素%22.715.6 低聚木糖%06.9 纤维低聚糖03.1 结论：。

23、 爆破造成秸秆细胞壁破坏， 部分半纤维素和纤维素降解而溶出,有利于后续纤维 素酶对纤维素的酶解； 爆破预处理过程中纤维素结晶度和聚合度下降,半纤维素通过自水 解作用降解成木糖等， 可作为菌株的碳源。 0026 实施例4 以实施例1为例， 检测了单独菌株和复合菌株处理秸秆的方式对产酶活性的影响， 具体 产酶活性如图1所示， 康氏木霉发酵产滤纸酶活力较高， 但所产的纤维素酶中存在 -葡萄糖 苷酶活力低的缺陷， 而黑曲霉产 -葡萄糖苷酶能力较高， 产滤纸酶能力较低， 将二者进行协 说明书 4/5 页 6 CN 108588166 A 6 同发酵秸秆， 滤纸酶和 -葡萄糖苷酶的活性均大幅提高， 酶活力。

24、分别可达到357U/ml和 395U/ml。 0027 本发明发酵培养基的主要成分如表2所示： 表2 组分六糖含量g/l五糖含量g/l蛋白含量g/l 康氏木霉51.833.417.1 黑曲霉39.226.813.9 混合发酵73.645.721.4 如表2所示， 本发明发酵培养基中六糖和五塘含量丰富， 蛋白含量超过20g/L， 可以作为 丙酮丁醇梭菌和粗糙脉孢菌厌氧发酵的碳源和碳源来使用。 0028 实施例5 不同菌株发酵产醇方式对产醇量的影响： 以实施例1作为实验组， 设置对照组， 其中对照组1： 仅采用丙酮丁醇梭菌， 发酵时间为 108h； 对照组2： 仅采用粗糙脉孢菌， 发酵时间为108。

25、h； 对照组3： 同时接种两种菌株， 发酵时 间为108h。 如图2所示， 实验组的丁醇含量最高， 对照组3的乙醇含量最高， 但是丁醇产量较 低， 可能是因为粗糙脉孢菌容易对丙酮丁醇梭菌产生六糖碳源竞争， 不利于产丁醇的丙酮 丁醇梭菌； 实验组的乙醇产量与对照组3的差距并不明显， 综合丁醇和乙醇的发酵产率， 实 验组的产醇性能最佳。 如图3所示， 随着混合发酵时间的增加， 丁醇和乙醇均明显增加， 24h 后， 丁醇增幅明显降低， 而乙醇增幅明显， 发酵时间选择48-72h对产醇性能最佳。 0029 最后应说明的是： 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对 前述实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些 修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。 说明书 5/5 页 7 CN 108588166 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 8 CN 108588166 A 8 。