一种用于检测沙门氏菌的显色培养基及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810516950.8 (22)申请日 2018.05.25 (71)申请人 无锡市赛微生物技术有限公司 地址 214000 江苏省无锡市北塘区光电新 材料科技园会北路28-95 (72)发明人 于瑞莉陈臣陈帅陈鹏飞 茆伟伟周锐 (74)专利代理机构 南京禹为知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 32272 代理人 王晓东 (51)Int.Cl. C12Q 1/10(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测沙门氏菌的显色培养基及。

2、其 制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测沙门氏菌的显 色培养基及其制备方法， 其包括， 基础培养基、 添 加剂， 所述添加剂包括酯酶显色底物， 所述酯酶 显色底物包括5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯及5-溴- 6-氯-3-吲哚-壬酯， 所述5-溴-6-氯-3-吲哚-辛 酯含量为0.10.4g/L、 所述5-溴-6-氯-3-吲哚- 壬酯含量为0.10.4g/L。 本发明的显色培养基 各添加剂组分相互协同作用， 5-溴-6-氯-3-吲 哚-壬酯和5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯共同作为显 色底物， 协同促进更多酯酶反应的产生， 释放出 更多显色基团。 本发明的显色培养基用于检测沙 门氏菌具。

3、有灵敏度高， 特异性强， 辨识度更高、 检 测周期更短、 适应性更强， 易于产业化生产等优 点。 权利要求书1页 说明书16页 CN 108359707 A 2018.08.03 CN 108359707 A 1.一种用于检测沙门氏菌的显色培养基， 其特征在于： 包括， 基础培养基、 添加剂， 所述 添加剂包括酯酶显色底物， 所述酯酶显色底物包括5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯及5-溴-6-氯- 3-吲哚-壬酯， 所述5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯含量为0.10.4g/L、 所述5-溴-6-氯-3-吲哚- 壬酯含量为0.10.4g/L。 2.如权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基， 其特。

4、征在于： 所述基础培养基 包括蛋白胨、 牛肉膏、 氯化钠、 细菌琼脂粉， 其中， 所述蛋白胨含量为815g/L、 所述牛肉膏 含量为15g/L、 所述氯化钠含量为56g/L、 所述细菌琼脂粉含量为1518g/L。 3.如权利要求1或2所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基， 其特征在于： 所述添加剂 还包括抑制剂、 半乳糖苷酶显色底物、 酶诱导剂、 助溶剂， 其中， 所述抑制剂包括脱氧胆酸 钠、 新生霉素、 头孢磺啶钠盐水合物， 所述脱氧胆酸钠含量为0.40.6g/L、 所述新生霉素含 量为1015mg/L、 所述头孢磺啶钠盐水合物含量为510mg/L。 4.如权利要求3所述的用于检测沙门氏菌的显。

5、色培养基， 其特征在于： 所述半乳糖苷酶 显色底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷， 所述5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷含量为 0.040.1g/L。 5.如权利要求4所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基， 其特征在于： 所述酶诱导剂包 括异丙基- -D-硫代半乳糖苷， 所述异丙基- -D-硫代半乳糖苷的含量为0.030.06g/L。 6.如权利要求4或5所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基， 其特征在于： 所述助溶剂 包括二甲基亚砜、 吐温20， 所述二甲基亚砜含量为13ml/L、 所述吐温20含量为24ml/L。 7.如权利要求6所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基， 其特征在。

6、于： 所述助溶剂中， 二甲基亚砜体积含量为40、 吐温20体积含量为60。 8.如权利要求1、 2、 4、 5或7任一所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基， 其特征在于： 所述培养基包括蛋白胨10g/L、 牛肉膏3g/L、 氯化钠5g/L、 细菌琼脂粉15g/L、 脱氧胆酸钠 0.55g/L、 新生霉素15mg/L、 头孢磺啶钠盐水合物6mg/L、 5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.2g/L、 5- 溴-6-氯-3-吲哚-壬酯0.3g/L、 5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷0.08g/L、 异丙基- -D-硫代 半乳糖苷0.05g/L、 二甲基亚砜2ml/L、 吐温20为3ml/L。 9.。

7、权利要求38任一所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基的制备方法， 其特征在 于： 包括， 配制母液1： 称取基础培养基并与脱氧胆酸钠混匀， 作为母液1； 配制母液2： 将酯酶显色底物溶解于助溶剂中， 并加入母液1中， 煮沸， 作为母液2； 配制显色培养基： 将新生霉素、 头孢磺啶钠盐水合物溶于水中， 加入母液2中， 并将半乳 糖甘酶底物和异丙基- -D-硫代半乳糖苷加入母液2中。 10.如权利要求9所述的用于检测沙门氏菌的显色培养基的制备方法， 其特征在于： 所 述基础培养基并与脱氧胆酸钠混匀， 速度为2800rpm， 时间为1min， 所述配制母液2， 其中， 所 述煮沸后， 将所述母液2冷却。

8、至451， 将所述抑制剂加入母液2中。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108359707 A 2 一种用于检测沙门氏菌的显色培养基及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于微生物检测技术领域， 具体涉及一种用于检测沙门氏菌的显色培养基 及其制备方法。 背景技术 0002 沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的食源性致病菌， 肠杆菌科， 革兰氏阴性菌。 感 染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品， 可使人发生食物中毒。 据统计在世界各国的种 类细菌性食物中毒中， 沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。 我国内陆地区也以沙门氏菌为 首位。 0003 目前国内沙门氏菌检测中最常用的依然是传统国标。

9、方法。 国标方法常用的鉴定培 养基中以显色培养基选择性好等优点使用效果最佳。 沙门氏菌显色培养基是利用沙门氏菌 自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的新型培养基。 这些相应的显色底物是由产色 基因和微生物部分可代谢物质组成， 在特异性酶作用下， 游离出产色基因显示一定颜色， 直 接观察菌落颜色即可对菌种作出鉴定。 0004 目前国内某厂家沙门显色培养基常用的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷、 5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰- -D-氨基葡萄糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯， 其中 -半乳糖 苷目的是区分含 -半乳糖苷酶的肠杆菌属(如弗氏柠檬酸菌杆菌)， 氨基己糖苷酶显色底。

10、物 目的是区分念珠菌； 辛酯酶显色底物目的是区分沙门氏菌。 但是由于部分沙门氏菌(如伤寒 沙门氏菌和甲伤寒沙门氏菌等)的酯酶活力较弱， 其培养时间到达后， 呈色较淡， 不易观察。 发明内容 0005 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施 例。 在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部 分、 说明书摘要和发明名称的目的模糊， 而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。 0006 鉴于上述的技术缺陷， 提出了本发明。 0007 因此， 作为本发明的其中一个方面， 本发明克服现有技术中存在的不足， 提供一种 用于检测沙门氏菌的显色培养。

11、基。 0008 为解决上述技术问题， 本发明提供了如下技术方案： 一种用于检测沙门氏菌的显 色培养基， 其包括， 基础培养基、 添加剂， 所述添加剂包括酯酶显色底物， 所述酯酶显色底物 包括5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯及5-溴-6-氯-3-吲哚-壬酯， 所述5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯含 量为0.10.4g/L、 所述5-溴-6-氯-3-吲哚-壬酯含量为0.10.4g/L。 0009 作为本发明所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的一种优选方案： 所述基础培养 基包括蛋白胨、 牛肉膏、 氯化钠、 细菌琼脂粉， 其中， 所述蛋白胨含量为815g/L、 所述牛肉 膏含量为15g/L、 所述氯化钠含。

12、量为56g/L、 所述细菌琼脂粉含量为1518g/L。 0010 作为本发明所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的一种优选方案： 所述添加剂还 包括抑制剂、 半乳糖苷酶显色底物、 酶诱导剂、 助溶剂， 其中， 所述抑制剂包括脱氧胆酸钠、 说明书 1/16 页 3 CN 108359707 A 3 新生霉素、 头孢磺啶钠盐水合物， 所述脱氧胆酸钠含量为0.40.6g/L、 所述新生霉素含量 为1015mg/L、 所述头孢磺啶钠盐水合物含量为510mg/L。 0011 作为本发明所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的一种优选方案： 所述半乳糖苷 酶显色底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷， 所述。

13、5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷含量 为0.040.1g/L。 0012 作为本发明所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的一种优选方案： 所述酶诱导剂 包括异丙基- -D-硫代半乳糖苷， 所述异丙基- -D-硫代半乳糖苷的含量为0.030.06g/L。 0013 作为本发明所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的一种优选方案： 所述助溶剂包 括二甲基亚砜、 吐温20， 所述二甲基亚砜含量为13ml/L、 所述吐温20含量为24ml/L。 0014 作为本发明所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的一种优选方案： 所述助溶剂 中， 二甲基亚砜体积含量为40、 吐温20体积含量为60。 0015 作为本发明。

14、所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的一种优选方案： 所述培养基包 括蛋白胨10g/L、 牛肉膏3g/L、 氯化钠5g/L、 细菌琼脂粉15g/L、 脱氧胆酸钠0.55g/L、 新生霉 素15mg/L、 头孢磺啶钠盐水合物6mg/L、 5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯0.2g/L、 5-溴-6-氯-3-吲 哚-壬酯0.3g/L、 5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷0.08g/L、 异丙基- -D-硫代半乳糖苷 0.05g/L、 二甲基亚砜2ml/L、 吐温20为3ml/L。 0016 作为本发明的另一个方面， 本发明克服现有技术中存在的不足， 提供权利要求3 8任一所述的用于检测沙门氏菌的显色培。

15、养基的制备方法。 0017 为解决上述技术问题， 本发明提供了如下技术方案： 权利要求38任一所述的用 于检测沙门氏菌的显色培养基的制备方法， 其包括， 配制母液1： 称取基础培养基并与脱氧 胆酸钠混匀， 作为母液1； 配制母液2： 将酯酶显色底物溶解于助溶剂中， 并加入母液1中， 煮 沸， 作为母液2； 配制显色培养基： 将新生霉素、 头孢磺啶钠盐水合物溶于水中， 加入母液2 中， 并将半乳糖甘酶底物和异丙基- -D-硫代半乳糖苷加入母液2中。 0018 作为本发明所述用于检测沙门氏菌的显色培养基的制备方法的一种优选方案： 所 述基础培养基并与脱氧胆酸钠混匀， 速度为2800rpm， 时间为。

16、1min， 所述配制母液2， 其中， 所 述煮沸后， 将所述母液2冷却至451， 将所述抑制剂加入母液2中。 0019 本发明的有益效果： 本发明的显色培养基各添加剂组分相互协同作用， 5-溴-6- 氯-3-吲哚-壬酯和5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯共同作为显色底物， 协同促进更多酯酶反应的 产生， 释放出更多显色基团， 同时， 助溶剂的选择及配比使得本发明既不会出现由于乳化剂 过多使平板表面出现油状现象， 又可使底物完全溶解， 且助溶剂的协同作用使得本发明组 合酶显色底物的显色效果达到最佳。 0020 本发明的显色培养基用于检测沙门氏菌具有灵敏度高， 特异性强， 辨识度更高、 检 测周期更短。

17、、 适应性更强， 易于产业化生产等优点。 具体实施方式 0021 为使本发明的上述目的、 特征和优点能够更加明显易懂， 下面结合具体实施例对 本发明的具体实施方式做详细的说明。 0022 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明， 但是本发明还可以 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施， 本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的 说明书 2/16 页 4 CN 108359707 A 4 情况下做类似推广， 因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。 0023 其次， 此处所称的 “一个实施例” 或 “实施例” 是指可包含于本发明至少一个实现方 式中的特定特征、 结构或特性。 在本。

18、说明书中不同地方出现的 “在一个实施例中” 并非均指 同一个实施例， 也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。 0024 G+菌抑制剂的选择： 0025 本发明的显色培养基基础以普通营养琼脂为基础， 通过添加抑制剂， 以完全排除 粪肠球菌等革兰氏阳性菌的干扰， 为了方便统计分析， 采用分数对应菌种在培养基的生长 情况和其他影响情况： 0026 0027 G+菌抑制剂最适添加量的选择： 0028 在 4789.28-2013培养基和试剂的质量要求 6.1.2.2中为定量评估培养基的选择 性， 应按照规定以适当方法将适量测试菌株的工作培养物接种至选择性培养基和参考培养 基中。 本专利以。

19、普通营养琼脂为基础， 通过添加不同剂量的添加剂， 制备平板后， 按照 4789.28-2013培养基和试剂的质量要求 6.1.2.2中半定量划线方法测定抑制剂对革兰氏 阳性菌的选择性。 测试菌为： 金黄色葡萄球菌ATCC6538和粪肠球菌ATCC29212， 观察其受抑 制情况。 0029 变形杆菌最适抑制剂的选择： 0030 变形杆菌由于具有鞭毛， 在平板上易蔓延生长， 且对沙门的检测亦有干扰， 故寻找 出可抑制其生长的添加剂。 将不同的抑制剂加入基础培养基中， 按照 4789.28-2013培养基 和试剂的质量要求 6.1.2.2中半定量划线方法测定抑制剂对变形杆菌的选择性。 培养后按 以。

20、下方法对培养基计算生长指数G。 每条有比较稠密菌落生长， G1； 仅一半的线有稠密菌 落生长， G0.5； 划线上没有菌落生长、 生长量少于划线的一半或菌落生长微弱， G0； 记录 每个平板的得分总和便得到G。 0031 变形杆菌抑制剂最佳浓度的选择： 0032 以普通营养琼脂为基础， 通过添加不同剂量的添加剂， 制备平板后， 按照 4789.28-2013培养基和试剂的质量要求 6.1.2.2中半定量划线方法测定抑制剂对革兰氏 阳性菌的选择性。 测试菌为： 普通变形杆菌CMCC49027和奇异变形杆菌CMCC49005， 观察其受 抑制情况。 0033 铜绿假单胞菌最适抑制剂的选择： 003。

21、4 由于铜绿假单胞菌亦具有酯酶， 其对沙门氏菌的选择具有干扰性， 故沙门氏显色 培养基中需加入可抑制此类菌的抑制剂。 将不同的抑制剂加入基础培养基中， 按照 说明书 3/16 页 5 CN 108359707 A 5 4789.28-2013培养基和试剂的质量要求 6.1.2.2中半定量划线方法测定抑制剂对变形杆 菌的选择性。 0035 铜绿假单胞菌抑制剂最佳浓度的选择： 0036 以普通营养琼脂为基础， 通过添加不同剂量的添加剂， 制备平板后， 按照 4789.28-2013培养基和试剂的质量要求 6.1.2.2中半定量划线方法测定抑制剂对革兰氏 阳性菌的选择性。 测试菌为： 铜绿假单胞菌A。

22、TCC9027， 观察其受抑制情况。 0037 结果分析： 0038 G+菌抑制剂的选择 0039 抑制剂对不同指示菌的抑制能力和其他性能结果如下表： 0040 0041 *注： 各抑制剂的添加量参考部分商业培养基成分表 0042 十二烷基磺酸钠、 三号胆盐和脱氧胆酸钠均可抑制革兰氏阳性菌， 由于十二烷基 磺酸钠为表面活性剂， 培养基中添加的底物为脂溶性， 故易在培养基内形成油滴， 影响酯酶 底物的溶解， 且考虑脱氧胆酸钠是胆盐中非常重要的一种,大量研究表明脱氧胆酸钠能够 使细胞膜稳定性下降,流动性增强,膜结构的有序性降低， 且可抑制菌丝体生长， 选择脱盐 胆酸钠作为革兰氏阳性菌抑制剂。 00。

23、43 不同抑制剂对变形杆菌抑制能力结果： 说明书 4/16 页 6 CN 108359707 A 6 0044 0045 *注： 各抑制剂的添加量参考部分商业培养基成分表 0046 根据上述结果， 柠檬酸铵、 硫代硫酸钠和结晶紫对变形杆菌的蔓延没有抑制作用， 新生霉素对普通变形杆菌CMCC49027和奇异变形杆菌CMCC49005的蔓延有抑制作用。 0047 不同浓度新生霉素对各种目标菌生长的影响： 0048 0049 说明书 5/16 页 7 CN 108359707 A 7 0050 由上表可见， 随着新生霉素含量的增加， 当超过20mg/L时， 四种目标菌被抑制强度 越来越大， 生长能力。

24、减弱， 不过铜绿假单胞菌对新生霉素灵敏度比较小。 只有当新生霉素浓 度为15mg/L时， 既不影响鼠伤寒沙门氏菌和大肠埃希氏菌的生长， 又能抑制干扰菌株奇异 变形杆菌的蔓延。 0051 不同抑制剂对铜绿假单胞菌生长的抑制能力： 0052 0053 *注： 各抑制剂的添加量参考部分商业培养基成分表 0054 有表中结果可以看出， 对铜绿假单胞菌无抑制能力， 头孢磺啶钠盐水合物有部分 抑制能力。 需进一步对头孢磺啶钠盐水合物的浓度进行研究。 0055 铜绿假单胞菌抑制剂最佳抑菌含量的确定： 0056 不同含量头孢磺啶钠盐水合物对指示剂的影响： 0057 说明书 6/16 页 8 CN 108359。

25、707 A 8 0058 0059 根据上表实验结果， 当头孢磺啶钠盐水合物大于10mg/L时， 铜绿假单胞菌受到抑 制， 可初步确定最适头孢磺啶钠盐水合物浓度范围在510mg/L 0060 510mg/L头孢磺啶钠盐水合物对指示剂的影响： 0061 0062 从上表可知， 确定头孢磺啶钠盐水合物浓度范围在6mg/L。 0063 实施例1： 0064 一种用于检测沙门氏菌的显色培养基， 每1000ml培养基含有培养基成分表如下： 0065 说明书 7/16 页 9 CN 108359707 A 9 0066 0067 称取基础培养基33g和脱氧胆酸钠0.55g加入1000ml水中混匀， 作为母。

26、液1。 辛酯酶 底物按照比例于助溶剂中完全溶解， 加入母液1中， 摇匀后煮沸溶解， 作为母液2， 冷却至45 1。 新生霉素和头孢磺啶钠盐水合物盐水合物于无菌水中充分溶解， 过滤除菌， 加入上 述煮沸冷却至451的母液2中； 半乳糖甘酶底物和异丙基- -D-硫代半乳糖苷分别于溶 剂中溶解， 过滤除菌后， 加入上述煮沸冷却至451母液2。 摇匀后倾入无菌平皿， 制备好 的平板于2-8避光保存。 0068 上述制备过程中， 2ml二甲基亚砜和3ml吐温20， 2800rpm震荡1min混匀后， 将辛酯 酶底物加入混合溶剂， 2800rpm震荡1min混匀， 完全溶解后加入母液1， 摇匀后煮沸。 此。

27、辛酯 酶底物具有热稳定性， 加入母液1后需加热煮沸， 若直接将此底物加入到冷却至451的 基础培养基中， 已溶解的底物易再次析出。 根据实施例1， 为保持抑制剂效用， 新生霉素和头 孢磺啶钠盐水合物盐水合物按照合适比例溶于无菌水中配成溶液， 过滤除菌， 加入煮沸冷 却至451母液2中。 0069 以不影响沙门氏菌和抑制革兰氏阳性菌生长为目标筛选， 进一步对变形杆菌、 沙 雷氏菌和铜绿假单胞菌进行抑菌实验， 本发明在十二烷基磺酸钠、 脱氧胆酸钠、 三号胆盐、 柠檬酸钠、 硫代硫酸钠、 结晶紫、 新生霉素、 哌拉西林钠、 头孢他啶、 庆大霉素、 环丙沙星、 头 孢磺啶钠盐水合物等抑制剂中， 最终确。

28、定本发明3种选择性添加剂， 分别是： 脱氧胆酸钠、 新 生霉素和头孢磺啶钠盐水合物。 本发明中， 脱氧胆酸钠可抑制革兰氏阳性菌和霉菌菌丝的 生长， 且可增加微生物的膜通透性； 新生霉素在不影响沙门氏菌和大肠杆菌的生长同时可 抑制变形杆菌的蔓延生长； 头孢磺啶钠盐水合物盐水合物可抑制假阳性菌铜绿假单胞菌的 生长。 0070 经试验证明， 40二甲基亚砜和60吐温20混溶后溶解辛酯酶底物， 既不会出现 由于乳化剂过多使平板表面出现油状现象， 又可使底物完全溶解， 且此种组合酶显色底物 的显色效果最佳。 实验证明， 每1000ml培养基含有脱氧胆酸钠0.55g时， 脱氧胆酸钠可抑制 革兰氏阳性菌和霉。

29、菌菌丝的生长， 且可增加微生物的膜通透性， 有利于代谢产物运输到膜 外。 实验证明， 每1000ml培养基含有新生霉素15mg时， 既不影响沙门氏菌和大肠杆菌的生长 又且可抑制变形杆菌的蔓延生长。 实验证明， 每1000ml培养基含有头孢磺啶钠盐水合物6mg 时， 既不影响沙门氏菌和大肠杆菌的生长又可抑制假阳性菌铜绿假单胞菌的生长。 0071 由于5-br-6-cl-3-吲哚-壬酯+5-br-6-cl-3-吲哚-辛酯为脂溶性， 难以溶解， 进而 影响显色效果， 故寻求适合其溶解并能更好呈色的助溶剂和溶解方式非常重要。 为了方便 统计分析， 采用分数评分对应菌种在培养基的显色情况。 说明书 8/。

30、16 页 10 CN 108359707 A 10 0072 0073 助溶剂和溶解方式的选择见下表： 0074 0075 0076 经过多次实验， 水浴加热溶解效果较差， 吐温水浴加热后可易溶解， 但是制备的平 板表面会有油状物， 其中采用吐温20溶解后的显色效果优于吐温80。 二甲基亚砜(DMSO)为 极性溶剂， 极易溶解酯酶底物， 但是显色效果较差， 后将两者结合， 先用DSMO溶解酯酶底物 然后在于吐温20混溶， 显色和溶解效果较好。 由于显色未达到最佳， 故进行二者比例配比最 佳实验， 结果如下： 说明书 9/16 页 11 CN 108359707 A 11 0077 0078 其。

31、中由于DMSO对细胞有损伤， 而Twin-20含量多使平板外观油状物较多， 当以40 DMSO和60Twin-20混合溶解底物时， 不仅溶解方便， 外观符合， 且显色效果最佳， 颜色为紫 红色。 0079 实施例2： 0080 一种用于检测沙门氏菌的显色培养基， 每1000ml培养基含有培养基成分表如下： 0081 0082 0083 称取基础培养基42g， 脱氧胆酸钠0.6g加入1000ml水中混匀， 煮沸溶解， 作为母液 说明书 10/16 页 12 CN 108359707 A 12 1。 辛酯酶底物按照比例与助溶剂中完全溶解， 加入母液1中， 摇匀后煮沸溶解， 作为母液2。 新生霉素和。

32、头孢磺啶钠盐水合物盐水合物于无菌水中充分溶解， 过滤除菌， 加入上述煮沸 冷却至451母液2中； 半乳糖甘酶底物和异丙基- -D-硫代半乳糖苷分别于溶剂中溶解， 过滤除菌后， 加入上述煮沸冷却至451母液2。 摇匀后倾入无菌平皿， 制备好的平板于2- 8避光保存。 0084 辛酯酶底物于20二甲基亚砜和80吐温20混合溶剂中完全溶解后加入却至45 1母液1。 0085 实施例3： 0086 一种用于检测沙门氏菌的显色培养基， 每1000ml培养基含有培养基成分表： 0087 0088 0089 称取基础培养基41g， 脱氧胆酸钠0.4g加入1000ml水中混匀， 作为母液1。 辛酯酶底 物按照。

33、比例与助溶剂中完全溶解， 加入母液1中， 摇匀后煮沸溶解， 作为母液2。 新生霉素和 头孢磺啶钠盐水合物盐水合物于无菌水中充分溶解， 过滤除菌， 加入上述煮沸冷却至451 母液2中； 半乳糖甘酶底物和异丙基- -D-硫代半乳糖苷分别于溶剂中溶解， 过滤除菌后， 加入上述煮沸冷却至451母液2。 摇匀后倾入无菌平皿， 制备好的平板于2-8避光保 存。 0090 辛酯酶底物于60二甲基亚砜和40吐温20混合溶剂中完全溶解后加入母液1， 摇匀后煮沸。 说明书 11/16 页 13 CN 108359707 A 13 0091 对比例1： 0092 特异性实验： 0093 根据实验证明， 实施例1为最。

34、佳实施例， 配制的平板为淡黄色半透明外观， 易于观 察。 将鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、 猪霍乱沙门氏菌ATCC 13312、 肠炎沙门氏菌ATCC13076、 乙型副伤寒沙门氏菌CM50094、 伤寒沙门氏菌CM50071、 甲型副沙门氏菌CM50093、 鸭沙门氏 菌ATCC9150、 大肠埃希氏菌ATCC25922、 阪崎肠杆菌ATCC25944、 弗氏柠檬酸杆菌ATCC43864、 铜绿假单胞菌ATCC9027、 福氏志贺氏菌CMCC51572、 宋氏志贺氏菌、 产气肠杆菌ATCC13048、 阴沟肠杆菌CMCC45301、 粘质沙雷伯菌CMCC41002、 普通变形杆菌CMCC。

35、49027、 奇异变形杆菌 CMCC49005、 金黄色葡萄球菌ATCC25923和粪肠球菌ATCC29212等20种标准菌株和5种收集到 蒙得维的亚沙门氏菌、 阿贡纳沙门氏菌、 纽波特沙门氏菌、 沙门氏菌1#和沙门氏菌2#的沙门 氏菌阳性菌株， 营养琼脂活化后， 分别划线接种到实施例1制成的沙门显色培养基上(简称 S2)、 和国内某厂家上， 37培养24h， 检测结果见表1。 0094 表1 S2显色培养基特异性检测结果以及显色时间的对比 说明书 12/16 页 14 CN 108359707 A 14 0095 0096 结果见表1， 特异性方面， 七株沙门氏菌标准菌株和五株阳性菌株在S2。

36、和国内某厂 说明书 13/16 页 15 CN 108359707 A 15 家显色平板上均生长良好， 阳性菌落为紫色， 在S2上紫色较国内厂家显色颜色鲜亮， 易观 察； 其中多种沙门氏菌在科玛嘉显色平板和国内厂家显色平板上显浅紫色， 而在S2上显紫 色； 在其他两种平板上显紫色的在S2平板上可显深紫色， 且可在更短时时间观看结果。 对于 酶活力强的沙门氏菌， 培养18h可在S2平板上呈现深紫色， 在国内某平板上培养24h才呈现 紫色； 对于酶活力稍弱的沙门氏菌同样培养24h后， 可在S2平板上呈现紫色， 但是在国内某 平板上只能呈现浅紫色。 培养时间和呈色实验更能证明S2平板更能促进酯酶底物。

37、的水解。 大肠杆菌和其他含有半乳糖甘酶的菌种在两种平板上呈现蓝绿色、 金黄色葡萄球菌和粪肠 球菌等菌落在这两种品牌培养基上均受抑制， 其它菌株为无色。 对沙门氏菌检测有干扰的 菌株主要铜绿假单胞菌和粘质沙雷氏菌等经特异性抑制剂均受到抑制。 0097 将有代表性及干扰性强的伤寒沙门氏菌CM50071、 普通变形杆菌CMCC49027、 大肠 埃希氏菌ATCC25922、 铜绿假单胞菌ATCC9027， 粪肠球菌ATCC29212制成混合菌悬液， 取一环 混合增菌液划线接种于S2和国内某厂家显色培养基平板上， 结果见表2。 0098 表2混合菌悬液在各品牌上的分离结果 0099 0100 由表2可。

38、知， S2和国内某厂家对于其它干扰杂菌都易分离， 平板上出现三种颜色的 菌落， 无色、 深紫色和蓝绿色； 其中在S2培养基上目标菌显色更易辨识， 尤其是显色慢的伤 寒沙门氏菌。 0101 对比例2： 0102 生长率： 0103 将鼠沙门氏菌ATCC14028和肠炎沙门氏菌ATCC13076制成适宜浓度的菌悬液(浓度 为108-109CFU/ml)， 取稀释度为10-5和10-6的菌悬液0.1ml均匀涂布于S21、 国内某厂家以及 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)上， 36培养24h。 取接种水平为20CFU200CFU的平板进行计数， 计算各自的生长率。 0104 表3显色培养基对沙门氏菌灵敏度和。

39、菌落形态的比较 0105 0106 由表3可知， S2和国内某厂家灵敏度都比较高， 鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌在 S2的生长率高于国内某厂家， 且远高于GB4789.28-2013中PR0.5的规定。 菌落大小方面， 说明书 14/16 页 16 CN 108359707 A 16 鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌在S2上的菌落直径大于在国内某厂家的菌落直径。 S2平板 更适宜沙门氏菌的生长。 0107 对比例3： 0108 人工污染样品中沙门氏菌的检测： 0109 1.菌种： 将鼠沙门氏菌ATCC14028接种营养肉汤中制成标准菌悬液， 制备含有目标 菌10CFU-100CFU和1-10CFU。

40、的菌悬液， 备用。 同时用TSA计数用。 0110 2.前增菌和后增菌： 称取乳粉样品25g， 加入225mlBPW增菌液中， 混合均匀。 将制备 好的菌悬液接种于此样品悬液中， 36培养8h-18h。 轻轻摇动培养过的样品混合物， 移取 1mL， 0111 3.接种培养： 各取一环培养后的增菌液， 四区划线接种于实施例1(简称S2)显色培 养基平板、 XLD、 HE和国内某厂家显色培养基上， 36培养1824h， 根据在划线区域生长情 况记录菌落颜色和形态， 见表4。 0112 表4 S2对人工污染样品的检测 0113 0114 0115 由表4可知， 沙门氏菌接种量越多， 划线生长区域越大。

41、， 接种量在1100CFU时， 4区 全部有目标菌生长， 但由于细菌对营养成分的竞争关系， XLD培养基上在第三、 四区才能出 现可区分的典型菌落。 在S2平板上， 菌落只要为紫色即为目标菌， 辨识度大， 易识别和检出； 接种量为1-10CFU时， XLD和S2都能3区生长， XLD在第三区出现典型菌落， S2在全部区间都可 出现紫红色菌落。 由此可见， S2在低污染区亦能检出沙门氏菌， 可达到1-10CFU的检出限， 与 国内某厂家检出限相当。 说明书 15/16 页 17 CN 108359707 A 17 0116 对比例4： 0117 实际样品中沙门氏菌的检测： 0118 1.采集样品。

42、 0119 从超市以及原料供应商处采集各种食品共139份。 0120 2.增菌培养 0121 称取样品25g， 加入225mlBPW增菌液中， 混合均匀， 36培养18h。 0122 3.接种培养 0123 取一环培养后的增菌液， 划线接种于实施例1制成的沙门显色培养基平板上， 37 培养18-24h， 观察菌落颜色和形态。 轻轻摇动培养过的样品混合物， 移取1mL， 转种于10mL TTB内， 于421培养18h24h； 同时， 另取1mL， 转种于10mL SC内， 于361培养18h 24h。 0124 4.结果观察和分析 0125 139份样品中有23份样品检出沙门氏菌， 同时使用GB。

43、4789.4-2010和API20E生化鉴 定系统检测比对样品， 与显色培养基结果一致， 两种方法检测结果均与预期结果一致。 0126 综上， 本发明在沙门显色培养基中首先添加了多种抑制剂， 不存在念珠菌的感扰； 添加孢磺啶钠盐水合物， 可避免含有酯酶活力易造成假阳性的铜绿假单胞菌的干扰， 但又 不会影响沙门氏菌和大肠杆菌的生长； 添加5-溴-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷， 可区分肠杆菌 属如大肠杆菌和含有 -半乳糖苷酶的大肠菌群。 0127 本发明以5-溴-6-氯-3-吲哚-壬酯和5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酯共同作为显色底物， 增加酶底物以促使更多酯酶反应的生产， 弥补部分沙门氏菌显色慢。

44、、 显色弱的缺点， 本发明 中， 沙门氏菌在酯酶的作用下水解显色底物， 释放出更多显色基团， 使菌落呈现出更明显的 特征色。 0128 可使沙门氏菌呈现更深的颜色深紫色， 且呈色更明显， 更快。 另外， 5-溴-6-氯- 3-吲哚-壬酯为一种含有新型底物， 具有纯度高、 易合成， 成本低和热稳定性等优点， 弥补了 酯酶底物大部分通过进口的限制。 本发明研究发现， 沙门氏菌除C8水平上的酯酶具有高度 一致性外亦含有C9酯酶(壬酯酶)， 可水解壬酯显色底物。 本发明在培养基中加入壬酯酶和 辛酯酶显色底物， 沙门氏菌都可水解底物生成显色醇类。 0129 本发明的显色培养基各添加剂组分相互协同作用， 。

45、5-溴-6-氯-3-吲哚-壬酯和5- 溴-6-氯-3-吲哚-辛酯共同作为显色底物， 协同促进更多酯酶反应的产生， 释放出更多显色 基团， 同时， 助溶剂的选择及配比使得本发明既不会出现由于乳化剂过多使平板表面出现 油状现象， 又可使底物完全溶解， 且助溶剂的协同作用使得本发明组合酶显色底物的显色 效果达到最佳。 0130 本发明的显色培养基用于检测沙门氏菌具有灵敏度高， 特异性强， 辨识度更高、 检 测周期更短、 适应性更强， 易于产业化生产等优点。 0131 应说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照较佳 实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术 方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发 明的权利要求范围当中。 说明书 16/16 页 18 CN 108359707 A 18 。