技术领域
本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定特异性标记及方法。
背景技术
苦瓜为雌雄同株异花作物，在苦瓜杂交种的制种过程中，母本人工去雄不及时或不彻底，母本的花粉就可能落到母本的雌花柱头上产生自交种子，出现假杂种，这种现象时有发生。此外，收获后的机械混杂也会导致品种混杂。因此，种子纯度是杂交种子质量检验的主要指标之一，在制种后或销售前对苦瓜品种的种子纯度进行鉴定是必不可少的，否则可能给种子经营者及种植户造成难以估量的经济损失。
目前，苦瓜品种鉴定和种子纯度鉴定的方法主要是形态学鉴定与田间种植鉴定相结合的办法。形态学鉴定方法通过种子的形态及幼苗期的形状、颜色、大小等外观以区分，但形态形状容易受到环境因素的影响而导致鉴定结果出现偏差，只适合对亲缘关系较远而少量的样品进行简单分类。田间种植鉴定根据种植品种形态的长期观察，可充分展现品种特征及特性以作为鉴定依据，是鉴定品种真实性和测定种子纯度的较为可靠而准确的方法。然而田间栽培鉴定耗时较长，易受栽培措施及环境因素影响，投入成本大，不具备短时间内达到大量鉴定的要求。
随着分子生物学和基因组学的迅猛发展，DNA分子标记技术在不同作物品种和种子纯度鉴定中的应用日益广泛，表现出快速准确、高效实用的特点；其中SSR分子标记是基于基因组中的简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)开发出的共显性标记。同一作物不同品种的基因组中有很多SSR（鉴定重复序列）多态性位点，一方面不同SSR的简单重复序列和重复次数不一样，另一方面，即便简单重复序列一样，不同品种之间的重复次数也可能不一样，因而同样的SSR引物利用不同品种的DNA进行PCR扩增的产物、或者说基因组中同样的SSR引物覆盖的DNA片段的序列就可能存在差异（多态性）。
‘长绿2号’苦瓜是以父本S917007、母本P091728育成的杂交一代品种，该品种主侧蔓结果，结果期喜较强光照、较高温度和充足水分。田间表现抗病抗逆性较强，枯萎病、炭疽病发病轻；耐热性、耐涝性较强；适应性广，适宜春秋栽培，果实手感紧实，耐贮运；已在华南地区大面积推广。因此建立一套准确快速、稳定实用的杂交种子纯度鉴定方法对于保障‘长绿2号’苦瓜种苗的及时销售和安全使用非常重要。
发明内容
本发明的一个目的在于提供用于苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定特异性标记、用于苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定的SSR分子标记引物以及鉴定方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定特异性标记，包括母本P091728中的特异性标记P1-A（SEQ ID NO.1）、P1-C（SEQ ID NO.2）和父本S917007中的特异性标记P2-B（SEQ ID NO.3），和P2-D（SEQ ID NO.4）；
SEQ ID NO.1：
TGAAACGGAACGAAACCTCAGATCTCGAGAACTGGAGGAGGAGAGAGAAAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATTACCAGTGTTGGTGGGAACTGATCTCCAATTGCCAGGACCATGTTGTTGAATGTAAGAGGCAAGAAGGATGTCA；
SEQ ID NO.2：
TTTTCGTCTTCCAATGAGCCCTCGCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACAAATATCCAACGGCGCAGAAATATCCACCCCCGGTAAATCGCCTCCAACGGCGGATGAGGGATCCACGTTGATAATGTCGCTCCAACAGAATATCTGGATCAATTAGAACACGATCTGCTAAAGTCACAGGGCGTTCAA；
SEQ ID NO.3：
TGAAACGGAACGAAACCTCAGATCTCGAGAACTGGAGGAGGAGAGAGAAAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATTACCAGTGTTGGTGGGAACTGATCTCCAATTGCCAGGACCATGTTGTTGAATGTAAGAGGCAAGAAGGATGTCA；
SEQ ID NO.4：
TTTTCGTCTTCCAATGAGCCCTCGCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACAAATATCCAACGGCGCAGAAATATCCACCCCCGGTAAATCGCCTCCAACGGCGGATGAGGGATCCACGTTGATAATGTCGCTCCAACAGAATATCTGGATCAATTAGAACACGATCTGCTAAAGTCACAGGGCGTTCAA。
一种苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定分子标记引物，包括SSR191192和SSR203204，SSR191192用于扩增P1-A和P1-C，SSR203204用于扩增P2-B和P2-D。
进一步地，SSR191192的核苷酸序列为：
SSR191192-F：5’-TGACATCCTTCTTGCCTCTTACA-3’（SEQ ID NO.5），
SSR191192-R：5’-TGAAACGGAACGAAACCTCA-3’（SEQ ID NO.6）。
进一步地，SSR203204的核苷酸序列为：
SSR203204-F：5’-TTGAACGCCCTGTGACTTTAGC-3’（SEQ ID NO.7），
SSR203204-R：5’-TTTTCGTCTTCCAATGAGCC-3’（SEQ ID NO.8）。
上述苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定分子标记引物在苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定中的应用。
一种苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定方法，以上述的苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定特异性标记为特异性标记，包括母本P091728中的特异性标记P1-A（SEQ ID NO.1）、P1-C（SEQ ID NO.2）和父本S917007中的特异性标记P2-B（SEQ ID NO.3），和P2-D（SEQ ID NO.4），具体步骤如下：
1)提取苦瓜幼苗基因组DNA；
2)以苦瓜幼苗基因组DNA为模板，使用分子标记引物进行PCR扩增；
3)对扩增的产物进行分析，同时具有P1-A、P1-C、P2-B和P2-D四个特异性标记的待测苦瓜单株为真正的杂交种，否则为假杂交种。
进一步地，分子标记引物包括SSR191192和SSR203204，SSR191192用于扩增P1-A和P1-C，SSR203204用于扩增P2-B和P2-D。
进一步地，SSR191192的核苷酸序列为：
SSR191192-F：5’-TGACATCCTTCTTGCCTCTTACA-3’（SEQ ID NO.5），
SSR191192-R：5’-TGAAACGGAACGAAACCTCA-3’（SEQ ID NO.6）。
进一步地，SSR203204的核苷酸序列为：
SSR203204-F：5’-TTGAACGCCCTGTGACTTTAGC-3’（SEQ ID NO.7），
SSR203204-R：5’-TTTTCGTCTTCCAATGAGCC-3’（SEQ ID NO.8）。
进一步地，对扩增的产物进行凝胶电泳，对电泳结果进行分析，同时具有亲本四条特异条带的待测苦瓜单株为真正的杂交种，否则为假杂交种。
本发明的有益效果是：
利用本发明中的特异性标记、分子标记引物及鉴定方法可将‘长绿2号’苦瓜杂交种子与其父本、母本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度，具有快速、准确、低成本、高通量、便捷实用等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
附图说明
图1为‘长绿2号’苦瓜种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；
图2为引物SSR192193在‘长绿2号’苦瓜亲本P1、P2及杂种F1代纯度鉴定结果；
图3为引物SSR203204在‘长绿2号’苦瓜亲本P1、P2及杂种F1代纯度鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定特异性标记，包括母本P091728中的特异性标记P1-A（SEQ ID NO.1）、P1-C（SEQ ID NO.2）和父本S917007中的特异性标记P2-B（SEQ ID NO.3），和P2-D（SEQ ID NO.4）。
SEQ ID NO.1：
TGAAACGGAACGAAACCTCAGATCTCGAGAACTGGAGGAGGAGAGAGAAAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATTACCAGTGTTGGTGGGAACTGATCTCCAATTGCCAGGACCATGTTGTTGAATGTAAGAGGCAAGAAGGATGTCA；
SEQ ID NO.2：
TTTTCGTCTTCCAATGAGCCCTCGCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACAAATATCCAACGGCGCAGAAATATCCACCCCCGGTAAATCGCCTCCAACGGCGGATGAGGGATCCACGTTGATAATGTCGCTCCAACAGAATATCTGGATCAATTAGAACACGATCTGCTAAAGTCACAGGGCGTTCAA；
SEQ ID NO.3：
TGAAACGGAACGAAACCTCAGATCTCGAGAACTGGAGGAGGAGAGAGAAAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATTACCAGTGTTGGTGGGAACTGATCTCCAATTGCCAGGACCATGTTGTTGAATGTAAGAGGCAAGAAGGATGTCA;
SEQ ID NO.4:
TTTTCGTCTTCCAATGAGCCCTCGCTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACAAATATCCAACGGCGCAGAAATATCCACCCCCGGTAAATCGCCTCCAACGGCGGATGAGGGATCCACGTTGATAATGTCGCTCCAACAGAATATCTGGATCAATTAGAACACGATCTGCTAAAGTCACAGGGCGTTCAA。
实施例2
一种苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定分子标记引物，包括SSR191192和SSR203204，SSR191192用于扩增P1-A和P1-C，SSR203204用于扩增P2-B和P2-D。
SSR191192核苷酸序列为：
SSR191192-F：5’-TGACATCCTTCTTGCCTCTTACA-3’（SEQ ID NO.5），
SSR191192-R：5’-TGAAACGGAACGAAACCTCA-3’（SEQ ID NO.6）。
SSR203204核苷酸序列为：
SSR203204-F：5’-TTGAACGCCCTGTGACTTTAGC-3’（SEQ ID NO.7），
SSR203204-R：5’-TTTTCGTCTTCCAATGAGCC-3’（SEQ ID NO.8）。
实施例3
一种苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定方法，使用实施例1中的特异性标记和实施例2中的分子标记引物，具体步骤如下：
（1）苦瓜DNA的提取
步骤如下：
①取待测苦瓜嫩叶约1 cm2，放置于1.5 mL离心管中，加入钢珠盖上盖子，浸入液氮冻干用机器批量粉碎；
②向离心管中加入600 μL 2×CTAB提取缓冲液［20 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1.4 mmol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、2% CTAB、1% PVP］，充分混匀；放置于65°C水浴60 min，每隔20 min颠倒数次，充分摇匀；
③加入等体积的氯仿，摇匀后，室温下12000 rpm离心10 min；
④离心完毕，小心将上清溶液吸取至另一支离心管中，再加入等体积的异丙醇溶液，摇匀后室温下12000 rpm离心10 min，离心完毕倒出液体；
⑤DNA沉淀物使用700 μL 体积浓度70%的乙醇洗涤后，放置烘箱中风干数分钟或自然晾干；
⑥加入150 μL超纯水，使DNA溶解，最后将DNA放置4°C冰箱，保存备用。
（2） PCR扩增
以步骤（1）提取的DNA为模板，分别使用分子标记引物SSR191192和SSR203204进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系为：
0.75 μL模板、0.75 μL 分子标记引物、7.5 μL 2×EasyTaq Super Mix、6 μL ddH2O。
PCR扩增反应程序设定参数：
95°C预变性3 min、95°C变性30 s、51°C复性30 s、72°C延伸1 min、循环数设定为36、72°C延伸时间5min，15°C保存待检测。
（3）扩增产物分析
扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，160 V稳压4 h，电泳结束后进行0.l%AgNO3银染15 min；银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04% Na2CO3显色，显色后在灯箱上拍照分析。同时具有P1-A、P1-C、P2-B和P2-D四个特异性标记的条带的待测苦瓜单株为真正的杂交种，否则为假杂交种。
使用上述方法对‘长绿2号’苦瓜种子纯度鉴定的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱如图1所示，其中M：100bp Plus DNA Ladder分子量标准；P1：母本P091728；P2：父本S917007；F：商品种‘长绿2号’苦瓜F1代。
实施例4
采用实施例3的方法，从白云基地的种子纯度鉴定田中取94株‘长绿2号’苦瓜的叶片，对其单株编号，提取单株叶片DNA进行检测，检测结果见图2、3，其中M：DNA Ladder；P1：母本P091728；P2：父本S917007；1-33：‘长绿2号’苦瓜F1代。两对引物检测结果一致，种子纯度为100%，与田间调查结果一致，准确率为100%。
以上实施例表明，本发明的方法可将‘长绿2号’苦瓜杂交种子与其父本、母本种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> 用于苦瓜‘长绿2号’杂交种子纯度鉴定的特异性标记及鉴定方法
<130> 2018.5.22
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 151
<212> DNA
<213> 苦瓜
<400> 1
tgaaacggaa cgaaacctca gatctcgaga actggaggag gagagagaaa ggagagagag 60
agagagagag agagaattac cagtgttggt gggaactgat ctccaattgc caggaccatg 120
ttgttgaatg taagaggcaa gaaggatgtc a 151
<210> 2
<211> 196
<212> DNA
<213> 苦瓜
<400> 2
ttttcgtctt ccaatgagcc ctcgcttctt ctctctctct ctctctctct ctctcacaaa 60
tatccaacgg cgcagaaata tccacccccg gtaaatcgcc tccaacggcg gatgagggat 120
ccacgttgat aatgtcgctc caacagaata tctggatcaa ttagaacacg atctgctaaa 180
gtcacagggc gttcaa 196
<210> 3
<211> 155
<212> DNA
<213> 苦瓜
<400> 3
tgaaacggaa cgaaacctca gatctcgaga actggaggag gagagagaaa ggagagagag 60
agagagagag agagagagaa ttaccagtgt tggtgggaac tgatctccaa ttgccaggac 120
catgttgttg aatgtaagag gcaagaagga tgtca 155
<210> 4
<211> 202
<212> DNA
<213> 苦瓜
<400> 4
ttttcgtctt ccaatgagcc ctcgcttctt ctctctctct ctctctctct ctctctctct 60
cacaaatatc caacggcgca gaaatatcca cccccggtaa atcgcctcca acggcggatg 120
agggatccac gttgataatg tcgctccaac agaatatctg gatcaattag aacacgatct 180
gctaaagtca cagggcgttc aa 202
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgacatcctt cttgcctctt aca 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tgaaacggaa cgaaacctca 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ttgaacgccc tgtgacttta gc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ttttcgtctt ccaatgagcc 20