技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及金属蛋白酶WS1B在调控植物叶绿体代谢中的应用。
背景技术
叶绿素是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，在光合作用的能量捕获及能量传递中起着关键的作用。由于光合作用对维持全球生态系统的稳定十分重要，叶绿素也被认为是地球上最重要的物质之一(Liu et al.2007)。深入研究叶绿素代谢的分子机制，对于全面了解光合作用的机理、促进农业的可持续发展以及加快对生物质能源的研究与利用均具有重要的意义。
对叶绿素代谢的研究一般从叶色的变化入手，这是因为叶绿素含量的变化往往导致植物叶片出现白化、黄化、淡绿、深绿等异常的表型(Kurata et al.2005)。过去几十年来，人们在植物中鉴定了大量的叶色突变体，对这些突变体的分子生物学研究已在较大程度上揭示了叶绿素代谢的分子机制。
由于叶绿素的正常代谢被破坏，很多叶色突变体曾被认为不利于植物的生长发育而在农业生产上毫无用处。不过，随着科技的进步和相关研究的深入挖掘，一些突变体逐渐表现出了较大的应用潜力。例如，棉花的芽黄突变体和水稻的白转绿突变体由于对农作物的产量和品质均无显著影响，可以作为指示杂交种纯度的有效形态标记(Duncan and Pate 1967；Wu et al.2003)；硬粒小麦的持绿突变体由于延迟了叶绿素的降解而延长了光合作用的时间，从而提高了籽粒的产量(Spano et al.2003)；白茶突变体由于在阶段性返白期叶片氨基酸含量的提高和组分的变化而成为制作高档茶叶的理想原料(李素芳et al.1996)；由于突变导致的叶绿素含量相对于类胡萝卜素和花青素含量的下降，自然界中大量植物表现出了广泛的叶色变异，可以用于培育观赏植物(Keskitalo et al.2005；Matile 2000)。
然而，尽管通过对叶色突变体的研究已经鉴定了大量叶绿素代谢相关基因，初步描绘了叶绿素代谢相关的主要途径，但人们对叶绿素代谢分子机制的认识仍然存在大片空白。例如，由于突变体材料的缺乏，目前对叶绿素降解的了解还很少；当前虽然已经克隆了参与叶绿素合成的全部15种酶的编码基因，但对其转录调控的研究才刚刚开始(Tang et al.2012)。鉴于上述现状，重要实验材料的创制是进一步深入研究叶绿素代谢分子机制的主要途径。
发明内容
本发明的一个目的是提供WS1B蛋白质的新用途。
本发明提供了WS1B蛋白质在调控植物叶绿体代谢和/或发育中的应用。
本发明还提供了WS1B蛋白质在调控植物叶绿体类囊体膜的形成中的应用。
上述应用中，所述WS1B蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
b)在序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
上述c)中的WS1B蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的WS1B蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的WS1B蛋白质的编码基因可通过将序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
本发明另一个目的是提供与WS1B蛋白质相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与WS1B蛋白质相关的生物材料在调控植物叶绿体代谢和/或发育中的应用。
本发明还提供了与WS1B蛋白质相关的生物材料在调控植物叶绿体类囊体膜的形成中的应用。
上述应用中，所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码WS1B蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列4所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码WS1B蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码WS1B蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，A2)所述的含有编码WS1B的核酸分子的表达盒(WS1B基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达WS1B的DNA，该DNA不但可包括启动WS1B转录的启动子，还可包括终止WS1B转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述WS1B基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述应用中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。
本发明的最后一个目的是提供一种培育叶绿体代谢和/或发育水平提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育叶绿体代谢和/或发育水平提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中WS1B蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶绿体代谢和/或发育水平高于所述受体植物。
上述方法中，所述转基因植物的叶绿体代谢和/或发育水平高于所述受体植物体现在所述转基因植物的茎秆变为绿色。
上述方法中，所述提高受体植物中WS1B蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达WS1B蛋白质。
上述方法中，所述过表达的方法为将WS1B蛋白质的编码基因导入受体植物。
在本发明中，所述WS1B蛋白质的编码基因通过重组载体导入受体植物中，所述重组载体为表达载体pWS1B:WS1B或表达载体p35S:WS1B。
上述方法中，所述WS1B蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列4所示的DNA分子。
上述方法中，所述受体植物为白肋烟；所述白肋烟具体可为白肋烟品种TN90。
通过实验证明：本发明提供的WS1B蛋白质参与了叶绿素代谢的途径，为深入研究叶绿素代谢的分子机制提供了新思路。
附图说明
图1为ws1a和ws1b的初定位与精细定位比较。
图2为红花大金元(HD)和TN90(TN)苗期和成株期的表型。
图3为标记S5和S7在部分BC1F1隐性单株(白茎)中的扩增情况(*示重组单株)。
图4为ws1a和ws1b的精细定位与图位克隆。
图5为WS1A和WS1B遗传互补植株与对照的表型比较图。
图6为红花大金元(HD)和TN90(TN)叶绿体透射电镜观察。
图7为WS1A、ws1a、WS1B和ws1b特异引物在22个白肋烟品种和24个绿茎烟草品种中的扩增情况。
图8为WS1A、ws1a、WS1B和ws1b特异引物在部分BC1F1单株中的扩增情况及绿茎单株的基因型鉴定。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、基因ws1a和ws1b的定位和图位克隆
一、基因ws1a和ws1b的初定位
1、从EMS诱变的普通烟草品种中烟100(ZY)中筛选得到一个叶绿素缺乏的白茎突变体white stem1(ws1)。采用等位测验的方法(具体方法参见如下文献：Mapping of two white stem genes in tetraploid common tobacco(Nicotiana tabacum L.))进行遗传分析，具体步骤如下：将白茎突变体ws1与白肋烟品种杂交，得到F1代，F1代表现与父母本相同；然后将F1代自交，得到自交后代，自交后代性状不发生分离。遗传分析表明，白茎性状由2个隐性细胞核基因ws1a和ws1b控制，且与普通烟草中一个重要的栽培类型——白肋烟的白茎基因等位。
2、利用烟草SSR标记对两个基因ws1a和ws1b进行初定位(具体方法参见如下文献：Mapping of two white stem genes in tetraploid common tobacco(Nicotiana tabacum L.)，具体步骤如下：将白茎突变体(ws1)与绿茎烟草品种红花大金元(HD)杂交，得到杂种F1代。然后将杂种F1代与TN90回交，得到BC1F1分离群体。再将BC1F1分离群体中的绿茎单株自交，得到BC1F2分离群体。通过表型鉴定获得绿:白分离比为3:1的群体(在某一具体群体中仅ws1a或ws1b基因单独分离，图1)，选取其中一个群体用于筛选与白茎突变表型连锁的SSR标记，与标记连锁的基因被命名为ws1a；之后用该连锁标记筛选其余群体，凡其白茎突变表型不与该标记连锁的群体则被用于筛选与ws1b基因连锁的SSR标记(图1)，最终将ws1a定位于第5连锁群由SSR标记PT54006和PT51778界定的一个12cM的区间内，ws1b定位于第24连锁群由SSR标记PT53716和TM11187界定的一个17.12cM的区间内；并基于遗传学和分子标记图谱等若干证据推测出ws1a和ws1b为同源基因。
二、基因ws1a和ws1b的精细定位和图位克隆
1、由于步骤一中用于遗传分析和基因定位的实验材料均属于同一类型的普通烟草，而SSR标记的多态性在同一类型的普通烟草中较低，在不同类型的普通烟草中较高，为了提高SSR标记的多态性，以利于接下来的基因精细定位与图位克隆，本发明选取一个普通烟草白肋烟品种TN90(TN)代替白茎突变体进行如下试验：首先将白肋烟品种TN90(TN)与绿茎烟草品种红花大金元(HD)杂交，得到杂种F1。然后将杂种F1代与TN90回交，得到BC1F1分离群体(图1和图2)。该BC1F1群体总共有8500株，其中2151株鉴定为白茎(隐性)，分离比符合3:1(χ20.05为0.424，小于临界值3.841)。
2、由于ws1a定位于第5连锁群由SSR标记PT54006和PT51778界定的一个12cM的区间内，ws1b定位于第24连锁群由SSR标记PT53716和TM11187界定的一个17.12cM的区间内。通过将文献“A high density genetic map of tobacco(Nicotiana tabacum L.)obtained from large scale microsatellite marker development”中提供的SSR引物序列与红花大金元(HD)基因组序列比对，表明ws1b位于红花大金元第19号染色体64.73Mb和70.45Mb之间，而ws1a的两个SSR标记由于分别位于不同的scaffold上，暂无法确认ws1a具体的染色体位置。
3、对ws1b进行精细定位。具体步骤如下：(1)利用SSRHunter软件(记载于如下文献中：Development of a Local Searching Software for SSR Sites)在红花大金元第19号染色体64.73Mb和70.45Mb之间搜索可以设计SSR引物的简单重复序列；(2)获取的SSR简单重复序列及其上下游150bp序列用于设计SSR引物，并在TN90和红花大金元之间检测其多态性；(3)有多态性的标记用于检测BC1F1群体中的白茎单株(隐性)。精细定位中使用的所有实验技术，包括基因组DNA的制备、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染显色均按照文献“Mapping of two white stem genes in tetraploid common tobacco(Nicotiana tabacum L.)”描述的进行。
本发明设计的SSR标记共有88个，其中10个(S1-S10)在TN90和红花大金元之间具有多态性，且扩增产物电泳条带清晰。首先用这10个多态性标记对一个282个单株的小群体(此处小群体是指步骤1中BC1F1群体中的2151株白色茎秆单株的一小部分，共有282株白色茎秆单株)进行了检测，发现这些标记都表现为与白茎突变表型紧密连锁(图3)。根据SSR标记与ws1b之间的遗传重组，初步将ws1b定位在一个910kb的区间内；随后在该区间内又开发了6个多态性SSR标记(S11-S16)，用剩余的群体(此处剩余的群体是指步骤1中2151株白色茎秆单株中除上述由282个白色茎秆单株组成的小群体以外的其余白色茎秆单株)进一步将其定位在一个220kb的区间内(图4)。该区间内总共有5个预测基因，通过在TN90和红花大金元之间进行序列差异比对，初步将一个编码金属蛋白酶(zinc metalloprotease)的基因确定为ws1b的候选基因。ws1b基因具有10个外显子和9个内含子，位于第9外显子上的一个单碱基T插入导致了基因的移码突变(图4)。ws1b基因的核苷酸序列如序列1所示。
4、由于推测ws1a和ws1b为同源基因，随后将ws1b序列作为query序列在红花大金元基因组序列中进行搜索，发现另外一个与ws1b候选基因高度同源、编码相同金属蛋白酶的基因在TN90和红花大金元之间存在序列差异。该基因位于红花大金元第18号染色体，也具有10个外显子和9个内含子，位于第2外显子上的一个8碱基的缺失导致了基因的移码突变(图4)，该基因即为ws1a的候选基因，其核苷酸序列如序列2。
5、将步骤4中所述的8碱基缺失设计成一个共显性标记M-a，并检测了470个白色茎秆单株(隐性)(此处470个白色茎秆单株(隐性)为上述BC1F1分离群体中的2151株白色茎秆单株的一部分)，结果表明：该标记与白茎突变表型完全连锁，表明ws1a确实位于其候选基因所在区域(图4)。精细定位中用到的所有标记信息见表1。
表1、用于ws1a和ws1b精细定位和图位克隆的分子标记
标记 染色体 物理位置(Mb) 正向引物序列 反向引物序列 S1 Chr.19 66.34 TATGATTCTCCTTTTATTCCTA TGCGGTCCACTCCACTGA S2 Chr.19 66.91 GTGGCAACTAAATGAAAAAAGA TTAGATATTCAACATCCTCCTT S3 Chr.19 67.49 GTTCTATATTTTCAAACAGTGTG TGACAACCTCAATAAGCCAC S4 Chr.19 67.92 TCTTATTCTCTTACAACACTCTG GTAGACAAGCGTAATGAGGA S5 Chr.19 68.10 GATGTGTTTCTTTTGCTCTTTAT AGTCTGAGATTATACTGGGTTG S6 Chr.19 68.48 AGTTGAATATGAACCTATACAAAT GATAGTGAAGAAAAATGTGAAAAT S7 Chr.19 69.01 GGTACAGCGGGGAAAGATA AAACCTGCAATTACAAGTCAAA S8 Chr.19 69.38 TTTTTCCCTACCGATTCTCTAC TGTTGCTTCTTCACACACATTA S9 Chr.19 69.80 CCACTGTTTAAGCAACTTTAGATA ACACCATATAAAATGATTGTGAAG S10 Chr.19 69.92 AAACAAAACCGAACCAAACC GAACGGACGCTAATTCTCAA S11 Chr.19 68.20 GTAAAAGATTGATTAAGATTTAGAC GAGAATTGAAATTATGAGATTATC S12 Chr.19 68.62 AAAGGGCACTCCCGAATAT ATGCTTGTAAATCAAATGATGATG S13 Chr.19 68.66 TCGTGTAGGTTTAATAAAGGAG ACAAAAGGAAAGAGGGAAAC S14 Chr.19 68.79 CGGACATTGATAAGTTGTAGAT TCCATACGACTGAATAATAGGT S15 Chr.19 68.83 AAACGAAATAAATAAAGGAAAGAA GGGCATAAAAGTCGATCAATAT S16 Chr.19 68.88 TCTTACCACCATTGTGTAGGA CAAGTGAGCGTCAGTATTTTC M-a Chr.18 13.25 ACCTGTTCATGGTGGAAGAG CTGCGTGGTTGACGAGTTC
实施例2、金属蛋白酶WS1A或WS1B在调控植物叶绿体代谢中的应用
一、转WS1A烟草和转WS1B烟草的获得
1、重组载体的构建
(1)基因WS1A、WS1B的克隆
(1-1)提取红花大金元叶片的RNA，反转录而成cDNA。RNA提取和反转录分别使用TaKaRa公司的MiniBEST plant RNA Extraction Kit(Code No.9769)和TaKaRa公司的PrimerScript II 1st Strand cDNA synthesis Kit(Code No.6210)完成。以cDNA为模板，采用引物CW-1F/CW-1R进行扩增，得到PCR产物。
(1-2)PCR产物经TA克隆(Mighty TA-cloning Kit(TaKaRa公司，Code No.6028))和测序后分别鉴定出WS1A和WS1B。WS1A基因序列如序列3所示，WS1B基因序列如序列4所示。
(2)表达载体的构建
(2-1)用限制性内切酶PstI和EcoRI对pCAMBIA1300-35S(pCAMBIA1300-35S记载于文献“Loose Plant Architecture1,an INDETERMINATE DOMAIN Protein Involved in Shoot Gravitropism,Regulates Plant Architecture in Rice”中)进行双酶切，得到包含NOS转录终止子的310bp的片段，并将其连入pCAMBIA1300载体中，形成中间载体pCAMBIA1300-NOS；
(2-2)以含有测序正确的WS1A质粒为模板，采用引物ST-3F/ST-1R扩增WS1A基因，用TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit将其插入到中间载体pCAMBIA1300-NOS中，得到pCAMBIA1300-WS1A-NOS；
以含有测序正确的WS1B质粒为模板，采用引物ST-3F/ST-1R扩增WS1B基因，用TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit将其插入到中间载体pCAMBIA1300-NOS中，得到pCAMBIA1300-WS1B-NOS；
(2-3)以红花大金元基因组DNA为模板，分别使用两对引物SP-2F/SP-2R和TP-2F/TP-2R进行扩增，分别得到WS1A和WS1B的启动子；
(2-4)用TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit将WS1A的启动子插入到pCAMBIA1300-WS1A-NOS中，得到表达载体pWS1A:WS1A；
用TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit将WS1B的启动子插入到pCAMBIA1300-WS1B-NOS中，得到表达载体pWS1B:WS1B；
(2-5)以含有测序正确的WS1A质粒为模板，采用引物ST-1F/ST-1R扩增WS1A基因；用TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit(Code No.639648)将WS1A基因插入到pCAMBIA1300-35S表达载体中，得到表达载体p35S:WS1A；
以含有测序正确的WS1B质粒为模板，采用引物ST-1F/ST-1R扩增WS1B基因；用TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit(Code No.639648)将WS1B基因插入到pCAMBIA1300-35S表达载体中，得到表达载体p35S:WS1B。
上述表达载体pWS1A:WS1A和表达载体pWS1B:WS1B均为自身启动子驱动WS1A和WS1B的表达载体；上述表达载体p35S:WS1A和表达载体p35S:WS1B均为CaMV35S强启动子驱动WS1A和WS1B的表达载体。上述表达载体pWS1A:WS1A和表达载体p35S:WS1A均表达序列5所示的WS1A蛋白；上述表达载体pWS1B:WS1B和表达载体p35S:WS1B均表达序列6所示的WS1B蛋白。
上述构建载体所用到的所有引物信息见表2。
表2、用于WS1A和WS1B遗传互补载体构建和cDNA扩增的引物
2、转基因烟株的获得
(1)将上述四个载体p35S:WS1A、p35S:WS1B、pWS1A:WS1A和pWS1B:WS1B通过电击转入农杆菌菌株LBA4404(青岛百奥百斯特化学试剂有限公司，货号BC301-01)，按照文献“High-throughput generation of an activation-tagged mutant library for functional genomic analyses in tobacco”中的方法转化白肋烟品种TN90，分别得到转p35S:WS1A烟株、转p35S:WS1B烟株、转pWS1A:WS1A烟株和转pWS1B:WS1B烟株。
(2)PCR鉴定
采用表3中的引物分别对转p35S:WS1A烟株、转p35S:WS1B烟株、转pWS1A:WS1A烟株和转pWS1B:WS1B烟株进行PCR鉴定。
表3、用于WS1A和WS1B遗传互补转基因植株鉴定的引物对
注：A：p35S:WS1A；B：p35S:WS1B；C：pWS1A:WS1A；D：pWS1B:WS1B
经过PCR检测与测序分析，每个载体都获得了20株以上的转基因烟株。
二、转WS1A烟草和转WS1B烟草的表型
观察转p35S:WS1A烟株、转p35S:WS1B烟株、转pWS1A:WS1A烟株和转pWS1B:WS1B烟株与白肋烟品种TN90表型。
结果表明：与TN90的白色茎秆比较，转p35S:WS1A烟株、转p35S:WS1B烟株、转pWS1A:WS1A烟株和转pWS1B:WS1B烟株均恢复到与野生型红花大金元相同的绿色茎秆。上述结果表明WS1A和WS1B确实控制了TN90的白色茎秆性状，并且二者中任意一个均可使其恢复到野生型的绿色茎秆(图5)。
三、WS1A和WS1B的亚细胞定位
1、利用Predotar server(https://urgi.versailles.inra.fr/predotar/)在线分析了WS1A和WS1B的亚细胞定位。
结果表明：WS1A和WS1B均定位于质体(叶绿体)中。
2、为进一步分析WS1A和WS1B在叶绿体中的作用，参照文献“Altered Chloroplast Development and Delayed Fruit Ripening Caused by Mutations in a Zinc Metalloprotease at the lutescent2 Locus of Tomato”中的方法制备了TN90和红花大金元的初花期中部叶片样品，采用Hitachi H-7650型透射电镜观察了叶绿体的超微结构。
结果表明：TN90叶绿体的类囊体膜受到严重的破坏，几乎没有基粒片层，仅有少量的基质片层，与红花大金元完整的类囊体膜形成鲜明的对比(图6)。上述结果表明WS1A和WS1B通过控制叶绿体类囊体膜的形成来影响叶绿体的发育，从而调控叶绿素的代谢。
实施例3、与白肋烟控制基因共分离的分子标记
一、用于WS1A、ws1a、WS1B和ws1b基因型鉴定的引物设计
1、从红花大金元基因组数据库下载WS1A和WS1B全基因序列，用在线分析工具MUSCLE(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)进行序列比对，获得WS1A和WS1B之间的序列差异，截取ws1a和ws1b突变位点上下游200-400bp的基因组序列备用；
2、由于WS1A和WS1B序列高度同源，利用二者之间的序列差异，分别设计包含基因突变位点的特异PCR引物：
(1)对于WS1A和ws1a，基于二者之间的8碱基长度差异设计一对特异引物1325-2F/1325-1R(即M-a)，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凡片段大小与红花大金元相近者则被认为含有WS1A，与TN90相近者被认为含有ws1a，二者兼有者被认为是WS1A/ws1a杂合体，
在实际应用中，可根据如下方法确定待测烟草含有WS1A基因还是ws1a基因还是含有WS1A基因和ws1a基因：
若1325-2F/1325-1R引物的扩增产物大小为209bp，则待测烟草含有WS1A基因；
若1325-2F/1325-1R引物的扩增产物大小为201bp，则待测烟草含有ws1a基因；
若1325-2F/1325-1R引物的扩增产物大小为209bp和201bp，则待测烟草含有WS1A基因和ws1a基因。
为了验证鉴定出的WS1A和ws1a是否正确，采用另一对特异引物1325-1F/1325-1R进行PCR测序以进一步确认。
(2)对于WS1B和ws1b，二者之间的单基因长度差异无法用聚丙烯酰胺凝胶电泳清晰显示，参照文献“A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening”中的ACT-PCR法设计一条反向引物BW-N4R与正向特异引物B-N1F配对，用于特异扩增WS1B，设计一条反向引物BM-N3R与正向特异引物B-N1F配对，用于特异扩增ws1b。上述WS1B和ws1b特异引物的最佳扩增条件均采用温度梯度PCR法在红花大金元和TN90进行摸索，以特异扩增的基因条带清晰，而其对应的等位基因无条带或条带很弱为准。
在实际应用中，可根据如下方法确定待测烟草含有WS1B基因还是ws1b基因还是含有WS1B基因和ws1b基因：
若BW-N4R/B-N1F引物没有扩增条带或扩增条带弱，BM-N3R/B-N1F引物的扩增产物大小为251bp，则待测烟草含有ws1b基因；
若BW-N4R/B-N1F引物的扩增产物大小为250bp，BM-N3R/B-N1F引物没有扩增条带或扩增条带弱，则待测烟草含有WS1B基因；
若BW-N4R/B-N1F引物的扩增产物大小为250bp，BM-N3R/B-N1F引物的扩增产物大小为251bp，则待测烟草含有WS1B基因和ws1b基因；
为了验证鉴定出的WS1B和ws1b是否正确，采用另一对特异引物6877-1F/6877-2R进行PCR测序以进一步确认。
上述相关引物序列及PCR扩增条件见表4。
表4、用于WS1A、ws1a、WS1B和ws1b基因型鉴定的引物
二、用于WS1A、ws1a、WS1B和ws1b基因型鉴定的引物的应用
1、利用步骤一中的特异引物对由国家烟草种质资源库(http://www.ycsjk.com.cn/)提供的22个白肋烟品种和24个绿茎烟草品种(表5和表6)进行基因型鉴定。
结果表明：所有白肋烟品种均含有纯合的ws1a基因和ws1b基因，而所有的绿茎烟草品种均含有纯合的WS1A基因和WS1B基因(图7)。
表5、用于WS1A、ws1a、WS1B和ws1b基因型鉴定的22份白肋烟种质资源
表6、用于WS1A、ws1a、WS1B和ws1b基因型鉴定的24份普通烟草种质资源
品种 茎秆颜色 Adcock 绿色 Cekpka 绿色 Connecticat-S98 绿色 Greece Basma 绿色 Havana 1号 绿色 K326 绿色 KARABAGLAR izmir 绿色 Katerini A 绿色 Kutsaga 110 绿色 Maden 绿色 Samsun 绿色 Saribaglar 绿色 Wisconsin 38 绿色 Xanthi NN 绿色 安88-2 绿色 贝拉烟 绿色 海南10 绿色 黑河柳叶尖 绿色 建恒一号 绿色 垦农二号 绿色 邵黄一号 绿色 铁青3 绿色 中烟100 绿色 筑波2号 绿色
2、为了进一步验证这些特异引物的有效性，对由TN90与红花大金元杂交、回交产生的BC1F1群体中的376个单株的基因型进行鉴定。
结果表明，114个白茎单株均含有纯合的ws1a基因和ws1b基因，而262个绿茎单株总共有三种基因型，分别为WS1Aws1aWS1Bws1b、WS1Aws1aws1bws1b和ws1aws1aWS1Bws1b，其单株数分别为76、88、98(图8)，分离比符合1:1:1(χ20.05为2.779，小于临界值5.991)。
上述结果表明步骤一设计的与白肋烟控制基因共分离的分子标记，可以在分子育种中快速、准确地对烟草基因型和茎秆性状进行鉴定。
序列表
<110>中国农业科学院烟草研究所
<120>金属蛋白酶WS1B在调控植物叶绿体代谢中的应用
<160>12
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1645
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgggaacgc taacgagctg cagtttcagc tcaatgaata taaggttccg tttgaatcct 60
ccagttaatt acactttcag tcgaagaatc caattgaaga gaatgtccaa acggaatttc 120
ggtcgattga ttattaggtg tagtagcggt agtagtggca atggcagtag caatgacagt 180
ggtagcagta gcgatgggaa attggaaaag gattcttcaa atttggctac agttactgaa 240
gaaaccactg aagaaaggaa cggcggcggt ggcgccagcg gtgtggaaaa tgattcggat 300
gattctccgg tgtcaatttc ttccagacca acaatatcca ctgttggatc aacttataat 360
aatttccaag tagattcttt taagttgatg gaacttcttg gaccagaaaa ggttgatccc 420
agtgatgtga agttcattaa ggaaaagtta tttggctact ctactttttg ggtgactaaa 480
gaagaaccat ttggagatct tggagagggc attcttttcc ttgggaatct tagaggaaag 540
agggaggatg tttttgccaa acttcagagt cagttatcag aaattatggg tgataagtac 600
aacctgttca tggtggagga acctaattca gaggggccag acccgcgtgg tgggcccaga 660
gtcagctttg gtatgctgcg gaaagaagtt tctgaaccag gtccaacaac tctctggcaa 720
tatgtaattg cttttctgtt gttccttctc actattggtt cctctgtgga gctaggaatt 780
gcatctcaga taactcgcct tcctcctgag gtagttaagt actttactga tccaaatgca 840
attgaaccac cagatatgca gcttttatta ccgtttgtgg attctgcttt accgttggca 900
tatggtgtgc tgggtgtgca gttatttcat gaaattgggc attttctggc tgcatttcca 960
aggaatgtga aattaagcat tcctttcttt attccaaaca tcactcttgg aagctttgga 1020
gcaatcactc agttcaaatc tattcttccc gatcgcaaag caaaggtaga catttctctt 1080
gcgggtcctt ttgctggtgc tgcattgtct tcttccatgt ttgcggttgg cctgttactc 1140
tcatccaatc ctgctgctgc tggagagttg gttcaggttc ctagcacact tttccagggc 1200
tctttgcttc tcgggcttat tagcagagcc actcttggtt atggagcaat gcatggtgca 1260
atggtttcaa tccatcctct tgtgatagct ggctggtgtg gcttgactac atcggctttt 1320
aatatgctgc cagttggatg tcttgatggt gggagagctg tgcagggagc ctttgggaaa 1380
ggatcactta ttggttttgg tttggcgaca tacacacttc tgggcttggg cgtgcttggt 1440
ggacctcttg tcacttcctt ggggattgta tgtgcttata tgtcagagga caccggagaa 1500
accatgcttg aatgatgtaa cagaggtcgg aaattggaga aaagcagctc ttggtgtggc 1560
tatattcctt gttgtattga ctcttcttcc tgtatgggat gaacttgcag aagaactagg 1620
tataggtctt gtaaccagct tttga 1645
<210>2
<211>1627
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
atgggaacgc taacgagctg cagtttcagc acaatgaata taaggttccg tttgaatcct 60
ccagttaatc acagtttcag tcgaagaatc caattgaaga gaatgtccaa acggaatttc 120
ggtagattga ttattaggtg tagtagtgga aatggcagta gcaataacaa tggcagcagt 180
agcgatggga aattggaaaa ggattcttca aatttagcta cagttactga agaaaccact 240
gaagaaagga acggcggcgg tggcgccagc ggtgtggaaa atgattccga ggattctccg 300
gtgtcaattt cttccagacc aacaatatcc acggttggat caacttataa taatttccaa 360
gtagattctt ttaagttgat ggaacttctt ggaccagaaa aggttgatcc cagtgatgtg 420
aagataatta aggaaaagtt atttggctac tctacttttt gggtgactaa agaagaacca 480
tttggagatc ttggagaggg cattcttttc cttgggaatc ttagaggaaa gagggaggat 540
gtttttgcca aacttcagag tcagttatca gaaattatgg gtgataagta caacctgttc 600
atggtggaag agcctaactc tggacccacg tggtgggccc agagttagct ttggtatgct 660
gcggaaagaa gtttctgaac caggtccaac aactctctgg caatatgtaa ttgcttttct 720
gttgttcctt ctcacaattg gttcctctgt ggagctagga attgcatctc agataactcg 780
ccttcctcct gaggtagtta agtactttac ggatccaaat gcaattgaac caccagatat 840
gcagctttta ctaccgtttg tggattctgc tataccactg gcatatggtg tgttgggcgt 900
gcagttattt catgaaattg ggcattttct ggctgcgttt ccaaggaatg tgaaattaag 960
cattcctttc tttattccaa acatcactct tggaagcttt ggagcaatca ctcagttcaa 1020
atctattctt cctgatcgaa aagcaaaggt agatatttcg cttgtgggtc cttttgctgg 1080
tgctgcattg tcttcttcaa tgtttgcggt tggcctgtta ctctcatcca atcctgctgc 1140
ttctggagag ttggttcagg ttcctagcac acttttccag ggatctttgc ttcttgggct 1200
tattagcaga gccactcttg gttatggagc aatgcatgga gcaatggttt caatccatcc 1260
tcttgtgatt gctggctggt gtggtttgac tacgtcggct tttaatatgc taccagttgg 1320
atgtcttgat ggtgggagag ctgtgcaggg agcctttggg aaaggatcac ttattggttt 1380
tggtttggcg acatacacac ttctgggctt gggcgtgctt ggtggacctc tgtcacttcc 1440
ttggggatta tatgtgctta tatgtcagag gacaccagag aaaccatgct tgaacgatgt 1500
aacagaggtc ggaacttgga gaaaagcagc tcttggtgtg gctatattcc ttgtagtatt 1560
gactcttctt cctgtatggg atgaacttgc agaagaacta ggtataggtc ttgtaaccag 1620
cttttga 1627
<210>3
<211>1635
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
atgggaacgc taacgagctg cagtttcagc acaatgaata taaggttccg tttgaatcct 60
ccagttaatc acagtttcag tcgaagaatc caattgaaga gaatgtccaa acggaatttc 120
ggtagattga ttattaggtg tagtagtgga aatggcagta gcaataacaa tggcagcagt 180
agcgatggga aattggaaaa ggattcttca aatttagcta cagttactga agaaaccact 240
gaagaaagga acggcggcgg tggcgccagc ggtgtggaaa atgattccga ggattctccg 300
gtgtcaattt cttccagacc aacaatatcc acggttggat caacttataa taatttccaa 360
gtagattctt ttaagttgat ggaacttctt ggaccagaaa aggttgatcc cagtgatgtg 420
aagataatta aggaaaagtt atttggctac tctacttttt gggtgactaa agaagaacca 480
tttggagatc ttggagaggg cattcttttc cttgggaatc ttagaggaaa gagggaggat 540
gtttttgcca aacttcagag tcagttatca gaaattatgg gtgataagta caacctgttc 600
atggtggaag agcctaattc agaggggcca gacccacgtg gtgggcccag agttagcttt 660
ggtatgctgc ggaaagaagt ttctgaacca ggtccaacaa ctctctggca atatgtaatt 720
gcttttctgt tgttccttct cacaattggt tcctctgtgg agctaggaat tgcatctcag 780
ataactcgcc ttcctcctga ggtagttaag tactttacgg atccaaatgc aattgaacca 840
ccagatatgc agcttttact accgtttgtg gattctgcta taccactggc atatggtgtg 900
ttgggcgtgc agttatttca tgaaattggg cattttctgg ctgcgtttcc aaggaatgtg 960
aaattaagca ttcctttctt tattccaaac atcactcttg gaagctttgg agcaatcact 1020
cagttcaaat ctattcttcc tgatcgaaaa gcaaaggtag atatttcgct tgtgggtcct 1080
tttgctggtg ctgcattgtc ttcttcaatg tttgcggttg gcctgttact ctcatccaat 1140
cctgctgctt ctggagagtt ggttcaggtt cctagcacac ttttccaggg atctttgctt 1200
cttgggctta ttagcagagc cactcttggt tatggagcaa tgcatggagc aatggtttca 1260
atccatcctc ttgtgattgc tggctggtgt ggtttgacta cgtcggcttt taatatgcta 1320
ccagttggat gtcttgatgg tgggagagct gtgcagggag cctttgggaa aggatcactt 1380
attggttttg gtttggcgac atacacactt ctgggcttgg gcgtgcttgg tggacctctg 1440
tcacttcctt ggggattata tgtgcttata tgtcagagga caccagagaa accatgcttg 1500
aacgatgtaa cagaggtcgg aacttggaga aaagcagctc ttggtgtggc tatattcctt 1560
gtagtattga ctcttcttcc tgtatgggat gaacttgcag aagaactagg tataggtctt 1620
gtaaccagct tttga 1635
<210>4
<211>1644
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
atgggaacgc taacgagctg cagtttcagc tcaatgaata taaggttccg tttgaatcct 60
ccagttaatt acactttcag tcgaagaatc caattgaaga gaatgtccaa acggaatttc 120
ggtcgattga ttattaggtg tagtagcggt agtagtggca atggcagtag caatgacagt 180
ggtagcagta gcgatgggaa attggaaaag gattcttcaa atttggctac agttactgaa 240
gaaaccactg aagaaaggaa cggcggcggt ggcgccagcg gtgtggaaaa tgattcggat 300
gattctccgg tgtcaatttc ttccagacca acaatatcca ctgttggatc aacttataat 360
aatttccaag tagattcttt taagttgatg gaacttcttg gaccagaaaa ggttgatccc 420
agtgatgtga agttcattaa ggaaaagtta tttggctact ctactttttg ggtgactaaa 480
gaagaaccat ttggagatct tggagagggc attcttttcc ttgggaatct tagaggaaag 540
agggaggatg tttttgccaa acttcagagt cagttatcag aaattatggg tgataagtac 600
aacctgttca tggtggagga acctaattca gaggggccag acccgcgtgg tgggcccaga 660
gtcagctttg gtatgctgcg gaaagaagtt tctgaaccag gtccaacaac tctctggcaa 720
tatgtaattg cttttctgtt gttccttctc actattggtt cctctgtgga gctaggaatt 780
gcatctcaga taactcgcct tcctcctgag gtagttaagt actttactga tccaaatgca 840
attgaaccac cagatatgca gcttttatta ccgtttgtgg attctgcttt accgttggca 900
tatggtgtgc tgggtgtgca gttatttcat gaaattgggc attttctggc tgcatttcca 960
aggaatgtga aattaagcat tcctttcttt attccaaaca tcactcttgg aagctttgga 1020
gcaatcactc agttcaaatc tattcttccc gatcgcaaag caaaggtaga catttctctt 1080
gcgggtcctt ttgctggtgc tgcattgtct tcttccatgt ttgcggttgg cctgttactc 1140
tcatccaatc ctgctgctgc tggagagttg gttcaggttc ctagcacact tttccagggc 1200
tctttgcttc tcgggcttat tagcagagcc actcttggtt atggagcaat gcatggtgca 1260
atggtttcaa tccatcctct tgtgatagct ggctggtgtg gcttgactac atcggctttt 1320
aatatgctgc cagttggatg tcttgatggt gggagagctg tgcagggagc ctttgggaaa 1380
ggatcactta ttggttttgg tttggcgaca tacacacttc tgggcttggg cgtgcttggt 1440
ggacctctgt cacttccttg gggattgtat gtgcttatat gtcagaggac accggagaaa 1500
ccatgcttga atgatgtaac agaggtcgga aattggagaa aagcagctct tggtgtggct 1560
atattccttg ttgtattgac tcttcttcct gtatgggatg aacttgcaga agaactaggt 1620
ataggtcttg taaccagctt ttga 1644
<210>5
<211>544
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
Met Gly Thr Leu Thr Ser Cys Ser Phe Ser Thr Met Asn Ile Arg Phe
1 5 10 15
Arg Leu Asn Pro Pro Val Asn His Ser Phe Ser Arg Arg Ile Gln Leu
20 25 30
Lys Arg Met Ser Lys Arg Asn Phe Gly Arg Leu Ile Ile Arg Cys Ser
35 40 45
Ser Gly Asn Gly Ser Ser Asn Asn Asn Gly Ser Ser Ser Asp Gly Lys
50 55 60
Leu Glu Lys Asp Ser Ser Asn Leu Ala Thr Val Thr Glu Glu Thr Thr
65 70 75 80
Glu Glu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gly Val Glu Asn Asp Ser
85 90 95
Glu Asp Ser Pro Val Ser Ile Ser Ser Arg Pro Thr Ile Ser Thr Val
100 105 110
Gly Ser Thr Tyr Asn Asn Phe Gln Val Asp Ser Phe Lys Leu Met Glu
115 120 125
Leu Leu Gly Pro Glu Lys Val Asp Pro Ser Asp Val Lys Ile Ile Lys
130 135 140
Glu Lys Leu Phe Gly Tyr Ser Thr Phe Trp Val Thr Lys Glu Glu Pro
145 150 155 160
Phe Gly Asp Leu Gly Glu Gly Ile Leu Phe Leu Gly Asn Leu Arg Gly
165 170 175
Lys Arg Glu Asp Val Phe Ala Lys Leu Gln Ser Gln Leu Ser Glu Ile
180 185 190
Met Gly Asp Lys Tyr Asn Leu Phe Met Val Glu Glu Pro Asn Ser Glu
195 200 205
Gly Pro Asp Pro Arg Gly Gly Pro Arg Val Ser Phe Gly Met Leu Arg
210 215 220
Lys Glu Val Ser Glu Pro Gly Pro Thr Thr Leu Trp Gln Tyr Val Ile
225 230 235 240
Ala Phe Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Gly Ser Ser Val Glu Leu Gly
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Ile Thr Arg Leu Pro Pro Glu Val Val Lys Tyr Phe
260 265 270
Thr Asp Pro Asn Ala Ile Glu Pro Pro Asp Met Gln Leu Leu Leu Pro
275 280 285
Phe Val Asp Ser Ala Ile Pro Leu Ala Tyr Gly Val Leu Gly Val Gln
290 295 300
Leu Phe His Glu Ile Gly His Phe Leu Ala Ala Phe Pro Arg Asn Val
305 310 315 320
Lys Leu Ser Ile Pro Phe Phe Ile Pro Asn Ile Thr Leu Gly Ser Phe
325 330 335
Gly Ala Ile Thr Gln Phe Lys Ser Ile Leu Pro Asp Arg Lys Ala Lys
340 345 350
Val Asp Ile Ser Leu Val Gly Pro Phe Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ser
355 360 365
Ser Met Phe Ala Val Gly Leu Leu Leu Ser Ser Asn Pro Ala Ala Ser
370 375 380
Gly Glu Leu Val Gln Val Pro Ser Thr Leu Phe Gln Gly Ser Leu Leu
385 390 395 400
Leu Gly Leu Ile Ser Arg Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Ala Met His Gly
405 410 415
Ala Met Val Ser Ile His Pro Leu Val Ile Ala Gly Trp Cys Gly Leu
420 425 430
Thr Thr Ser Ala Phe Asn Met Leu Pro Val Gly Cys Leu Asp Gly Gly
435 440 445
Arg Ala Val Gln Gly Ala Phe Gly Lys Gly Ser Leu Ile Gly Phe Gly
450 455 460
Leu Ala Thr Tyr Thr Leu Leu Gly Leu Gly Val Leu Gly Gly Pro Leu
465 470 475 480
Ser Leu Pro Trp Gly Leu Tyr Val Leu Ile Cys Gln Arg Thr Pro Glu
485 490 495
Lys Pro Cys Leu Asn Asp Val Thr Glu Val Gly Thr Trp Arg Lys Ala
500 505 510
Ala Leu Gly Val Ala Ile Phe Leu Val Val Leu Thr Leu Leu Pro Val
515 520 525
Trp Asp Glu Leu Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gly Leu Val Thr Ser Phe
530 535 540
<210>6
<211>547
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
Met Gly Thr Leu Thr Ser Cys Ser Phe Ser Ser Met Asn Ile Arg Phe
1 5 10 15
Arg Leu Asn Pro Pro Val Asn Tyr Thr Phe Ser Arg Arg Ile Gln Leu
20 25 30
Lys Arg Met Ser Lys Arg Asn Phe Gly Arg Leu Ile Ile Arg Cys Ser
35 40 45
Ser Gly Ser Ser Gly Asn Gly Ser Ser Asn Asp Ser Gly Ser Ser Ser
50 55 60
Asp Gly Lys Leu Glu Lys Asp Ser Ser Asn Leu Ala Thr Val Thr Glu
65 70 75 80
Glu Thr Thr Glu Glu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gly Val Glu
85 90 95
Asn Asp Ser Asp Asp Ser Pro Val Ser Ile Ser Ser Arg Pro Thr Ile
100 105 110
Ser Thr Val Gly Ser Thr Tyr Asn Asn Phe Gln Val Asp Ser Phe Lys
115 120 125
Leu Met Glu Leu Leu Gly Pro Glu Lys Val Asp Pro Ser Asp Val Lys
130 135 140
Phe Ile Lys Glu Lys Leu Phe Gly Tyr Ser Thr Phe Trp Val Thr Lys
145 150 155 160
Glu Glu Pro Phe Gly Asp Leu Gly Glu Gly Ile Leu Phe Leu Gly Asn
165 170 175
Leu Arg Gly Lys Arg Glu Asp Val Phe Ala Lys Leu Gln Ser Gln Leu
180 185 190
Ser Glu Ile Met Gly Asp Lys Tyr Asn Leu Phe Met Val Glu Glu Pro
195 200 205
Asn Ser Glu Gly Pro Asp Pro Arg Gly Gly Pro Arg Val Ser Phe Gly
210 215 220
Met Leu Arg Lys Glu Val Ser Glu Pro Gly Pro Thr Thr Leu Trp Gln
225 230 235 240
Tyr Val Ile Ala Phe Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Gly Ser Ser Val
245 250 255
Glu Leu Gly Ile Ala Ser Gln Ile Thr Arg Leu Pro Pro Glu Val Val
260 265 270
Lys Tyr Phe Thr Asp Pro Asn Ala Ile Glu Pro Pro Asp Met Gln Leu
275 280 285
Leu Leu Pro Phe Val Asp Ser Ala Leu Pro Leu Ala Tyr Gly Val Leu
290 295 300
Gly Val Gln Leu Phe His Glu Ile Gly His Phe Leu Ala Ala Phe Pro
305 310 315 320
Arg Asn Val Lys Leu Ser Ile Pro Phe Phe Ile Pro Asn Ile Thr Leu
325 330 335
Gly Ser Phe Gly Ala Ile Thr Gln Phe Lys Ser Ile Leu Pro Asp Arg
340 345 350
Lys Ala Lys Val Asp Ile Ser Leu Ala Gly Pro Phe Ala Gly Ala Ala
355 360 365
Leu Ser Ser Ser Met Phe Ala Val Gly Leu Leu Leu Ser Ser Asn Pro
370 375 380
Ala Ala Ala Gly Glu Leu Val Gln Val Pro Ser Thr Leu Phe Gln Gly
385 390 395 400
Ser Leu Leu Leu Gly Leu Ile Ser Arg Ala Thr Leu Gly Tyr Gly Ala
405 410 415
Met His Gly Ala Met Val Ser Ile His Pro Leu Val Ile Ala Gly Trp
420 425 430
Cys Gly Leu Thr Thr Ser Ala Phe Asn Met Leu Pro Val Gly Cys Leu
435 440 445
Asp Gly Gly Arg Ala Val Gln Gly Ala Phe Gly Lys Gly Ser Leu Ile
450 455 460
Gly Phe Gly Leu Ala Thr Tyr Thr Leu Leu Gly Leu Gly Val Leu Gly
465 470 475 480
Gly Pro Leu Ser Leu Pro Trp Gly Leu Tyr Val Leu Ile Cys Gln Arg
485 490 495
Thr Pro Glu Lys Pro Cys Leu Asn Asp Val Thr Glu Val Gly Asn Trp
500 505 510
Arg Lys Ala Ala Leu Gly Val Ala Ile Phe Leu Val Val Leu Thr Leu
515 520 525
Leu Pro Val Trp Asp Glu Leu Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gly Leu Val
530 535 540
Thr Ser Phe
545
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
acctgttcat ggtggaagag 20
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
ctgcgtggtt gacgagttc 19
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>9
caatcgttgt ccagtgtcta tttg 24
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>10
ccccaaggaa gtgacagagg 20
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>11
caatcgttgt ccagtgtcta tttg 24
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>12
ccccaaggaa gtgacaagag 20