一种HIV免疫原及其制备.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102558314 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102558314 A *CN102558314A* (21)申请号 201010578316.0 (22)申请日 2010.12.08 C07K 14/155(2006.01) C07K 19/00(2006.01) A61K 39/21(2006.01) A61K 39/295(2006.01) A61P 31/18(2006.01) (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街 2699 号 (72)发明人 单亚明 孔维 张丽双 (54) 发明名称 一种 HIV 免疫原。

2、及其制备 (57) 摘要 本发明涉及一种引起广谱中和抗体的 HIV 免 疫原及其制备的疫苗。该 HIV 免疫原包括一种肽 序列， 该肽序列中包括HIV的4E10和/或2F5和/ 或 Z13 抗原表位序列。本发明的免疫原能够激发 针对 HIV 病毒的广谱中和抗体， 克服了现有技术 中因为 HIV 高变异性导致的现有疫苗诱发抗体的 延迟性的问题。 在动物免疫实验表明， 本发明的肽 免疫原辅以佐剂可诱导免疫动物血清产生特异性 抗体， 且所诱导抗体具有广泛中和代表型 HIV 侵 染细胞能力， 具有开发成为临床抗 HIV 疫苗和辅 助增强 HIV 疫苗的潜力。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页。

3、 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种 HIV 免疫原， 包括一种肽序列， 所述肽序列包括 HIV 的 4E10 和 / 或 2F5 和 / 或 Z13 抗原表位序列中的至少一个。 2. 如权利要求 1 所述的 HIV 免疫原， 其中所述肽序列进一步包括 Th 细胞表位序列和 / 或破伤风毒素 830-843 序列和 / 或口蹄疫病毒 200-213 序列。 3. 如权利要求 1-2 中任一项所述的 HIV 免疫原， 其中所述肽序列至少部分被选自乙酰 基、 酰胺基、。

4、 烷基羰基和链烯基羰基组成的组中的至少一种修饰基团修饰。 4. 如权利要求 2 或 3 所述的 HIV 免疫原， 其中所述 HIV 的 4E10 和 / 或 2F5 和 / 或 Z13 抗原表位序列、 Th 细胞表位序列、 以及破伤风毒素 830-843 序列和 / 或口蹄疫病毒 200-213 序列分别通过柔性序列互相连接。 5.如权利要求4所述的HIV免疫原， 其中所述柔性序列包括甘氨酸组成的序列、 赖氨酸 组成的序列、 6- 氨基己酰基组成的序列或它们的组合。 6.如权利要求5所述的HIV免疫原， 所述免疫原包括 ： N末端乙酰基化或酰胺化的4E10 抗原表位序列， 所述柔性序列为 KK。

5、KK-6- 氨基己酰基或两个相连的 6- 氨基己酰基。 7. 一种 HIV 疫苗， 包括如权利要求 1-6 中任一项所述的免疫原。 8. 如权利要求 7 所述的 HIV 疫苗， 进一步包括佐剂， 所述佐剂包括氢氧化铝佐剂、 短小 棒状杆菌、 脂多糖、 细胞因子或明矾， 或为油佐剂或水型佐剂。 权 利 要 求 书 CN 102558314 A 2 1/5 页 3 一种 HIV 免疫原及其制备 技术领域 0001 本发明涉及一种引起广谱中和抗体的 HIV 免疫原及其制备的疫苗， 特别涉及一种 具有广谱保护作用的新型 HIV 疫苗。 背景技术 0002 艾滋病是全球所面临的最重大挑战之一， 严重危害。

6、社会进步与经济增长， 已造成 6000 多万人被感染， 其中 3000 万人已经死亡， 目前存活的感染者约为 3320 万， 其中 90以 上的病例发生在发展中国家。 0003 迄今为止， 在各国政府与国际组织强有力的支持下， 世界上先后开展了 100 多个 临床试验， 但尚未有一个成功上市的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研制困难的一个主要原因是 由于艾滋病病毒的特殊性， 即 HIV-1 具有高度的变异性。以往的疫苗所选择的抗原表位主 要是自然感染中的优势抗原表位， 而这些抗原表位是 HIV-1 中变异频率最高的位点。因此， 以这些抗原构建的疫苗诱导出的抗体具有延迟性， 无法中和已经发生突变的 HIV。

7、-1。 0004 因此， 在艾滋病疫苗研究中所存在的一个重要问题是如何通过保守免疫原设计来 诱导具有广谱保护作用的新疫苗。 发明内容 0005 为了解决现有技术中由于 HIV 变异频率高而导致的抗体无法中和已经突变的 HIV 的问题， 本发明提供了一种 HIV 免疫原， 包括一种肽序列， 所述肽序列中包括 HIV 的 4E10 和 / 或 2F5 和 / 或 Z13 抗原表位序列中的至少一个， 模拟 HIV 病毒 gp41 上 MPER 区融合前的天 然状态， 从而使其产生特异性更强的抗体。4E10、 2F5 和 Z13 抗原表位序列分别为目前分离 得到的广泛中和抗体4E10抗体、 2F5抗体。

8、和Z13抗体所识别的抗原表位序列， 识别高度保守 的 HIV-1gp41 近膜端外部区 (membrane proximal external region， MPER)。不论 HIV 病 毒如何变异， 其gp41近膜端外部区MPER基本保持保守， 所以针对该区域设计的免疫原产生 的抗体能够避免由于病毒的变异导致的无法中和的问题。其中 4E 10 能以较低的浓度中和 HIV-1 原始病毒株在内 22 株病毒株的全部亚型病毒， 2F5 可中和大约 67左右的病毒。同 时本发明的免疫原由于具有分枝肽结构， 包含多个分枝， 分子量较大， 能够增强该免疫原的 免疫原性， 而不需要另外的载体蛋白。本发明。

9、中， 优选 4E10 表位序列。更优选所述分枝肽 有 3 至 4 个分枝均包括 4E10 表位序列。 0006 在一个实施方式中， 本发明所述HIV免疫原的上述肽序列可进一步包括Th细胞表 位序列。所述 Th 细胞表位序列包括 PADRE。通过 B、 T 细胞双信号识别， 有助于增强机体对 抗原的免疫应答， 并能产生广谱的保护作用。 0007 在一个实施方式中， 上述 HIV 免疫原的分枝肽序列也可进一步包括破伤风毒素 830-843 序列和 / 或口蹄疫病毒 200-213 序列， 以增强其免疫原性。 0008 上述 HIV 免疫原， 其中所述肽至少部分分枝被选自乙酰基、 酰胺基、 烷基羰基。

10、和链 烯基羰基组成的组中的至少一种修饰基团修饰。优选乙酰基和 / 或酰胺基。所述烷基羰基 说 明 书 CN 102558314 A 3 2/5 页 4 可用通式 CH3(CH2)nCO- 表示， 其中 n 可为 1-16 中的任意整数， 优选 10、 12、 14 和 16。所述链 烯基羰基可用通式 R(CH2)mCO- 表示， 其中 R 为烯基、 二烯基或三烯基， 例如， CH3(CH2)mCH CH-、 CH3CH2CH CHCH2CH CH-、 CH3CH2CH CHCH2CH CHCH2CH CH ； m 和 m 可为 1-10 中 的任意整数， 优选 7。上述修饰基团可与所述分枝肽的。

11、 N 末端 - 氨基、 C 末端 - 羧基或 任一氨基酸的侧链基团共价连接。优选 N 末端 - 氨基。在所述分枝肽的末端或侧链添加 修饰基团以保护所述分枝肽， 防止过早被酶解而影响其免疫原性。 0009 上述 HIV 的 4E10 和 / 或 2F5 抗原表位序列、 Th 细胞表位序列、 以及破伤风毒素 830-843序列和/或口蹄疫病毒200-213序列优选分别通过柔性序列互相连接， 以增加各条 链的自由度， 协助其形成正确的构象。 0010 所述柔性序列包括甘氨酸组成的序列、 赖氨酸组成的序列、 6- 氨基己酰基 (Ahx) 组成的序列或它们的组合。优选 KKKK-Ahx。优选地， 各抗原。

12、表位序列侧翼还可加上其天然 存在时的侧翼序列。以 4E10 为例， 可以加上其侧翼序列 YI， 即 NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx。 优 选 其 N 末 端 被 修 饰 基 团 修 饰， 即 乙 酰 基 (Ac)-NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx， 或 酰 胺 基 -NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx。 0011 本发明优选的 HIV 免疫原包括 ： N 末端乙酰基化或酰胺化的 4E10 抗原表位序列， 所述柔性序列为 KKKK-6- 氨基己酰基或两个相连的 6- 氨基己酰基。 0012 本发明还提供了一种 HIV 疫苗， 包括上述任一种免疫原。 0013 该 H。

13、IV 疫苗， 可进一步包括佐剂， 例如包括氢氧化铝佐剂、 短小棒状杆菌、 脂多糖、 细胞因子或明矾， 或为油佐剂或水型佐剂。优选油溶剂。 0014 本发明的 HIV 疫苗可用于肌肉注射、 皮下注射、 皮内注射、 腹腔注射、 口服给药、 肺 部给药、 鼻腔给药、 口腔给药、 阴道肛门给药。本领域技术人员可利用本领域公知的技术对 其进行配方， 以使其适合相应给药方式。本文中不再赘述。 0015 优选本发明的 HIV 疫苗在初次免疫及加强免疫过程中可采用同种抗原核心表 位 - 辅助 T 细胞表位， 也可以同种抗原核心表位 - 不同辅助 T 细胞表位交替进行免疫 ； 并可 以同种抗原核心表位的多肽疫苗。

14、和病毒疫苗交替免疫。 0016 本发明的免疫原和疫苗能够激发机体产生对 HIV 病毒具有广谱中和活性的抗体， 从而克服了现有技术中因为 HIV 的频繁突变而导致的疫苗产生的抗体无法与突变后的病 毒中和的问题。 附图说明 0017 图 1 为为本发明优选实施方式的免疫原以及对照肽与抗体结合的 Western blot 图。其中左图为电泳之后染色的图， 右图为经一抗和二抗结合之后显色的图。 0018 其中 ： 0019 第 1 道 ： 0020 NK-284E10 和 2F5 双表位线性肽 ： 0021 Ac-NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-NH2 0022 第 2 道 。

15、： 0023 Ac-NK-174E10 表位四分枝肽 ： 0024 Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4 说 明 书 CN 102558314 A 4 3/5 页 5 0025 第 3 道 ： 0026 Ac-NK-Acp-16 第二批次 4E10 表位四分枝肽 ： 0027 Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4 0028 第 4 道 ： 0029 Ac-NK-16-Ahx-3 对照四分枝肽 ： 0030 Ac-NGSGSGKWEGGPSKKK-Ahx-MAP4 0031 第 5 道 ： 0032 Ac-NK-16-Ahx-24E10 表位线性肽 ： 003。

16、3 Ac-NWFDITNWLWYIKKKK-Ahx-OH 0034 一抗 ： B 为 4E10 单克隆抗体 具体实施方式 0035 高度保守的 HIV-1gp41 近膜端外部区被认为是最具潜力的中和抗体设计靶点。目 前为止分离得到的七个广泛中和抗体有三个 (2F5， 4E10 和 Z13 抗体 ) 是识别该区域的， 其 中 4E10 能以较低的浓度中和 HIV-1 原始病毒株在内 22 株病毒株的全部亚型病毒， 2F5 可 中和大约 67左右的病毒。这三个抗体 (2F5， 4E10 和 Z13 抗体 ) 所识别的表位分别称为 2F5， 4E10 和 Z13 表位。具体而言， 2F5 表位的氨基。

17、酸序列包括下列序列 ： QELLELDKWASLW 或 其变异序列 ； 4E10 表位的氨基酸序列包括下列序列 ： NWFDITNWLW 或 NWFNITNWLW 或此二者 的变异序列 ； Z13 表位的氨基酸序列包括下列序列 ： WASLWNWFDITN 或其变异序列。 0036 下文中结合具体实施例说明了本发明的优势和技术效果。 本发明的保护范围以权 利要求书限定的为准， 实施例仅仅是示例性地说明本发明的理念和原则。 0037 实施例 1 0038 抗原表位的设计 0039 选取 HIV-1gp41MPER 上的 4E10 和 / 或 2F5 识别表位作为抗原表位。合成下列氨 基酸序列 ：。

18、 0040 0041 说 明 书 CN 102558314 A 5 4/5 页 6 0042 另外， 还可加入通用 Th 细胞表位。 0043 实施例 2 0044 合成抗原多肽与抗体结合活性表征 0045 合成的抗原多肽进行 Tricine 电泳， 以 4E10 抗体作一抗， AP 标记抗人二抗， 结果 见图 1。 0046 由图 1 可见， 4E10 表位线性肽、 4E10 和 2F5 双表位线性肽均具有与 HIV 广谱中和 抗体 4E10 结合的活性， 优于仅仅包括无关肽序列的对照四分枝肽。 0047 说明了本发明的免疫原能够形成正确的表位结构， 与相应的抗体结合。 0048 实施例 3。

19、 0049 HIV 疫苗的豚鼠免疫实验 0050 实验分 4 组， 实验分 4 组， 每组豚鼠 8 只。组 2 ： MPER 表位线性肽 + 弗式佐剂 ； 组 4 ： MPER 表位线性肽 + 水型佐剂。 0051 豚鼠皮下 ( 四肢 ) 多点注射， 初次免疫后每隔 15 天加强 1 次， 0.5ug/g 体重。四次 免疫后心脏取血检测针对 MPER 的抗体产生情况， 根据抗体效价进行中和活性评价。结合抗 体检测流程 ： 肽包被孔 BSA 封闭待测血清羊抗豚鼠 IgG-HRP TMB OD450。血清 稀释度 1 30。 0052 实验结果 0053 针对 MPER 的抗体产生情况见表 1。 。

20、0054 抗体中和活性评价见表 2。 说 明 书 CN 102558314 A 6 5/5 页 7 0055 表 1. 本发明的 4E10 表位 MAP4 免疫豚鼠抗血清滴度检测 0056 0057 由表 1 结果可见， 本发明的肽在豚鼠中激发较高水平的有效免疫响应。 0058 另外， 用上述免疫产生的血清分别与不同 HIV 毒株进行中和反应， 结果如表 2 所 示。 0059 表 2. 豚鼠抗血清中和评价结果 0060 0061 0062 由表2的结果可见， 本发明的免疫原能够与多种变异的HIV毒株发生中和反应， 也 就是说， 能够广谱中和多种 HIV 变异毒株， 包括 Clade B， CladeAE 和 Clade BC 从而达到免 疫的作用。 说 明 书 CN 102558314 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102558314 A 8 。