一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103421873 B (45)授权公告日 2015.01.28 CN 103421873 B (21)申请号 201310337183.1 (22)申请日 2013.08.05 C12P 21/06(2006.01) A23L 3/3526(2006.01) A23K 1/17(2006.01) (73)专利权人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92 号 (72)发明人 王常青 连伟帅 (74)专利代理机构 山西五维专利事务所 ( 有限 公司 ) 14105 代理人 杨耀田 (54) 发明名称 一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法 (57)。

2、 摘要 本发明提供了一种具有抑菌作用的沙棘籽多 肽的制备方法， 步骤包括 ： 将沙棘籽渣经过浸泡 处理后， 用单宁酶、 植酸酶组成的复合酶水解处理 沙棘籽渣， 再用酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶联合水 解底物中的蛋白质， 将多肽水解液低温静置过夜， 然后通过低温高速离心去除大分子杂质， 离心上 清液浓缩、 干燥后得到沙棘籽抑菌多肽。 体外抑菌 培养试验表明， 此多肽对大肠杆菌、 沙门氏菌等常 见细菌都具有良好的抑制作用。 本多肽口感好， 没 有副作用， 可以作为防腐剂添加到食品或饲料中 使用。 (51)Int.Cl. 审查员 高赟 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和。

3、国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103421873 B CN 103421873 B 1/1 页 2 1. 一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 、 将沙棘籽渣以 1:8 20 的料液比加水， 于 20 30的环境下放置过夜 ； 2） 、 在 pH3 5、 温度 35 50条件下， 按沙棘籽渣质量的 0.1 0.5% 分别加入植酸 酶与单宁酶， 水解 ,6-15h， 水解完后 90保温 10 20min 灭酶 ； 3） 、 在 pH2 4， 温度 40 55条件下， 按沙棘籽渣中每 1。

4、00 克蛋白的质量加入 2 8 克的酸性蛋白酶， 水解 2 7h， 水解完后 90灭酶 10 20min ； 4） 、 在 pH5 7、 温度 45 55条件下， 按沙棘籽渣中每 100 蛋白的质量加入木瓜蛋白 酶 0.5 5 克， 水解 2 5h， 水解完后煮沸灭酶 ； 5） 、 将酶解液在 0 4下静置 6 12h 后， 在 0 4， 以 10000 12000r/min 高速 离心 10 20min， 取离心上清液用截留分子量为 500Da 的纳滤膜纳滤， 取截留液浓缩、 干燥 后得到抑菌沙棘籽多肽。 2. 如权利要求 1 所述的一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法， 其特征在于， 所。

5、 述的酸性蛋白酶是 3.350 酸性蛋白酶或 537 酸性蛋白酶。 3.如权利要求1或2所述制备方法制备的沙棘籽多肽作为防腐剂在食品添加剂或饲料 添加剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103421873 B 2 1/4 页 3 一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及植物多肽的制备， 具体涉及沙棘籽脱脂后残渣的再利用， 是一种具有 抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法。 背景技术 0002 脱脂沙棘籽渣为沙棘油加工生产后的废弃物， 通常会作为动物饲料或弃去。脱脂 沙棘籽渣中含有 30% 左右的蛋白质， 且氨基酸配比良好。目前对于沙棘籽渣的开发利用极 少， 只有关于。

6、提取其中原花青素的开发利用， 但是由于其开发成本大于常见的葡萄籽中的 原花青素而未被广泛利用。关于沙棘籽多肽的研究有， 黄鹏、 苏宁等人发表的 沙棘生物活 性肽的制备及功效研究 ， 此研究通过酶解法制备出一种具有抗氧化作用多肽， 采用的蛋白 酶为中性蛋白酶， 没有分离纯化工艺。 连伟帅、 高英、 王常青等人发表的 用沙棘籽渣加工饲 料级活性肽 ， 其中制备沙棘籽多肽采用的蛋白酶为碱性蛋白酶， 多肽用截留分子量 2000Da 和 3500Da 的超滤膜超滤分离出分子量为 2000 3500Da 的多肽， 该多肽对大肠杆菌， 金黄 色葡萄球菌具有一定的抑制作用。 但是， 其采用的蛋白酶直接水解的方。

7、法， 此法制备多肽的 工艺多肽得率低， 多步超滤膜分离使得多肽损失大， 碱性蛋白酶水解出的多肽口感涩、 有异 味只能用于饲料用添加剂。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法， 该方法水解 得率高、 分离过程中多肽损失少、 产品口感好。 0004 本发明提供的一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法， 以沙棘籽渣 （沙棘籽 脱脂后的残渣） 的为原料， 经过植酸酶、 单宁酶预处理后， 用酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶进行 水解， 后经过高速、 低温离心和纳滤分离制得， 具体包括以下步骤 ： 0005 1） 、 将沙棘籽渣以 1:8 20 的料液比加水， 于 20 3。

8、0的环境下放置过夜 ； 0006 2） 、 在 pH3 5、 温度 35 50条件下， 按沙棘籽渣质量的 0.1 0.5% 分别加入 植酸酶与单宁酶， 水解 ,6-15h， 水解完后 90保温 10 20min 灭酶 ； 0007 3） 、 在 pH2 4， 温度 40 55条件下， 按沙棘籽渣中每 100 克蛋白加入 2 8 克 的酸性蛋白酶水解 2 7h， 水解完后 90灭酶 10 20min ； 0008 4） 、 在 pH5 7、 温度 45 55条件下， 按沙棘籽渣中每 100 克蛋白加入 0.5 5 克木瓜蛋白酶水解 2 5h， 水解完后煮沸灭酶 ； 0009 5） 、 将酶解液在。

9、 0 4下放置 6 12h 后， 在 0 4， 以 10000 12000r/min 高速离心1020min， 取离心上清液， 用截留分子量为500Da的纳滤膜纳滤， 取截留液浓缩、 真空干燥后得到抑菌沙棘籽多肽。 0010 与现有技术相比， 本发明具有如下优点和效果 ： 0011 1. 在用蛋白酶水解前， 用单宁酶与植酸酶的复合酶水解处理沙棘籽， 水解沙棘籽 渣中与蛋白质结合的单宁与植酸， 提高了沙棘籽渣中蛋白质的溶出量， 相比于 用沙棘籽渣 说 明 书 CN 103421873 B 3 2/4 页 4 加工饲料级活性肽 中所述的沙棘籽多肽制备工艺， 多肽水解得率大大提高， 从66.46%提。

10、高 至 80% 以上。 0012 2. 在沙棘籽多肽分离纯化过程中， 首先将酶解液在 0 4下放置， 然后在 0 4高速离心除去大分子杂质， 再经截留分子量为 500Da 的纳滤膜处理除去小分子杂质。在 用沙棘籽渣加工饲料级活性肽 的多肽制备工艺中， 采用的多级超滤膜分离， 分离过程中 随着浓差极化加重， 多肽被滤膜吸附的损失率增高， 多肽的损失率一般在 25% 以上。本发明 采用低温静置和低温高速离心， 可以有效去除绝大多数大分子多肽、 蛋白和前工序多酶水 解不完全的大分子 ； 然后用 500Da 的纳滤膜纳滤， 可以滤出氨基酸、 灰分和小分子杂质， 得 到了 500 5000Da 的抑菌多。

11、肽。减少了分离过程中多肽损失。与多级超滤膜分离相比， 多 肽损失率从 25 30% 降低至 8% 以下。 0013 3. 本工艺采用酸性蛋白酶 - 木瓜蛋白酶组合水解得到的沙棘籽多肽， 不但具有抑 菌效果， 而且口感好， 无异味， 不影响食用。 用沙棘籽渣加工饲料级活性肽 所报道的多肽 采用碱性蛋白酶制备， 由于有大量疏水性肽键被水解， 水解出的多肽口感苦涩、 有异味， 影 响食用。 0014 4. 通过 G-25 凝胶柱层析对产品进行分离， 采用面积归一法对凝胶色谱图分析， 得 到本产品多肽的分子量 97% 以上分布在 500 5000Da 之间。与 用沙棘籽渣加工饲料级活 性肽 所报道的有。

12、所不同。 附图说明 0015 图 1 实施例 1 沙棘籽多肽样品对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果图 0016 图 2 实施例 2 沙棘籽多肽样品对金黄色葡萄球菌菌的抑菌效果图 0017 图 3 实施例 3 沙棘籽多肽样品对鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果图 具体实施方式 0018 实施例 1 0019 取 20g 粉碎好的沙棘籽渣于烧杯中， 加入 200ml 蒸馏水， 于 25室温下放置过夜。 调pH至4.0， 加入0.1g植酸酶与0.1g单宁酶后于50水浴锅中保温8h。 然后加热至90 灭酶处理15min， 冷却后调pH至2.5， 加入0.33g酸性蛋白酶于45下水解7h， 加热至90 灭酶15min， 。

13、冷却后调pH至7.0， 加入0.15g木瓜蛋白酶于55下水解3h， 加热至90灭酶 15min。将酶解液在 0 4下放置 8h 后。在 0 4， 以 12000r/min 高速离心 10min， 取 离心上清液用截留分子量为 500Da 的纳滤膜纳滤， 取纳滤截留液做抑菌试验。抑菌试验采 用的细菌为鼠伤寒沙门氏菌， 培养基为营养琼脂培养基。将培养基加热煮沸， 冷却至 50 60时倒入培养皿中， 凝固后分别将 2 种细菌均匀接种至培养基表面， 涂抹均匀。在培养基 表面打上直径 3 4mm 的小孔， 在小孔中点稀释到 10mg/ml 的样品 20 30ul 后于 37恒 温培养箱中培养 48h 后。

14、观察抑菌圈大小。培养 48h 后， 该样品对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈 直径为 5.8mm（见图 1） ， 说明本样品对对以上该菌有抑制作用。 0020 本试验以水解前的沙棘籽渣总蛋白含量为基准， 计算酶水解提取和分离步骤的多 肽得率。多酶水解液中多肽提取率为 81.20%， 纳滤样品的多肽提取率为 74.29%， 分离纯化 过程中的多肽损失为 8.5%。 说 明 书 CN 103421873 B 4 3/4 页 5 0021 实施例 2 0022 取 20g 粉碎好的沙棘籽渣于烧杯中， 加入 300ml 蒸馏水浸泡过夜。调 pH 至 4.5， 加 入 0.2g 植酸酶与 0.1g 单宁酶后于 4。

15、5水浴锅中保温 8h， 期间每 1h 搅拌 2-3min。然后加 热至 90灭酶处理 15min， 冷却后调 pH 至 3.5， 加入 0.5g 酸性蛋白酶于 50下水解 4h， 加 热至 90灭酶 15min， 冷却后调 pH 至 6.5， 加入 0.1g 木瓜蛋白酶于 50下水解 5h， 加热至 90灭酶 15min， 然后加热至 90灭酶处理 15min。将酶解液在 0 4下放置 10h 后。在 0 4， 以 10000r/min 高速离心 20min， 取离心上清液用截留分子量为 500Da 的纳滤膜纳 滤， 取纳滤截留液做抑菌试验。 抑菌试验采用的细菌为金黄色葡萄球菌， 培养基为高盐。

16、肉汤 培养基， 配方为 ： 牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g， 琼脂 20g， NaCl 75g， 1000ml 水。培养与观察方法 同实施例 1 中所述。培养 48h 后观察实验结果， 该样品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为 6.8mm（见图 2） ， 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌， 说明本产品多肽对该菌具有抑制作用。 0023 以水解前的沙棘籽渣总蛋白含量为基准， 计算酶水解提取和分离步骤的多肽得 率。多酶水解液中多肽提取率为 82.07%， 纳滤样品的多肽提取率为 75.30%， 分离纯化过程 中的多肽损失为 8.25%。与此同时， 本试验同时按照 “用沙棘籽渣加工饲料级活性肽” 的方 法，。

17、 用沙棘籽渣制备了多肽， 计算了总多肽得率和各步多肽得率。 结果显示， 本发明比 用沙 棘籽渣加工饲料级活性肽 所报道方法的多肽得率明显提高。见表 1 0024 表 1 多肽提取率对照表 0025 0026 实施例 3 0027 取 20g 粉碎好的沙棘籽渣于烧杯中， 加入 400ml 蒸馏水浸泡过夜。调 pH 至 5， 加入 0.2g 植酸酶与 0.1g 单宁酶后于 38水浴锅中保温 14h。然后加热至 90灭酶处理 15min， 冷却后调 pH 至 4.0， 加入 0.4g 酸性蛋白酶于 55下水解 3h， 加热至 90灭酶 15min， 冷却 后调pH至7， 加入0.25g木瓜蛋白酶于5。

18、2下水解1.5h， 然后加热至90灭酶处理15min。 将酶解液在 0 4下放置 12h 后。在 0 4， 以 11000r/min 高速离心 15min， 取离心上 清液用截留分子量为 500Da 的纳滤膜纳滤， 取纳滤截留液做抑菌试验。抑菌试验采用的细 说 明 书 CN 103421873 B 5 4/4 页 6 菌为鸡白痢沙门氏菌， 培养基为营养肉汤培养基。培养与观察方法同实施例 1 中所述。培 养 48h 后， 该样品对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径为 6.4mm（见图 3） ， 鸡白痢沙门氏菌为对 家禽有危害的致病菌， 说明本样品能够抑制禽饲料中常见致病菌的生长。 0028 本试验以水解前的沙棘籽渣总蛋白含量为基准， 计算酶水解提取和分离步骤的多 肽得率。多酶水解液中多肽提取率为 80.82%， 纳滤样品的多肽提取率为 73.93%， 分离纯化 过程中的多肽损失为 8.53%。 说 明 书 CN 103421873 B 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103421873 B 7 。