大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102584992 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102584992 A *CN102584992A* (21)申请号 201110001650.4 (22)申请日 2011.01.06 C07K 16/12(2006.01) C07K 14/245(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12N 15/70(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/569(2006.01) A61K 39/40(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 北京大北农科技集团股份。

2、有限公司 地址 100080 北京市海淀区中关村大街 27 号中关村大厦 14 层大北农集团 申请人 福州大北农生物技术有限公司 (72)发明人 杜金玲 牟巍 赵亚荣 郭书豪 卢会英 王勇鹣 (54) 发明名称 大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法 和应用 (57) 摘要 本发明属于兽医生物技术领域， 具体涉及大 肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法和应 用。本发明的抗体是以克隆、 表达、 纯化的禽致病 性大肠杆菌 O78（AvianpathogenicEscherichiaco liAPECO78） 外膜蛋白为抗原免疫 BALB/c小鼠， 采 用杂交瘤技术制备而成。 该抗体特异性高、 敏感。

3、性 强， 为今后通过免疫学方法快速、 特异性的检测大 肠杆菌感染奠定了实验基础， 同时通过实验还证 明了本发明的单克隆抗体对同型大肠杆菌感染具 有良好的中和活性和保护效率， 可用于大肠杆菌 病的防治。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体， 其特征在于 ： 以原核表达、 纯化的禽致病性大 肠杆菌 O78(Avian pathogenic Escherichia co。

4、li APEC O78) 的外膜蛋白作为抗原， 加入弗 氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化分别制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫 原， 免疫 BALB/c 小鼠， 采用杂交瘤技术制备单抗， 所制备抗体免疫球蛋白类型为 IgG2a， 其 轻链为 链抗体。 2. 如权利要求 1 所述的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体， 其特征在于 ： 弗氏完全佐剂免 疫原和弗氏不完全佐剂免疫原中禽致病性大肠杆菌 O78的外膜蛋白与弗氏完全佐剂、 弗氏 不完全佐剂体积比均为 1 1。 3. 如权利要求 1-2 任一项所述的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法， 其制备步 骤如下 ： (1) 禽致病性大肠杆菌 O78外。

5、膜蛋白 OMPA 原核表达及纯化 根据大肠杆菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物， PCR 扩增禽致病性大肠杆菌 O78外 膜蛋白 OMPA， 将 OMPA 先连接到 pMD18T 上测序， 测序鉴定正确的 OMPA 分别以 BamH I、 Xhol 进行双酶切后克隆到 pET-28a(+) 上， 转化 DH5 感受态细胞， 通过卡那霉素抗性筛选得到 的阳性质粒 pET-28a(+)-OMPA 再转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过抗性筛选阳性表达菌株， 以 IPTG诱导目的蛋白表达， 并以Ni-NTA His.Bind Resin纯化柱纯化禽致病性大肠杆菌O78外 膜蛋白 OMPA， 最后调。

6、整浓度至 50g/mL ； (2) 免疫性抗原的制备 纯化后的禽致病性大肠杆菌O78外膜蛋白OMPA分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐 剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原 ； (3)BALB/c 小鼠免疫 8 周龄 BALB/c 小鼠腹腔注射制备的禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白弗氏完全佐剂免疫 原 0.5mL/ 只 ； 免疫后 7 天和 14 天后分别以弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂量进 行加强免疫 ； (4) 单抗制备 利用 PEG 法， 进行细胞融合， 融合 7 10 天后， 对有生长的杂交瘤细胞进行阳性筛选， 以全菌包被， 应用间接 ELISA 筛选阳性杂交瘤细胞。

7、， 获得禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白的 杂交瘤细胞株， 并对此株单抗进行效价测定、 亚类鉴定、 稳定性测定及特异性与中和活性测 定。 4. 如权利要求 3 所述的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法， 其特征在于 ： 禽致 病性大肠杆菌 O78外膜蛋白的引物序列如下 ： 上游引物 ： ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA 下游引物 ： TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA。 5. 如权利要求 1-2 任一项所述的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体在检测大肠杆菌中的 应用。 6. 如权利要求 1-2 任一项所述的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体在制备防治大肠杆菌 病的制剂。

8、中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102584992 A 2 1/4 页 3 大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用， 属于生物技术领 域。 背景技术 0002 禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌引起， 为对养禽业危害最为严重的疫病之 一， 目前， 对大肠杆菌病的预防主要采用疫苗和抗菌药物。但大肠杆菌血清亚型众多， 各血 清型间的交叉免疫效果不佳， 给疫苗和药物的预防带来一定困难。 0003 单克隆抗体是指由一个 B 细胞分化增殖的子代细胞产生的针对单一抗原决定簇 的抗体， 单抗具有较强的病原体特异性， 不影响。

9、正常组织和细胞， 相对比较安全， 在细菌和 病毒病的诊断和治疗方面都发挥重要作用， 也是研究蛋白质结构与功能的重要工具。大肠 杆菌的外膜蛋白位于大肠杆菌菌体的表面， 具有良好的免疫原性， 可加快巨噬细胞对抗原 的提呈作用， 激活淋巴细胞的增殖反应， 刺激机体产生体液免疫和细胞免疫 ； 而且更为重要 的是大肠杆菌的外膜蛋白在不同血清型菌株间具有交叉保护作用， 能抵抗同源和异源菌株 的攻击。在目前一些大肠杆菌病的防治中都具有重要的应用价值。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体， 该抗体是以克隆、 表达、 纯化的禽致病性大肠杆菌O78(Avian pathogeni。

10、c Escherichia coli APEC O78)外膜蛋白为 抗原免疫 BALB/c 小鼠， 采用杂交瘤技术制备而成。本发明的单克隆抗体对同型大肠杆菌感 染具有良好的中和活性和保护效率， 可用于大肠杆菌的防治 ； 而且该单克隆抗体特异性高、 敏感性强的， 为今后通过免疫学方法快速、 特异性的检测大肠杆菌感染奠定了实验基础。 0005 本发明的另一目的是提供该大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法和应用。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ： 0007 本发明提供一种大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体， 其特征在于 ： 以原核表达、 纯化的 禽致病性大肠杆菌O78(Avian path。

11、ogenic Escherichia coli APEC O78)的外膜蛋白作为抗 原， 加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化分别制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全 佐剂免疫原， 免疫 BALB/c 小鼠， 采用杂交瘤技术制备单抗， 所制备抗体免疫球蛋白类型为 IgG2a， 其轻链为 链抗体。 0008 其中， 弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原中禽致病性大肠杆菌 O78的 外膜蛋白与弗氏完全佐剂、 弗氏不完全佐剂体积比均为 1 1。 0009 本发明还提供了该大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法， 其制备步骤如下 ： 0010 (1) 禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白 OMPA 原核表。

12、达及纯化 0011 根据大肠杆菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物， PCR 扩增禽致病性大肠杆菌 O78 外膜蛋白OMPA， 将OMPA先连接到pMD18T上测序， 测序鉴定正确的OMPA分别以BamH I、 Xhol 进行双酶切后克隆到 pET-28a(+) 上， 转化 DH5 感受态细胞， 通过卡那霉素抗性筛选得到 说 明 书 CN 102584992 A 3 2/4 页 4 的阳性质粒 pET-28a(+)-OMPA 再转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过抗性筛选阳性表达菌株， 以 IPTG诱导目的蛋白表达， 并以Ni-NTA His.Bind Resin纯化柱纯化禽致病性大肠杆菌O7。

13、8外 膜蛋白 OMPA， 最后调整浓度至 50g/mL ； 0012 (2) 免疫性抗原的制备 0013 纯化后的禽致病性大肠杆菌O78外膜蛋白OMPA分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完 全佐剂乳化制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原 ； 0014 (3)BALB/c 小鼠免疫 0015 8 周龄 BALB/c 小鼠腹腔注射制备的禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白弗氏完全佐剂 免疫原 0.5mL/ 只 ； 免疫后 7 天和 14 天后分别以弗氏不完全佐剂免疫原以相同的方法和剂 量进行加强免疫 ； 0016 (4) 单抗制备 0017 利用 PEG 法， 进行细胞融合， 融合 7 10 天后，。

14、 对有生长的杂交瘤细胞进行阳性筛 选， 以全菌包被， 应用间接 ELISA 筛选阳性杂交瘤细胞， 获得稳定表达禽致病性大肠杆菌 O78 外膜蛋白的杂交瘤细胞株， 并对此株单抗进行效价测定、 亚类鉴定、 稳定性测定及特异性与 中和活性测定。 0018 其中， 禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白的引物序列如下 ： 0019 上游引物 ： ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA 0020 下游引物 ： TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA 0021 本发明的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体可用于检测大肠杆菌。 0022 本发明的大肠杆菌外膜蛋白单克隆抗体还可用于制备防治大肠杆。

15、菌病的制剂。 0023 本发明中的禽致病性大肠杆菌 O78购自中国兽医药品监察所， 其外膜蛋白有一个 开放阅读框 (ORF)， 长 1041bp， 编码 346 个氨基酸， 前 21 个为信号肽， 成熟的 OmpA 由 325 个 氨基酸残基组成， 相对分子质量为37KD。 本发明中扩增到的禽致病性大肠杆菌O78外膜蛋白 大小 975bp， 原核表达的禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白分子量为 37KD。其中， 禽致病性大 肠杆菌 O78也可以使用任何一株当前中国国内公开的大肠杆菌菌株， 不影响本发明的实施。 0024 本发明首次利用杂交瘤技术制备出特异性高、 敏感度强的新型抗大肠杆菌外膜蛋 白。

16、 OMPA 单克隆抗体， 具有广泛的研究和商业使用价值， 可以直接鉴定大肠杆菌的血清型， 筛选大肠杆菌制苗菌株， 用于禽大肠杆菌致病机理的研究， 本发明的抗体同时具有良好的 中和活性和保护效率， 可用于大肠杆菌病的治疗， 而且单抗可以用体内或体外方法无限量 生产， 易于纯化和标准化。 附图说明 0025 图 1 扩增的禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白 OMPA 片段电泳图 0026 图 2 原核表达质粒 pET-28a(+)-OMPA 具体实施方式 0027 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0028 实施例 1 禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白免疫性抗原的制备 0029。

17、 (1) 外膜蛋白的克隆 说 明 书 CN 102584992 A 4 3/4 页 5 0030 根据 Genebank 中大肠杆菌 K12W3110 株 ( 登录号 AP009048) 的 OMPA 基因序列设 计特异性引物， 上游引物引入 BamH I 酶切位点， 下游引物引入 XholI 酶切位点。上游引物 为 ： ATTGGATCCGCTCCGAAAGATAACA， 下游引物 ： TTCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTA。以禽致病 性大肠杆菌 O78的基因组为模板 PCR 扩增外膜蛋白 OMPA。将 OMPA 先连接到 pMD18T 上测 序， 测序鉴定正确的 OMPA。

18、 分别以 BamH I、 Xhol 进行双酶切后克隆到 pET-28a(+) 上， 转化 DH5 感受态细胞， 通过卡那霉素抗性筛选得到的阳性质粒 pET-28a(+)-OMPA 再转化大肠 杆菌 BL21(DE3)， 通过抗性筛选阳性表达菌株。 0031 (2) 禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白原核表达菌株的诱导表达及纯化 0032 将筛选出的禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白原核表达阳性菌液按 1 1000 的比 例接种加有Kan抗性的LB培养基中， 每个菌接种两管， 一管用于诱导， 另一管用于非诱导对 照， 同时要接种一管空质粒菌作为对照。37过夜培养至 OD600nm值约为 0.4 0.。

19、5 时， 诱导 管和空质粒对照管加入 IPTG 至终浓度为 1mmol/L， 非诱导对照不加， 最终挑选表达能力高 的两个菌， 用于大量的蛋白的表达。并按照常规的 SDS-Page 方法对表达产物进行鉴定。然 后以 Ni-NTAHis.Bind Resin 纯化柱纯化蛋白， 经测定纯化后的蛋白浓度为 396mg/L。 0033 (3) 免疫性抗原的乳化 0034 将外膜蛋白稀释至 50g/mL， 分别加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂 混合， 震荡乳化半小时， 分别制成弗氏完全佐剂免疫原和弗氏不完全佐剂免疫原， 4保存 备用。 0035 实施例 2 禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白单克隆。

20、抗体的制备 0036 (1)BALB/c 小鼠免疫 0037 8 周龄 BALB/c 小鼠腹腔注射制备的禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白弗氏完全佐剂 免疫原 0.5mL/ 只 ； 免疫后 7d 和 14d 后分别以弗氏不完全佐剂免疫原同法同剂量进行加强 免疫。 0038 (2) 杂交瘤细胞融合 0039 最后一次加强免疫后的第三天取免疫小鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 按 细胞数量 4 1 混合， 利用经典的 PEG 法， 进行细胞融合。 0040 (3) 杂交瘤细胞的筛选 0041 融合后用HAT作为选择性培养基， 同时加入饲养细胞， 分装在96孔细胞培养板， 置 于 37， 5 C。

21、O2培养箱内培养， 7 10 天进行观察， 对有生长的杂交瘤细胞进行阳性筛选， 以全菌包被， 应用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞， 同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对 照。对于初步筛选的阳性菌株采用稀释法进行克隆化和再克隆， 反复筛选最终获得了一株 稳定表达禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白的杂交瘤细胞株 8A4。 0042 (4) 单抗腹水的制备 0043 分别将经降植烷处理的 BALB/c 小鼠， 腹腔内注射鉴定后再克隆的杂交瘤细胞， 注 射量为 5105个细胞， 约经过一周， 待小鼠腹部膨大后抽取腹水， 离心后取上清以亲核层析 法纯化单抗。 0044 (5) 单抗腹水效价的测定 00。

22、45 以禽致病性大肠杆菌 O78全菌包被， 采用间接 ELISA 测定单抗腹水效价为 16000。 0046 (6) 免疫球蛋白亚型鉴定 说 明 书 CN 102584992 A 5 4/4 页 6 0047 采用Southern biotech公司单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定， 最终 确定禽致病性大肠杆菌 O78外膜蛋白特异性单克隆抗体 8A4 免疫球蛋白类型为 IgG2a， 其轻 链均为 链抗体。 0048 (7) 单抗稳定性鉴定 0049 将所制备的单抗菌株8A4连续培养3个月或液氮冻存复苏后， 仍能稳定分泌McAb。 0050 实施例 38A4 株单抗特异性试验 0051 。

23、以禽致病性大肠杆菌 O78、 O1、 O2和沙门氏菌标准毒株分别与筛选到的单克隆抗体 8A4 株做玻板凝集试验， 用接种环沾取少量平板上的选择禽致病性大肠杆菌 O78、 O1、 O2和沙 门氏菌菌落， 于生理盐水中混匀， 然后分别滴加到事先的标记好的洁净载玻片上， 并同时滴 加单克隆抗体 8A4 株， 设置禽致病性大肠杆菌 O78、 O1、 O2和沙门氏菌与生理盐水及单抗与生 理盐的对照组。结果见表 1， 结果表明本单克隆抗体具有良好的特异性， 只与禽致病性大肠 杆菌 O78反应呈阳性， 与禽致病性大肠杆菌 O1、 O2型均呈阴性， 与沙门氏菌也不存在交叉反 应。 0052 表 1 单抗 8A。

24、4 株特异性鉴定 0053 0054 实施例 48A4 株单抗的中和活性试验 0055 特异性单克隆抗体 8A4 株腹水与禽致病性大肠杆菌 O78种毒混合， 颈部皮下注射 5-10 日龄的雏鸡 20 只。另取 20 只雏鸡单独注射禽致病性大肠杆菌 O78种毒， 结果见表 2。 结果表明 ： 单独注射禽致病性大肠杆菌 O78的鸡发病率 100， 而单抗与禽致病性大肠杆菌 O78同时注射组的鸡仅有个别死亡， 对雏鸡的保护率达80。 说明此单抗对于同型大肠杆菌 感染具有良好的中和活性和保护效率。 0056 表 2 单抗 8A4 株特异性鉴定 0057 免疫组 雏鸭数量 发病数 死亡数 保护率 ( ) 8A4+O78 20 4 2 80 O78 20 20 20 0 说 明 书 CN 102584992 A 6 1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 102584992 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102584992 A 8 。