技术领域
本发明涉及药物筛选与评价技术领域，具体涉及一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针及其应用。
背景技术
血管紧张素转化酶(Angiotensin-Converting Enzyme，ACE)是一种锌依赖型的膜结合外肽酶，广泛分布于哺乳动物的组织中。ACE可以通过肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system，KKS)催化血管紧张素I转化为血管紧张素II，并使缓激肽失活，导致血压上升。此外，这两个系统对电解质和体液平衡、心血管系统发育和功能重塑也起着重要的调节作用。因此，ACE已成为治疗高血压、急性心肌梗死和心力衰竭等疾病的重要靶点。
ACE抑制剂，如卡托普利、依那普利、贝拉普利等，已作为治疗高血压和心力衰竭的一线药物应用于临床。然而长期使用这些药物容易导致咳嗽、蛋白尿、肾功能衰退等副作用。近年来，从天然产物和传统中药中发现具有ACE抑制活性的新化合物已成为药物筛选领域的一个研究热点。
ACE抑制剂的筛选依赖于相应的酶活性检测方法。目前，ACE活性的检测方法主要包括荧光光度法、分光光度法、高效液相色谱法、酶偶联法等。这些方法大都需要通过多个步骤进行样本处理、操作繁琐且存在灵敏度较低的问题。此外，这些方法的检测原理基本都是光学检测，容易受到本底的干扰。天然产物成分复杂，在底物的检测波段可能存在较强的吸收，因此这些方法较难直接应用于天然产物的筛选。
公开号为CN1831529A的专利文献公开了一种用高效液相色谱和质谱联用快速筛选血管紧张素转化酶抑制剂的方法，以马尿酸双甘肽或马尿酸组氨酸亮氨酸为底物，纯化的兔肺血管紧张素转化酶或人空白血浆为血管紧张素转化酶的来源，在水浴中加热反应，过滤膜或离心之后，用高效液相色谱对血管紧张素转化酶反应混合溶液中底物、产物以及所加内标进行分离后，在电喷雾质谱的负离子模式下检测血管紧张素转化酶催化底物水解所生成的马尿酸。
肽段化学衍生是蛋白质谱分析中常用一种样品预处理技术，通过在肽段的氨基、羧基或巯基上引入易电离的小分子标签，提高肽段的灵敏度和专属性并拓展质谱的检测范围。该技术为设计高质谱灵敏度的酶底物提供了一种新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种的高质谱响应的质谱探针，作为酶底物，被血管紧张素转化酶特异性识别，通过质谱测定酶切反应前后的探针或酶切产物的量来检测血管紧张素转化酶的活性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针，包括氨基酸序列为Asp-Ser-Asp-Lys-Pro的多肽及修饰在所述多肽N端的天冬氨酸上的哌嗪类化合物。
本发明的质谱探针由可被血管紧张素转化酶特异性识别的多肽与高质谱响应的小分子连接而成。所述多肽的氨基酸序列为：天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(SEQ ID NO.1)，所述的高质谱响应的小分子为哌嗪类化合物，哌嗪类化合物的-NH与多肽链N端的天冬氨酸的羧基缩合。
血管紧张素转化酶酶切位点为天冬氨酸-赖氨酸之间的酰胺键。因此，本发明质谱探针的酶切产物为哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸和赖氨酸-脯氨酸。由于哌嗪类化合物具有很强的质谱响应，因此通过测定反应前后该探针或酶切产物哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸的量，即可检测血管紧张素转化酶的活性。
作为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪、1-(4-吡啶基)哌嗪或1-(1-甲基-4-吡啶基)哌嗪。
更为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪。
所述质谱探针的分子结构式如式(Ⅰ)所示，
本发明还提供了一种合成所述的质谱探针的制备方法，包括：
(1)以2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂为载体，Fmoc保护的氨基酸为原料，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐为缩合剂，合成氨基酸序列为Asp-Ser-Asp-Lys-Pro的多肽；
(2)按照步骤(1)的方法，在所述多肽N端的天冬氨酸上连接哌嗪类化合物，制得质谱探针粗品，经纯化制得所述的质谱探针。
本发明采用固相合成法在多肽链N端的天冬氨酸上修饰哌嗪类化合物。N端的天冬氨酸离识别位点较远，在该位点上修饰哌嗪类化合物不会影响ACE识别。此外，用固相合成法容易对天冬氨酸侧链上的羧基进行修饰，探针的得率较高。
具体地，所述制备方法，包括：
一.树脂溶胀
称取取代度为0.4mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)，振荡30min；
二.接第一个氨基酸
抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Pro-OH，再加入5倍摩尔量的二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1h，用DMF和DCM交替清洗6遍；
三.脱保护
加入20％哌啶DMF溶液，反应5min，去掉溶剂，再次加入20％哌啶DMF溶液，反应15min，反应后用DMF、甲醇和DMF清洗两次；
四.缩合
3倍摩尔量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和3倍摩尔量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，用DMF溶解，加入反应管，立即加入5倍摩尔量DIEA，反应60min；反应后用DMF、甲醇和DMF清洗两次；重复以上步骤，从右到左依次连接上Asp、Ser、Asp和哌嗪类化合物，连接完成后用甲醇洗4次，抽干10min；
五.切割
配制切割液(TFA：水：EDT：TIS＝95：2.5：2：0.5)，从树脂上切割多肽，得到粗品探针。
六.HPLC纯化多肽
用HPLC纯化粗品探针，将纯化后的溶液冻干，-20℃保存待用。
本发明的另一个目的是提供所述质谱探针的应用。所述质谱探针作为酶底物，可被血管紧张素转化酶特异性识别，酶切成哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸和赖氨酸-脯氨酸。通过质谱仪或液质联用仪测定酶切反应前后质谱探针或酶切产物哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸的量，利用差值表征血管紧张素转化酶的活性。
因此，本发明提供了所述的质谱探针在制备检测血管紧张素转化酶活性的试剂盒中的应用。
本发明还提供了所述的质谱探针在制备筛选血管紧张素转化酶抑制剂的试剂盒中的应用。
本发明提供的质谱探针具有极高的质谱响应，极大提高了检测的灵敏度，另外，由于质谱探针和哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸的分子量是确定的，该检测方法的选择性和专属性很高，非常适用于从中药等复杂体系中筛选具有血管紧张素转化酶抑制活性的化合物。
本发明还提供了所述的质谱探针在评价药物的血管紧张素转化酶抑制活性中的应用。利用本发明的质谱探针检测不同批次同种药物的血管紧张素转化酶抑制活性，进而评价不同批次药物的质量。
本发明具备的有益效果：
本发明提供的质谱探针由可被血管紧张素转化酶特异性识别的多肽Asp-Ser-Asp-Lys-Pro与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被血管紧张素转化酶特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应血管紧张素转化酶的活性或血管紧张素转化酶抑制剂的抑制活性，也非常适用于从中药等复杂体系中筛选具有血管紧张素转化酶抑制活性的化合物。
附图说明
图1为ACE质谱探针纯度分析的HPLC色谱图。
图2为ACE质谱探针结构确证的HPLC-IT-MS基峰离子流图，其中右上角附图为质谱结果图。
图3为ACE质谱探针测定不同浓度ACE的活性。
图4为用ACE质谱探针测定卡托普利的抑制率。
具体实施方式
下面通过具体实施案例对本发明做进一步描述。
实施例1
ACE质谱探针的合成
ACE探针的结构为1-(2-嘧啶基)哌嗪—天冬氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—赖氨酸—脯氨酸(PP-Asp-Ser-Asp-Lys-Pro)，通过固相合成法合成，主要包括以下步骤：
一.树脂溶胀
称取取代度为0.4mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)，振荡30min。
二.接第一个氨基酸
抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Pro-OH，再加入5倍摩尔过量的二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。
三.脱保护
加入20％哌啶DMF溶液，反应5min，去掉溶剂，再次加入20％哌啶DMF溶液，反应15min。反应后用DMF、甲醇和DMF清洗两次。
四.缩合
3倍摩尔过量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和3倍摩尔过量的HBTU，用少量DMF溶解，加入反应管，立即加入5倍摩尔过量DIEA，反应60min。反应后用DMF、甲醇和DMF清洗两次。重复以上步骤，从右到左依次连接上Asp、Ser、Asp和1-(2-嘧啶基)哌嗪，连接完成后用甲醇洗4次，抽干10min。
五.切割
配制切割液(TFA：水：EDT：TIS＝95：2.5：2：0.5)，从树脂上切割多肽，得到粗品探针。
六.HPLC纯化多肽
用HPLC纯化粗品探针，将纯化后的溶液冻干，-20℃保存待用。
实施例2
ACE质谱探针的化学表征
采用实施例1所述的方法合成ACE质谱探针，用HPLC对探针的纯度进行分析。分析条件为：捷伦1200HPLC色谱系统，配备可变波长检测器(VWD)，检测波长214nm；色谱柱，Kromasil C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为0.1％三氟乙酸-水(A)和0.1％三氟乙酸-乙腈(B)；流速1.0mL/min；等度洗脱，0-25min，5-70％B；进样量，10μL。
将ACE质谱探针用纯水溶解后，10000rpm离心5分钟，进样。HPLC色谱图如图1所示。
从图上可以看出，合成的ACE质谱探针纯度很高，相对峰面积占比>95％，可以用于后续的实验和研究。
此外，我们进一步用HPLC-MS对探针的结构进行了确证。分析条件为：安捷伦1100HPLC色谱系统，串联LCQ Deca XPplus离子阱质谱(HPLC-IT/MS)；ESI离子源；正离子模式；质荷比(m/z)，100-1000；毛细管电压，15V；源电压，3kV；毛细管温度350℃；鞘气(N2)60arb；辅助气(N2)20arb；色谱柱，Zorbax SB C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相为0.05％甲酸-水(A)和0.05％甲酸-乙腈(B)；流速0.4mL/min；洗脱梯度为0-5min，1％B；5-40min，1-30％B；40-45min，30-100％B；45-50min，100％B；进样量，5μL。
ACE质谱探针的HPLC-IT/MS色谱图如图2所示。从质谱图上可以看到准分子离子峰[M+H]+(m/z 707.4)以及双电荷离子[M+2H]2+(m/z354.6)。这些离子与探针的结构相吻合，也进一步确证了探针的结构。
实施例3
ACE质谱探针在ACE活性检测中的应用
采用pH＝8.3，10mM的Tris-HCl作为缓冲液。取ACE质谱探针和不同浓度的ACE溶液各20μL，缓冲液160μL，置于1.5mL的离心管中，使ACE质谱探针的终浓度为0.13mM，ACE的终浓度为0.005—0.06U/mL，在37℃孵育2h。反应结束后加入400μL甲醇终止反应。溶液涡旋、离心，用实施例2所述HPLC-IT/MS方法分析，以反应后生成的ACE质谱探针酶解产物1-(2-嘧啶基)哌嗪—天冬氨酸—丝氨酸—天冬氨酸的量反映ACE活性，结果如图3所示。
从图上可以看出，在该浓度范围内，ACE的浓度(活性)和反应后生成的ACE质谱探针酶解产物的峰面积有良好的线性关系，即ACE浓度越高，被酶切的探针越多，酶切产物的峰面积也越高。因此，该探针可以用于ACE的活性检测。
实施例4
ACE质谱探针在ACE抑制剂筛选中的应用
采用pH＝8.3，10mM的Tris-HCl作为缓冲液。取ACE质谱探针和ACE溶液各20μL，不同浓度的卡托普利(ACE抑制剂)50μL，缓冲液110μL，置于1.5mL的离心管中，使ACE质谱探针的终浓度为0.13mM，ACE的终浓度为0.06U/mL，卡托普利的终浓度为0.08—327nM，在37℃孵育2h。反应结束后加入400μL甲醇终止反应。溶液涡旋、离心，用实施例2所述HPLC-IT/MS方法分析，用以下公式计算酶抑制率：
ACE抑制率(％)＝[1-(Pinhibitor/Pblank)]×100，
其中Pinhibitor和Pblank分别为抑制剂组和对照组(不加抑制剂)反应后ACE质谱探针酶解产物的峰面积。
测试结果如图4所示。从图上可以看出，随着卡托普利浓度上升，它对ACE的抑制率也逐渐增强。这表明ACE探针可以较好地反映抑制剂对ACE的抑制作用，可以用于ACE抑制剂的筛选。
实施例5
ACE质谱探针在具有ACE抑制作用的中药质量评价中的应用
取5个不同批次的丹参药材粉末各0.5g，精密称定，加甲醇-水(体积比为8:2)混合溶液50mL，超声提取30min，用离心浓缩机干燥，获得丹参提取物粉末，实验前用Tris-HCl缓冲液配制成样品溶液。
采用pH＝8.3，10mM的Tris-HCl作为缓冲液。取ACE质谱探针和ACE溶液各20μL，丹参样品溶液50μL，缓冲液110μL，置于1.5mL的离心管中，使ACE质谱探针的终浓度为0.13mM，ACE的终浓度为0.06U/mL，丹参的终浓度为2mg/mL，在37℃孵育2h。反应结束后加入400μL甲醇终止反应。溶液涡旋、离心，用实施例2所述HPLC-IT/MS方法分析，用以下公式计算酶抑制率：
ACE抑制率(％)＝[1-(Pinhibitor/Pblank)]×100，
其中Pinhibitor和Pblank分别为丹参样品组和对照组(不加抑制剂)反应后ACE质谱探针酶解产物的峰面积。
结果表明，5个批次丹参ACE的抑制率分别为23％、29％、19％、25％、24％。这表明丹参对ACE有一定的抑制作用，而ACE也与丹参活血的功效相匹配。因此，采用该方法可以较好地反映丹参的生物活性，也可用于丹参的质量评价。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ser Asp Lys Pro
1 5