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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810497873.6 (22)申请日 2018.05.23 (71)申请人 西北工业大学 地址 710072 陕西省西安市友谊西路127号 (72)发明人 张辰艳刘文婧尹大川韩冲 胡明亮叶仙育刘毅蒋函君 王前进杨长青 (74)专利代理机构 西北工业大学专利中心 61204 代理人 王鲜凯 (51)Int.Cl. C07K 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质 结晶成功率的方法 (57)摘要 本发明涉及一种在结晶板表面接枝电荷来。
2、 提高蛋白质结晶成功率的方法， 通过对结晶板表 面进行官能团接枝， 使其表面带有不同电性的电 荷， 将结晶试剂与蛋白溶液混合后滴加在步骤1 处理后的带有电荷的结晶板中， 建立蛋白质结晶 体系； 将蛋白质结晶体系在060环境下静置1 720h结晶。 本发明的方法， 可以根据蛋白质所 带电性来选择带正电或带负电的结晶板从而达 到提到蛋白质结晶成功率的目的。 在本发明中， 只需要简单步骤即可对大批结晶板进行处理， 易 于操作且可重复利用， 简单可行。 通过本发明， 结 晶成功率的提高最大可达到现有技术的2倍以 上。 权利要求书1页 说明书4页 CN 108659096 A 2018.10.16 CN。
3、 108659096 A 1.一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 其特征在于步骤如 下： 步骤1、 表面带有电荷的结晶板的制备： a： 在结晶板表面接枝磺酸基团得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯乙烯结晶板； b： 在结晶板表面接枝羧基基团得到表面带有负电性的羧基基团的聚苯乙烯结晶板； c： 结晶板表面接枝季氨基团得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板； 步骤2： 将结晶试剂与蛋白溶液按照体积比为(0.0150) 1混合后滴加在步骤1处理后 的带有电荷的结晶板中， 建立蛋白质结晶体系用于结晶； 所述结晶试剂为： 所有用于蛋白质结晶的试剂； 所述蛋白溶液： 将蛋白溶于溶解蛋白质的缓。
4、冲液中， 使溶液的pH值在310， 浓度范围 为0.0011M， 溶解蛋白质后得到终浓度为1100mg/ml蛋白溶液； 步骤3： 将蛋白质结晶体系在060环境下静置1720h结晶。 2.根据权利要求1所述在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 其特 征在于： 在反应中晃动结晶板使液体分布均匀。 3.根据权利要求1所述在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 其特 征在于： 所述步骤1的a： 在结晶板表面接枝磺酸基团得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯 乙烯结晶板的过程为： 在结晶板表面接枝磺酸基团： 在聚苯乙烯结晶板的小孔中加入98 硫酸， 在20200下处理120h， 倒出。
5、并使用去离子水冲洗， 再用115的氢氧化钠溶 液中和， 得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯乙烯结晶板。 4.根据权利要求1所述在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 其特 征在于： 所述步骤1的b： 在结晶板表面接枝羧基基团得到表面带有负电性的羧基基团的聚 苯乙烯结晶板的过程为： 1、 在结晶板表面接枝羧基基团： 将处理后的聚苯乙烯结晶板在20 200条件下， 浸入浓硫酸和浓硝酸的处理液中浸泡120h， 再用去离子水冲洗干净； 2、 称取氯化锡固体溶解于浓盐酸， 使其终浓度为0.21g/ml， 滴加到结晶板孔中， 于0100 反应1100h， 倒出反应液， 再使用120的氢氧化钠溶液。
6、洗涤， 然后用去离子水冲 洗； 3、 在结晶板孔中加入浓度为120马来酸酐的乙醇溶液， 10100保温124h， 倒 出该溶液， 用无水乙醇、 120的氢氧化钠的去离子水溶液依次冲洗， 得到表面带有负 电性的羧基基团的聚苯乙烯结晶板。 5.根据权利要求1所述在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 其特 征在于： 所述步骤1的c： 结晶板表面接枝季氨基团得到表面带有正电性的季氨基团的结晶 板的过程为： 1、 将处理后的聚苯乙烯结晶板在20200条件下， 浸入浓硫酸和浓硝酸的处 理液中浸泡120h， 再用去离子水冲洗干净； 2、 称取氯化锡固体溶解于浓盐酸， 使其终浓度 为0.21g/。
7、ml， 滴加到结晶板孔中， 于0100下反应1100h， 倒出反应液； 再使用1 20的氢氧化钠溶液洗涤， 然后用去离子水冲洗； 3、 在结晶板孔中加入浓度为120 的2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵的乙醇溶液， 10100保温124h， 用无水乙醇和去离子水 依次冲洗干净， 得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板。 6.根据权利要求3或4或5所述在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方 法， 其特征在于： 所述浓硫酸和浓硝酸处理液的体积比为1:110:1， 在025下配制。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108659096 A 2 一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法 。
8、技术领域 0001 本发明涉及一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 并用于 蛋白质结晶的方法。 背景技术 0002 随着人类基因组计划的完成， 生命科学的核心从测序转向功能基因组研究。 蛋白 质是生命活动的主要参与者， 其三维结构是功能研究的前提和基础。 目前， 蛋白质结构测定 的方法包括X射线衍射技术、 核磁共振技术和冷冻电镜技术等。 X射线衍射技术是目前最成 熟且精度最高的技术， 超过89蛋白质结构都是由X射线衍射技术测定的。 获得蛋白质晶体 是X射线衍射技术的前提和基础， 然而结晶成功率低严重阻碍了蛋白质结构的解析， 是亟待 解决的问题。 0003 蛋白质结晶包括形核和。
9、晶体生长， 其中形核是蛋白质结晶的第一步， 也是最关键 的一步。 通常， 只有蛋白质溶液浓度达到过饱和才能逾越形核势垒， 发生形核， 继而晶体才 能生长。 对于一些比较珍贵的蛋白质样品， 浓度很难达到过饱和， 直接导致了其结晶成功率 低。 添加异相核是提高蛋白质结晶成功率的重要方法之一， 包括直接添加异相形核剂和改 造结晶板界面。 异相核包括凝胶玻璃珠、 交联葡聚糖珠、 碳粉、 马毛、 干枯的海草、 沸石等。 但 是， 这些异相核需要逐一添加到结晶体系中， 不利于自动化结晶的实现。 直接对结晶基底表 面进行修饰是一种提高自动化筛选效率的有效手段， 目前已经广泛应用的结晶基底包括云 母、 矿物、。
10、 磷脂双分子层修饰的玻璃、 多聚赖氨酸修饰的聚合物膜等， 这些方法都被证明显 著提高了蛋白质结晶成功率， 但是由于基底成本高、 处理工艺复杂等问题制约其在蛋白质 结晶中的应用。 0004 蛋白质属于两性分子， 在不同的pH条件下电荷和电性不同， 在外源电场的作用下 蛋白质分子可以定向的泳动， 以此增加了局部区域蛋白质溶液的浓度， 有效的提高了结晶 成功率。 文献 “Taleb M,Didierjean C,Jelsch C,et al.,Crystallization of proteins under an external electric fieldJ.Journal of crysta。
11、l growth,1999,200(3-4): 575-582” 中报道， 将结晶液滴置于外加电场中， 使蛋白质分子在局部区域达到过饱和， 进而 达到促进结晶的目的。 但是， 这种方法需要施加外源的电场， 装置复杂， 很难用目前的商业 结晶板来实现。 通过化学处理使其在表面接枝官能团使其带电， 使蛋白质分子在结晶液滴 内形成定向泳动从而达到促进结晶的目的， 是最简单和有效的方法。 发明内容 0005 要解决的技术问题 0006 为了避免现有技术的不足之处， 本发明提出一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋 白质结晶成功率的方法， 通过对结晶板表面进行官能团接枝， 使其表面带有不同电性的电 荷， 并将。
12、其用于蛋白质的结晶， 能有效提高蛋白质的结晶成功率， 解决现有技术中蛋白质结 晶率低的问题。 说明书 1/4 页 3 CN 108659096 A 3 0007 技术方案 0008 一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 其特征在于步骤如 下： 步骤1、 表面带有电荷的结晶板的制备： 0009 a： 在结晶板表面接枝磺酸基团得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯乙烯结晶板； 0010 b： 在结晶板表面接枝羧基基团得到表面带有负电性的羧基基团的聚苯乙烯结晶 板； 0011 c： 结晶板表面接枝季氨基团得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板； 0012 步骤2： 将结晶试剂与蛋白溶液按照。
13、体积比为(0.0150) 1混合后滴加在步骤1处 理后的带有电荷的结晶板中， 建立蛋白质结晶体系用于结晶； 0013 所述结晶试剂为： 所有用于蛋白质结晶的试剂； 0014 所述蛋白溶液： 将蛋白溶于溶解蛋白质的缓冲液中， 使溶液的pH值在310， 浓度 范围为0.0011M， 溶解蛋白质后得到终浓度为1100mg/ml蛋白溶液； 0015 步骤3： 将蛋白质结晶体系在060环境下静置1720h结晶。 0016 在反应中晃动结晶板使液体分布均匀。 0017 所述步骤1的a： 在结晶板表面接枝磺酸基团得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯 乙烯结晶板的过程为： 在结晶板表面接枝磺酸基团： 在聚苯乙烯结。
14、晶板的小孔中加入98 硫酸， 在20200下处理120h， 倒出并使用去离子水冲洗， 再用115的氢氧化钠溶 液中和， 得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯乙烯结晶板。 0018 所述步骤1的b： 在结晶板表面接枝羧基基团得到表面带有负电性的羧基基团的聚 苯乙烯结晶板的过程为： 1、 在结晶板表面接枝羧基基团： 将处理后的聚苯乙烯结晶板在20 200条件下， 浸入浓硫酸和浓硝酸的处理液中浸泡120h， 再用去离子水冲洗干净； 2、 称取氯化锡固体溶解于浓盐酸， 使其终浓度为0.21g/ml， 滴加到结晶板孔中， 于0100 反应1100h， 倒出反应液， 再使用120的氢氧化钠溶液洗涤， 然后用去。
15、离子水冲 洗； 3、 在结晶板孔中加入浓度为120马来酸酐的乙醇溶液， 10100保温124h， 倒 出该溶液， 用无水乙醇、 120的氢氧化钠的去离子水溶液依次冲洗， 得到表面带有负 电性的羧基基团的聚苯乙烯结晶板。 0019 所述步骤1的c： 结晶板表面接枝季氨基团得到表面带有正电性的季氨基团的结晶 板的过程为： 1、 将处理后的聚苯乙烯结晶板在20200条件下， 浸入浓硫酸和浓硝酸的处 理液中浸泡120h， 再用去离子水冲洗干净； 2、 称取氯化锡固体溶解于浓盐酸， 使其终浓度 为0.21g/ml， 滴加到结晶板孔中， 于0100下反应1100h， 倒出反应液； 再使用1 20的氢氧化钠。
16、溶液洗涤， 然后用去离子水冲洗； 3、 在结晶板孔中加入浓度为120 的2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵的乙醇溶液， 10100保温124h， 用无水乙醇和去离子水 依次冲洗干净， 得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板。 0020 所述浓硫酸和浓硝酸处理液的体积比为1:110:1， 在025下配制。 0021 有益效果 0022 本发明提出的一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法， 可以 根据蛋白质所带电性来选择带正电或带负电的结晶板从而达到提到蛋白质结晶成功率的 目的。 在本发明中， 只需要简单步骤即可对大批结晶板进行处理， 易于操作且可重复利用， 简单可行。 通过本发明， 结晶。
17、成功率的提高最大可达到现有技术的2倍以上。 说明书 2/4 页 4 CN 108659096 A 4 具体实施方式 0023 现结合实施例对本发明作进一步描述： 0024 实施例1： 过氧化氢酶结晶条件的筛选 0025 第一步： 通过表面处理得到表面接枝磺酸基团结晶板。 具体为， 在结晶板的小孔中 加入98硫酸， 20下使用该处理液浸泡PS板10h， 倒出并使用去离子水冲洗， 再用10的 氢氧化钠溶液中和， 得到表面有负电的磺酸基团的PS板； 0026 第二步： 将美国Sigma公司的过氧化氢酶蛋白溶于pH为3， 0.5M的HEPES-Na缓冲液 中， 达到终浓度为20mg/ml， 得到过氧化。
18、氢酶蛋白溶液； 0027 第三步： 用Hampton公司的IndexTM试剂盒的96种结晶试剂筛选过氧化氢酶晶体， 将 结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为1： 10滴加在结晶板坐滴孔中， 得到蛋白质结晶体系； 0028 第四步： 将结晶体系置于8条件下静置结晶72h。 显微镜下观察统计出现过氧化 氢酶晶体的条件个数。 0029 得到： 63种结晶条件中出现了葡萄糖异构酶晶体， 结晶成功率为65.625。 与未处 理结晶板的对照组相比， 成功率提高了2.5倍。 0030 实施例2： 蛋白酶K结晶条件的筛选 0031 第一步： 通过处理得到表面接枝羧基的结晶板。 具体为， 在10条件下， 按照1： 。
19、4的 体积比配制浓硝酸和浓硫酸的混合处理液。 PS板于60条件下， 使用该处理液浸泡15h， 再 用去离子水冲洗干净。 称取5g氯化锡固体溶解于10ml浓盐酸， 滴加到结晶板孔中， 于40反 应20h， 反应每隔1h轻微晃动结晶板以使液体分布均匀。 反应完毕后， 倒出反应液， 使用15 的氢氧化钠溶液洗涤， 然后用去离子水冲洗干净。 在小孔中加入含有5马来酸酐的乙醇溶 液， 50保温10h， 倒出该溶液， 用乙醇、 氢氧化钠的去离子水溶液依次冲洗干净， 得到表面 带有负电性的羧基基团的PS板。 ； 0032 第二步： 将美国Sigma公司的蛋白酶K蛋白溶于pH为3， 0.5M的HEPES-Na。
20、缓冲液中， 达到终浓度为60mg/ml， 得到蛋白质溶液； 0033 第三步： 将60mg/ml氯化钠溶液与蛋白质溶液按照体积比30： 1滴加在结晶板坐滴 孔中， 得到蛋白质结晶体系； 0034 第四步： 将结晶体系置于4条件下静置结晶24h。 显微镜下观察统计出现蛋白酶K 晶体的条件个数。 0035 经过统计得到以下结果： 69种结晶条件下出现了溶菌酶晶体， 结晶成功率为 71.88。 与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比， 成功率提高了2.4倍。 0036 实施例3： 刀豆球蛋白结晶条件的筛选 0037 第一步： 通过处理得到表面接枝季氨基团的结晶板。 具体为， 在10条件下， 按照。
21、 1： 1体积比配制浓硝酸和浓硫酸的混合处理液。 PS板于30条件下， 使用该处理液浸泡12h， 再用去离子水冲洗干净。 称取10g氯化锡固体溶解于10ml浓盐酸， 滴加到结晶板孔中， 于55 反应25h， 反应每隔1h轻微晃动结晶板以使液体分布均匀。 反应完毕后， 倒出反应液， 使用 5的氢氧化钠溶液洗涤， 然后用去离子水冲洗干净。 在结晶板孔中加入含102， 3-环氧丙 基三甲基氯化铵乙醇溶液， 50保温8h， 用乙醇和去离子水依次冲洗干净， 即得到表面带有 正电性的季氨基团的结晶板； 说明书 3/4 页 5 CN 108659096 A 5 0038 第二步： 将美国Sigma公司的刀豆。
22、球蛋白溶于pH为7， 0.01M的HEPES-Na缓冲液中， 达到终浓度为30mg/ml， 得到蛋白质溶液； 0039 第三步： 用Hampton公司的IndexTM试剂盒的96种结晶试剂筛选刀豆球蛋白晶体， 将 结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为1： 1滴加在结晶板坐滴孔中混合， 得到蛋白质结晶体 系； 0040 第四步： 将结晶体系置于20条件下静置结晶168h。 显微镜下观察统计出现刀豆 球蛋白晶体的条件个数。 0041 经过统计得到以下结果： 43种结晶条件下出现了刀豆球蛋白晶体， 结晶成功率为 44.79。 与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比， 成功率提高了2.69倍。 说明书 4/4 页 6 CN 108659096 A 6 。