技术领域
本发明属于医学领域，具体涉及一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗体片段特异性识别程序性死亡分子(programmed cell death 1，PD-1)，能够作为免疫活化物刺激机体的免疫反应，从而产生抗肿瘤等疾病的作用效果。
背景技术
2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首，自此之后，肿瘤免疫疗法研究不断获得突破性进展，其临床应用也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗研究领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。
在20世纪80年代早期，Allison及其他研究者确定了在T细胞表面负责识别抗原的αβ T细胞受体(TCR)的基因结构。80年代后期，Boone、Rosenberg、Old等人研究分别发现，不同肿瘤病人体内均存在一些肿瘤特异性抗原，能够被T细胞所识别并特异性杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤免疫治疗的希望重新燃起，大量研究致力于肿瘤治疗性疫苗的研究和开发。然而，Schwartz等人研究发现，仅有TCR信号并不足以激活抗原特异性T细胞，T细胞的激活还需要其他分子的参与，也就是所谓第二信号“共刺激分子”的协同作用。同时研究发现，只有特定的抗原递呈细胞(APCs)才能够表达共刺激分子，而大多数细胞，包括肿瘤细胞，并不能够提供共刺激分子信号。在20世纪90年代早期，Allison等发现了CD28分子，能够提供T细胞激活所需要的第二信号。之后Linsley等人研究发现表达在APCs细胞表面的B7分子是CD28分子的配体，而Allison等通过小鼠模型研究，经过改造后能够表达B7分子的肿瘤细胞能够被小鼠免疫系统迅速清除。因此，肿瘤细胞B7分子表达的缺失可能是机体不能够有效激发T细胞免疫的重要因素。
在20世纪90年代的研究均表明，细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)在体内发挥着与CD28完全相反的功能，如果把CD28这一类分子比作是一部汽车的“油门”，那么CTLA-4这一类分子发挥的是“刹车”的功能。当机体T细胞活化之后，这类分子会“检查”免疫细胞激活程度，在激活的细胞中表达上调并发挥免疫抑制功能，从而使得机体的T细胞不至于过度增殖和活化而损伤正常细胞，因此这类分子又被称为“免疫检查点”分子。癌细胞利用这类分子的免疫抑制机制，逃避机体的免疫系统杀伤。研究表明，利用CTLA-4特异性单克隆抗体来阻断CTLA-4的信号，能够显著提高T细胞活性，并且在多种肿瘤的小鼠模型研究中发现，单克隆抗体阻断CTLA-4后能够大大提高小鼠对肿瘤的抑制能力。除了CTLA-4之外，免疫检查点分子还包括PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3、TIGIT等B7超家族和CD28超家族分子。通过特异性单克隆抗体阻断这些“抑制”信号，能够重新释放T细胞的活性，从而使得这些T细胞能够发挥抗肿瘤作用。肿瘤免疫检查点疗法对抗肿瘤策略的贡献在于：一方面，免疫检查点疗法并不直接靶向肿瘤细胞，而是作用于病人的免疫系统，通过解除限制T细胞发挥功能的信号从而释放T细胞活性；另一方面，这种对T细胞的激活并不具有抗原特异性，而是对整个免疫系统的重新激活，因此能够适用于多种不同肿瘤的治疗，可以作为肿瘤的通用疗法。不仅如此，CTLA-4抗体阻断疗法的成功，开创了免疫抑制相关分子阻断在肿瘤治疗中的开发和应用，基于PD-1和PD-L1等为代表的免疫抑制分子开发的阻断性抗体同样取得了重大突破，2014年美国FDA批准了两项PD-1阻断性抗体，nivolumab和pembrolizumab，用于黑色素瘤的临床治疗。
目前，仍存在开发出其它的抗PD-1抗体的需求。
发明内容
本发明的一个方面在于提供一种能够与PD-1分子特异结合的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的重链CDRs；以及如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的轻链CDRs。其中所述片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体和包含CDRs的多肽，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段阻断PD-1与选自PD-L1，PD-L2或其组合的物质的结合。
在具体的实施方式中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：9所示的重链序列和SEQ ID NO：10所示的轻链序列，或所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1所示的重链序列和SEQ ID NO：2所示的轻链序列。
在具体的实施方案中，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：11所示的重链可变区和SEQ ID NO：12所示的轻链可变区，或，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：13所示的重链可变区和SEQ ID NO：14所示的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段为鼠源或人源化抗PD-1单克隆抗体，优选所述人源化PD-1单克隆抗体包含人Fc区域，更优选为人IgG4的Fc区。
在具体的实施方案中，本发明涉及多肽，其序列如SEQ ID NO：11所示，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：12所示的多肽。
在具体的实施方案中，本发明涉及多肽，其序列如SEQ ID NO：13所示，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：14所示的多肽。
在具体的实施方案中，本发明涉及多肽，其序列如SEQ ID NO：12所示，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：11所示的多肽。
在具体的实施方案中，本发明涉及多肽，其序列如SEQ ID NO：14所示，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：13所示的多肽。
本发明的第二方面在于提供编码所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO：9所示的重链序列和SEQ ID NO：10所示的轻链序列，或所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1所示的重链序列和SEQ ID NO：2所示的轻链序列。
在具体的实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其编码所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
在具体的实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其编码SEQ ID NO：11所示的多肽，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：12所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示。
在具体的实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其编码SEQ ID NO：12所示的多肽，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：11所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：16所示。
在具体的实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其编码SEQ ID NO：13所示的多肽，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：14所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：17所示。
在具体的实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其编码SEQ ID NO：14所示的多肽，其中所述多肽是特异性结合PD-1分子的抗体的一部分，并且其中所述抗体还包含SEQ ID NO：13所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：18所示。
本发明的第三方面在于提供包含所述多核苷酸的表达载体。
本发明的第四方面在于提供包含上述表达载体的宿主细胞。
本发明的第五方面在于提供制备所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：1)培养所述宿主细胞；2)从所述宿主细胞或培养基中回收所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
本发明的第六方面在于提供一种含有所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物，还含有药用载体。
本发明的第七方面在于提供所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ水平的药物中的用途。
本发明的第八方面在于提供所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备治疗非小细胞肺癌等的抗肿瘤药物中的用途。
本发明提供的抗PD-1抗体或其片段能够特异性结合PD-1分子，结合之后能够阻断PD-1与选自PD-L1，PD-L2或其组合的结合，并能够产生一系列生物学效应。这些生物学效应包括，例如：能够提高肿瘤病例肿瘤特异性T细胞分泌IFN-γ的水平，特别是能够抑制小鼠体内肿瘤生长。
在本发明中，表述“PD-1抗体”或“鼠源PD-1抗体”为针对PD-1的鼠源单克隆抗体，在具体的实施方案中为PD-1.C抗体。表述“人源化PD-1抗体”为在鼠源PD-1抗体基础上人源化而制得，在具体的实施方案中，为PD-1.C抗体进行人源化而制得。
PD-1分子是CD28家族的重要成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS等。PD-1分子表达在活化的B细胞，T细胞及骨髓细胞等，分子量约为55kDa的I型膜蛋白，目前发现PD-1有两个配体，分别是PD-L1和PD-L2，PD-1通过与(PD-L1和/或PD-L2)的相互作用抑制T细胞活性。PD-L1能够在多种肿瘤细胞表面高表达，通过PD-1与PD-L1的相互作用，能够抑制肿瘤浸润淋巴细胞的功能活性，包括TCR介导的T细胞增殖能力以及细胞因子的分泌水平等，因此被多种肿瘤利用而作为肿瘤细胞逃逸免疫系统监视的重要机制。而利用抗体特异性阻断PD-1与(PD-L1和/或PD-L2)的相互作用，能够活化处于抑制状态的T细胞，使得T细胞的功能得到释放，恢复T细胞的功能，从而达到利用机体免疫系统杀伤肿瘤细胞进而进行肿瘤治疗的作用。
本发明是基于上述的原理作出的，本发明中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段通过与PD-1分子特异结合，阻断PD-1与(PD-L1和/或PD-L2)的结合，从而使T细胞活化，提高T细胞分泌IFN-γ的水平。
本申请包括与PD-1特异性结合的抗体或衍生物，也包括与原来的抗体显示实质上相同的抗原特异性的抗体片段。“抗体的片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDRs。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDRs的肽等。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽另外在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有最小限度的来源于非人类免疫球蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白，其中受体抗体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种高变区的残基置换，非人类物种例如有小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如PD-1的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
本发明还提供含有本发明PD-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使抗体或其抗原结合片段与药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的医药组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物结合的抗体。
附图说明
图1是表示三种不同表达系统制备的PD-1蛋白SDS-PAGE鉴定图。
图2是表示PD-1.C抗体能够阻断PD-1与PD-L1的结合的Protein A洗脱及SDS-PAGE鉴定的图。
图3是表示PD-1.C抗体能够阻断PD-1与PD-L1的结合的图。
图4是表示PD-1.C抗体能够活化肿瘤病例中肿瘤抗原特异性T细胞反应的图。
图5是表示SPR检测PD-1.C抗体结合不同表达系统制备的PD-1蛋白的亲和力的图。
图6是表示人源化PD-1.C抗体蛋白的分子筛层析及SDS-PAGE纯度检测结果的图。
图7是表示SPR检测人源化PD-1.C抗体结合PD-1的亲和力的图。
图8是表示人源化PD-1.C抗体NCG小鼠HCC-827肿瘤模型抑制实验结果的图。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例仅仅是为了说明本发明的目的，而非用于限制本发明。
实施例1.PD-1.C抗体的制备
1.PD-1重组表达质粒的构建
以PD-1的cDNA(NM_005018.2)为参考，合成PD-1(氨基酸1-170)的DNA序列，并分别引入酶切位点EcoRI和BglII，C端引入6个His氨基酸的标签，其中EcoRI酶切位点位于序列的5’端，6个His氨基酸的标签和酶切位点BglII依次位于序列的3’端。利用酶切位点EcoRI和BglII将合成的PD-1的DNA序列克隆入表达载体pCAGGS(Addgene公司)，建立PD-1全长蛋白的重组真核表达质粒。
2.PD-1重组蛋白的表达与纯化
1、)转染HEK293T细胞：HEK293T细胞(ATCC)以1∶3传至培养皿中继续培养；取7.5mL DMEM(无血清及抗生素)(GIBCO)至50mL管中，加入300μL聚醚酰亚胺(PEI)1.0混匀；加入75μg PD-1重组质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μL至各培养皿中于37℃5％CO2培养箱中培养。
2)收集上清：转染48小时后，4℃离心，收集上清。
3)镍亲和层析柱纯化：以0.45μM，33mm PVDF膜滤器过滤离心后上清，在4℃条件下与镍亲和层析柱(GE Health)结合4小时以上；之后用含有10mM，20mM，50mM，100mM，200mM，300mM，500mM等不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，之后换液至20mM Tirs-HCl，150mM NaCl缓冲液备用，SDS-PAGE鉴定纯度(图1的第一泳道)。
3.PD-1-mFc蛋白的表达与纯化
以PD-1的cDNA(NM_005018.2)为参考，合成PD-1(氨基酸1-170)的DNA序列，并分别引入酶切位点EcoRI和BglII，C端引入鼠Fc氨基酸的标签，其中EcoRI酶切位点位于序列的5’端，Fc标签和酶切位点BglII依次位于序列的3’端。利用酶切位点EcoRI和BglII将合成的PD-1的DNA序列克隆入表达载体pCAGGS(Addgene公司)，建立PD-1-mFc蛋白的重组真核表达质粒。
PD-1-mFc蛋白表达：
1)转染HEK293T细胞：HEK293T细胞(ATCC)以1∶3传至培养皿中继续培养；取7.5mL DMEM(无血清及抗生素)至50mL管中，加入300μL聚醚酰亚胺(PEI)1.0混匀；加入75μg PD-1-mFc重组质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μL至各培养皿中于37℃5％CO2培养箱中培养。
2)收集上清：转染48小时后，4℃离心，收集上清。
3)Protein A亲和层析柱纯化：以0.45μM，33mm PVDF膜滤器过滤离心后上清，经过离心去沉淀后向其中加入等体积的20mM Na3PO4(pH 7.0)混合均匀，再用0.22μm的滤膜过滤在4℃条件下与Protein A亲和层析柱(GE Health)结合4小时以上；之后用0.1M Gly pH3.0洗脱挂在柱子上的PD-1-mFc蛋白，加入1M的Tris pH9.0约0.8mL(收集体积为3.2mL)，之后换液至20mM Tirs-HCl，150mM NaCl缓冲液备用。
4.PD-1鼠源单克隆抗体的制备与筛选
根据弗氏完全佐剂腹腔注射免疫方法，用重组产生的纯化的全长PD-1重组蛋白(以下简称为PD-1抗原)用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：
1)动物免疫：经过纯化的PD-1抗原以完全弗氏佐剂(Sigma)乳化，采用腹腔注射方法免疫6-8周龄B6/C57小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
2)细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1∶5-1∶10混合，滴加37℃的50％PEG(pH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
3)筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的PD-1重组蛋白进行ELISA测试杂交瘤细胞上清与PD-1蛋白的结合能力。将PD-1重组蛋白按照300ng/孔，包被到ELISA板，4℃过夜孵育，之后用PBS缓冲液清洗3次，加入5％脱脂奶粉(伊利)的封闭液，室温25℃孵育2小时；之后用PBS缓冲液清洗3次，加入细胞克隆的培养上清液，室温25℃孵育1小时；之后用PBS缓冲液清洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(三箭)，室温25℃孵育1小时；之后用PBS缓冲液清洗3次，加入TMB显色液，15min后加入终止液，并适用分光光度计检测OD450的吸收值。筛选OD450＞0.5的细胞克隆进行后续筛选。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测OD450阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为PD-1.C。
4)细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株PD-1.C用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×107个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×106个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体压型选择相应柱料，单克隆抗体PD-1.C亚型为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100uL/管，浓度为1mg/ml)、保存在4-8℃。
5.鼠源PD-1.C抗体的表达纯化
将2×106的细胞株PD-1.C细胞通过腹腔注射6-8周龄的BALB/C小鼠(购自维通利华公司)，2-3周后收取小鼠腹水，将获得的腹水先经过离心去沉淀后向其中加入等体积的20mM Na3PO4(pH 7.0)混合均匀，再用0.22μm的滤膜过滤腹水，主要是防止腹水中的其它杂质对柱子造成损伤；过滤完成后准备上样纯化。
将Protein G(5mL)HP亲和柱(GE公司)连接于AKTAPurifier/Explorer/FPLC/START(GE公司)上，在机器上操作下面的过程：先用水将柱中的20％乙醇冲出，再用20mM Na3PO4，pH 7.0的缓冲液平衡柱子，待仪器上显示电导为4.5％后将上述腹水通过5mL loop环上样的方式注入与Protein G结合，流速1mL/min；待UV平稳后，在随后的收集管中加入1M的Tris pH 9.0约0.8mL(收集体积为3.2mL)，然后在程序上改成100％的0.1M Gly pH 3.0洗脱挂在柱子上的抗体，收集洗脱的样品，制样，凝胶电泳鉴定，判断胶图条带大小正确，SDS-PAGE鉴定其纯度(图2)；若上述鉴定无误，采用浓缩换液的方法，用PBS不断的稀释浓缩的抗体，反复浓缩稀释100倍以上后将样品分装，直接使用或保存于-80℃冰箱。
实施例2.PD-1阻断抗体筛选及亲和力分析
通过293T细胞体外表达的PD-1蛋白进行小鼠免疫，获得的单克隆抗体进行PD-1与PD-L1的阻断实验筛选能够特异性阻断PD-1与PD-L1相互作用的抗体。
1.PD-L1全长表达293T细胞制备
在本实施例中，通过将含PD-L1全长(pEGFP-N1载体-GFP标签质粒)的PD-L1-GFP-p质粒(Clontech公司)转染293T细胞(ATCC)，获得表达PD-L1全长的293T细胞。转染前1天按照0.5～2×105细胞每孔接种于24孔培养板，并加入500μL不含抗生素的DMEM完全培养基(GIBCO公司)，以保证转染时细胞汇合达70～80％。1μg PD-L1-GFP-p质粒稀释于50μL不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。将2μl PEI(Sigma)(4mg/mL)稀释于50μL不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。5分钟后，将50μLPEI稀释液滴加到50μL PD-L1-GFP-p质粒稀释液中，轻轻混匀，室温孵育20分钟。将100μl PEI/PD-L1-GFP-p质粒复合物滴加到每孔中并轻轻摇动使其与新鲜的培养基均匀混合。将细胞放入培养箱孵育4～6h后，更换含血清培养液去除复合物。将细胞放置在37℃，CO2孵箱继续孵育24小时后，通过流式细胞分析仪(BD ARIA II)检测GFP表达水平，评价PD-L1全长表达293T细胞的表达水平。
2.抗体阻断实验
将实施例1制备的PD-1.C抗体和PD-1-mFc蛋白(实施例1获得)按照摩尔比2∶1的比例混合后置冰上孵育1小时，之后加入到含2×105的PD-L1全长表达293T细胞中，置冰上孵育30分钟。设置Ebola病毒GP蛋白特异性抗体4G7(Mapp Biopharmaceutical)为阴性对照；之后PBS清洗两次，加入APC标记的抗鼠IgG二抗(BD)，孵育30分钟后用PBS缓冲液清洗两次，最终用300mL PBS溶液重悬后进行流式细胞分析。结果如图3所示，结果表明，PD-1-mFc能够显著结合到PD-L1全长表达的293T细胞上，而加入PD-1.C抗体后能够完全抑制PD-1与PD-L1的结合，从而使得PD-1-mFc不能结合到293T细胞表面的PD-L1蛋白上(图3)。因此，PD-1.C抗体能够在细胞水平显著抑制PD-1和PD-L1的结合。
实施例3.PD-1阻断抗体对非小细胞肺癌病例肿瘤特异性T细胞的体外活化能力
PD-1阻断抗体的重要应用之一是其抗肿瘤作用，本实施例采集了15例非小细胞肺癌病例外周血，利用肿瘤特异性多肽进行体外培养，之后评价PD-1.C抗体对肿瘤多肽库特异性T细胞的活化能力进行检测，评价本发明筛选的PD-1阻断抗体体外细胞水平的抗肿瘤潜能。
1.病例入组筛选
本实施例中纳入的病例为穿刺活检肿瘤细胞阳性的非小细胞肺癌病例。
2.PBMCs分选
本发明所用的淋巴细胞来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经临床医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液的数量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医务人员对志愿者进行采血。采血时使用含有EDTA-K2抗凝的9mL一次性真空采血管(VACUETTE，奥地利格雷纳公司)，每名志愿者采血约20-25mL，采血后立即颠倒防止凝血。
1)先将新鲜采集的外周血用121℃高压灭菌冷却后的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)稀释一倍，将稀释的血样小心加入到事先准备好的15mL淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物技术有限公司)中，加入时十分小心，缓慢加入，避免界面混乱；
2)25℃条件下用水平离心机(SORVALL Stratos，美国Thermo公司)700g离心20分钟，停止时降速调至最慢；
离心后的样品分四层，将最上层血浆用巴斯德移液管吸出，之后小心吸出第二层淋巴细胞层至新的无菌离心管中，即为粗纯PBMCs细胞；
3)用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)等体积稀释粗纯PBMCs细胞，之后在25℃条件下以800g的离心力离心10分钟；
弃掉上清，用7mL无血清RPMI1640(美国GE公司Hyclone品牌)重悬，在25℃下500g离心5分钟；
弃掉上清，重悬，加7mL含10％胎牛血清(FBS，美国Thermo Fisher公司品牌澳洲来源)的RPMI-1640培养基清洗，在25℃下500g离心5分钟；
4)弃掉上清后用3mL含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，取适量重悬液于血球计数板上进行细胞计数，并用含10％血清的RPMI-1640培养基最终调整至2.5×106细胞/mL密度，获得PBMCs细胞备用；
5)将细胞悬液中加入每条肽终浓度5μg/mL的肿瘤抗原多肽库(所述肿瘤抗原多肽库见表1)进行刺激，于培养后第三天加入终浓度为20U/mL的rIL-2(双鹭制药)继续培养，培养过程中第三天和第七天根据培养基状态半量换液，并补充20U/mL rIL-2(双鹭药业)，第十天收获细胞，进行相关检测。
6)ELISPOT检测抗体的T细胞活化水平
a.ELISPOT检测细胞刺激培养
ELISPOT板(默克密理博公司)提前12小时以上用磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释的抗人γ干扰素单抗(BD)包被，4℃水平放置。在加入刺激抗原和细胞前用含10％血清(HyClone)的RPIM-1640培养基室温条件下封闭1小时。
将肿瘤特异性多肽库(所述肿瘤抗原多肽库见表1)用10％血清(HyClone)的RPMI-1640培养基稀释至每条多肽5μg/ml，向ELISPOT板孔内每孔加入100μL，每个肽库设两个重复孔，另设无多肽刺激空白对照孔和植物凝集素(PHA)(Sigma)刺激阳性对照孔。本实验设置的对照包括：
无多肽刺激，无抗体，为阴性对照；
无多肽刺激，加抗体；
多肽刺激，无抗体；
多肽刺激，加抗体；
其中加入的抗体包括：PD-1.C抗体及无关抗体(EBOLA病毒GP蛋白抗体4G7(Mapp Biopharmaceutical))。抗体按照10μg/mL终浓度加入96孔中进行刺激培养。
将稀释后的PBMCs细胞每孔加入100μl，加完后将含有100μL多肽稀释液和100μL PBMCs稀释液的ELISPOT板置37℃、5％CO2(二氧化碳)条件下孵育18小时。
b.ELISPOT洗板及结果获取
a)孵育结束后，弃掉孔内细胞液，迅速在每孔加入200μL常温的去离子水清洗2次，之后含5‰Tween-20的PBS(PBST)清洗3次。
b)去除洗液，在吸水纸上用力扣干，每孔加入100μL稀释的检测抗体(BD)，室温孵育2h。
c)去除检测抗体溶液，PBST清洗3次，之后每孔加入稀释好的链霉亲和素-HRP结合物(BD)100μL，室温孵育1h。
d)显色：去除链霉亲和素-HRP结合物溶液，PBST清洗3次，之后PBS清洗2次。在吸水纸上用力扣干，之后每孔加入100μL AEC底物(BD)溶液，室温孵育15～30分钟后，当看到清晰的斑点时，用蒸馏水冲洗以中止反应。
e)37℃或室温下晾干，之后将ELISPOT板用自动读板仪(C.T.L)对ELISPOT孔内反应的斑点进行计数，之后调整参数并进行质量控制，给出最终反应结果。
3.结果分析
通过计数105细胞中经刺激后产生的特异性斑点数目并进行分析，评价PD-1阻断抗体对T细胞活化的影响。
在15例非小细胞肺癌病例中，有4例经过肿瘤多肽体外培养扩增出肿瘤特异性T细胞，通过对这4例肿瘤病例PBMCs对PD-1抗体的反应情况，评价肿瘤特异性T细胞对PD-1抗体的反应效果。结果显示(图4)，在无多肽刺激条件下，加入PD-1.C抗体的刺激孔相对于阴性对照孔能够产生较强的T细胞免疫反应，同时能够产生相当水平的T细胞免疫反应，而4G7阴性对照抗体则较阴性对照孔无显著差异。经过对肿瘤多肽刺激条件下加入各抗体后T细胞活化水平的比较，发现加入PD-1.C抗体的刺激孔相对于阴性对照孔能够产生较强的T细胞免疫反应，而4G7阴性对照抗体则较阴性对照孔无显著差异。
因此，PD-1.C抗体能够在体外培养条件下有效活化肿瘤病例体内的T细胞，尤其是肿瘤特异性T细胞的活性，促进其产生IFN-γ，从而增强其T细胞免疫功能。
表1：肿瘤抗原多肽库(中科亚光公司合成)
实施例4.PD-1.C抗体与不同表达系统生产的PD-1蛋白的亲和力验证
本实施例中，通过表面等离子共振技术(SPR)对PD-1.C抗体进行亲和力鉴定。
1.昆虫细胞表达系统PD-1蛋白制备
以PD-1的cDNA(NM_005018.2)为参考，合成PD-1(氨基酸1-170)的DNA序列，并分别引入酶切位点EcoR I和Xho I，C端引入6个His标签，其中EcoRI酶切位点位于序列的5’端，6个His氨基酸的标签和酶切位点Xho I依次位于序列的3’端。利用酶切位点EcoRI和Xho I将合成的PD-1的DNA序列克隆入表达载体pFastBac(Invitrogen公司)，建立PD-1-His蛋白的昆虫细胞重组表达质粒。
具体操作过程为：将表达质粒转入DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得重组Bacmid，将Bacmid转染昆虫细胞SF-9细胞(Invitrogen)，获得携带目的基因的重组杆状病毒，并进行2-3轮扩增，将扩增的P3毒按照一定的比例(视P3代毒的毒力而定)加入细胞密度为2×106个/mL SF-9细胞中扩增P4代毒；3天后按照约1∶4的比例向细胞密度为2×106个/mL的细胞悬液中加入P4毒，27℃、120rpm/min的摇床中培养2天后收取细胞上清，通过Histrap预装柱和分子筛对目的蛋白进行纯化。
将上述抽滤过的上清用蠕动泵控制流速在2.5mL/min以下与已用20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0平衡好的预装柱于4℃冷库结合，结合完毕以后将结合有目的蛋白的镍柱连接到AKTA上，先用Buffer A(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)洗脱20mL以上(此步骤主要用于除去非特异性的结合物)，再用AKATA(GE Health)调节Buffer B(20mM Tris，150mM NaCl，1M咪唑，[pH8.0])，使之形成不同浓度梯度的咪唑洗脱镍柱上的目的蛋白，收集不同浓度咪唑缓冲液洗下的蛋白，将不同咪唑梯度洗脱下的样品进行凝胶电泳，通过胶图判断目的条带(图1的第二泳道)。
2.原核细胞表达系统PD-1蛋白制备
以PD-1的cDNA(NM_005018.2、)为参考，合成PD-1(氨基酸25-170、)的DNA序列，并分别引入酶切位点Nde I和Xho I，其中EcoRI酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Xho I依次位于序列的3’端。利用酶切位点Nde I和Xho I将合成的PD-1的DNA序列克隆入表达载体pET21 a(Invitrogen公司)，建立PD-1蛋白的原核重组表达质粒。
将表达质粒转入E.coli.BL21(DE3)感受态细胞，加入IPTG进行诱导表达，获得包涵体状态的PD-1蛋白。将PD-1的包涵体分别滴在1L配好的复性液(20mM Tris-HCL，400mM L-精氨酸，EDTA 2mM，GSH/GSSG 5mM/1mM)中，分两次滴加，每次滴加3mL，两次滴加之间间隔最少8h，然后用浓缩杯浓缩，PD-1用20mM Tris-HCL，150mM NaCL，PH8.0的buffer换液，然后用Hiload 16/60superdex200pg分子筛柱子纯化，SDS-PAGE检测目的蛋白(图1的第三泳道)。
3.SPR检测不同表达系统生产的PD-1蛋白与PD-1.C抗体亲和力
将分别来自293T哺乳动物细胞，昆虫细胞和原核细胞三种表达系统生产的PD-1蛋白和PD-1.C抗体换液至SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl，150mM Na-Cl，0.005％Tween-20，pH 7.4)。将PD-1.C抗体稀释到20μg/ml固定到CM5芯片(GE Health)上，之后将梯度稀释的PD-1蛋白分别流过CM5芯片各通道，利用BIA evaluation软件分析结合动力学参数，并计算亲和力常数(kD)。
本实施例鉴定了PD-1.C抗体与不同表达系统生产的PD-1蛋白，以评价PD-1.C抗体结合PD-1蛋白的特性(图5)。PD-1蛋白具有四个N-link的糖基化位点，分别为49、58、74和116位的天冬氨酸(Asn，N)，不同表达系统生产的蛋白其糖基化修饰有所差异，而糖基化水平的差异可能会影响抗体与PD-1蛋白的结合。更为重要的是，人体功能性蛋白的糖基化修饰在不同细胞类型、不同组织、不同器官及年龄、疾病等状态下有所差异，因此，检测抗体对不同表达系统生产的PD-1蛋白亲和力对于指导PD-1抗体用药具有一定指导意义。
结果表明，PD-1.C抗体能够与昆虫细胞生产以及大肠杆菌表达后复性获得的PD-1蛋白均能够结合，亲和力分别为5.23×10-10M和3.41×10-10M，与真核293T细胞表达的PD-1亲和力为1.33×10-9M，相互之间无明显差异。本实施例结果表明，PD-1.C抗体与PD-1结合不受表达系统的影响，提示其可能具有更为广泛的人群和疾病状态适用谱(如图5)。
实施例5.鼠源PD-1.C抗体的人源化及人源化抗体与PD-1亲和力检测
根据PD-1.C抗体的序列同源性，本发明在保留抗体轻链和重链的CDR区基础之上，通过替换人源抗体骨架，获得人源化PD-1.C抗体(hu-PD-1.C)。
SEQ ID NO.：1：PD-1.C鼠源PD-1.C抗体重链
SEQ ID NO.：2：PD-1.C鼠源PD-1.C抗体轻链
SEQ ID NO.：3：PD-1.C重链CDR1
SEQ ID NO.：4：PD-1.C重链CDR2
SEQ ID NO.：5：PD-1.C重链CDR3
SEQ ID NO.：6：PD-1.C轻链CDR1
SEQ ID NO.：7：PD-1.C轻链CDR2
SEQ ID NO.：8：PD-1.C轻链CDR3
SEQ ID NO.：9：人源化PD-1.C重链
SEQ ID NO.：10：人源化PD-1.C轻链SEQ ID NO：11：鼠源PD-1.C抗体的重链可变区
SEQ ID NO：12：鼠源PD-1.C抗体的轻链可变区
SEQ ID NO：13：人源化PD-1.C抗体的重链可变区
SEQ ID NO：14：人源化PD-1.C抗体的轻链可变区
SEQ ID NO：15：鼠源PD-1.C抗体的重链可变区的编码序列
SEQ ID NO：16：鼠源PD-1.C抗体的轻链可变区的编码序列
SEQ ID NO：17：人源化PD-1.C抗体的重链可变区的编码序列
SEQ ID NO：18：人源化PD-1.C抗体的轻链可变区的编码序列
SEQ ID NO：55：鼠源PD-1.C抗体的重链的编码序列
SEQ ID NO：56：鼠源PD-1.C抗体的轻链的编码序列
SEQ ID NO：57：人源化PD-1.C抗体的重链的编码序列
SEQ ID NO：58：人源化PD-1.C抗体的轻链的编码序列
1)人源化PD-1.C抗体的表达纯化：
人源化PD-1.C抗体通过分别构建含编码SEQ ID NO.：9和SEQ ID NO.：10的氨基酸序列的多核苷酸(SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58)的pCAGGS表达载体(Addgene公司)，并分别引入酶切位点EcoRI和BglII，其中EcoRI酶切位点位于序列的5’端，酶切位点BglII位于序列的3’端。利用酶切位点EcoRI和BglII将合成的hu-PD-1.C轻链或重链的DNA序列克隆入表达载体pCAGGS(Addgene公司)，建立hu-PD-1.C抗体轻链和重链的重组真核表达质粒。将hu-PD-1.C抗体轻链和重链的表达质粒按照2∶1的比例，共同转染293T细胞，表达的抗体经Protein G亲和柱层析纯化。具体包括：
a.在转染前的14-16h将细胞密度较大的细胞分盘(如一盘100％铺满细胞的10cm培养皿以1∶3进行传代)，14-16h后，细胞密度达到70％上即可进行转染。
b.以10cm培养皿转染贴壁293T细胞为例：转染所需的质粒的量为20μg/盘(轻链∶重链＝1∶1，质量比)，稀释到100μL/盘的HBS液中，混匀后静置；以PEI(μL)∶质粒质量(μg)＝1∶4的比例确定PEI(1mg/mL)的用量，稀释到100μL/盘的HBS液中，混匀后静置。上述两溶液分别单独静置混合5min，之后将二者混合继续静置20min，最后加入到要转染的细胞培养液中。
c.转染4-6h后，给转染的细胞换液，先用2-3mL的PBS润洗两遍后再换成新鲜的无血清的DMEM培养基(按1∶1000加入了青链霉素)，在37℃恒温、5％CO2的培养箱中培养表达。
将上述转染后的细胞培养液，在培养3天后收取上清，用DMEM培养基换液，再到第七天再受一次上清。将2次收集的上清混合，纯化目的蛋白，纯化方法使用本实施例上述步骤5中的Protein G鼠源PD-1.C抗体纯化方法。经Protein G柱子亲和层析后的抗体纯度达到95％以上(如图6)。
2)人源化PD-1.C抗体的亲和力验证：
本实施例中，通过表面等离子共振技术(SPR)对PD-1.C抗体以及人源化PD-1.C抗体进行亲和力鉴定。
将实施例1中制备的PD-1蛋白以及人源化PD-1.C抗体换液至SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl，150mM Na-Cl，0.005％Tween-20，pH 7.4)。将PD-1蛋白稀释到20μg/ml固定到CM5芯片(GE Health)上，之后将梯度稀释的抗体分别流过CM5芯片各通道，利用BIA evaluation软件分析结合动力学参数，并计算亲和力常数。
通过对人源化后的PD-1.C抗体与PD-1亲和力的检测，结果表明，人源化PD-1.C抗体与PD-1的亲和力为1.88×10-9M。因此，从SPR结果可以看出，而人源化PD-1.C抗体亲和力与鼠源PD-1.C抗体相当，仍保持10-9M数量级的亲和力(如图7)。
实施例6.hu-PD-1.C抗体的NCG免疫缺陷鼠HCC827肿瘤抑制实验
本实施例应用NCG免疫缺陷小鼠HCC827肿瘤模型评价hu-PD-1.C抗体的肿瘤抑制效果。
hu-PD-1.C抗体的NCG小鼠肿瘤抑制实验步骤包括：
1.NCG小鼠人源免疫系统重建
NCG小鼠来源于南京大学-南京生物医药研究院，首先向每只NCG小鼠中接种健康个体来源的PBMCs细胞，在NCG小鼠体内建立具有人源免疫系统的小鼠：
i.接种人PBMCs细胞数量：1×107细胞/200μl/只；
ii接种部位：尾静脉；
2.HCC-827细胞系成瘤
接种PBMCs细胞3天后每只NCG小鼠中接种HCC-827非小细胞肺癌细胞系(ATCC)：
a)接种HCC-827细胞数量：5×107细胞/200μL/只；
b)接种部位：背部皮下；
3.分组及处理：
肿瘤细胞注射后约1周后选择成瘤较为均一的小鼠进行分组，之后进行抗体腹腔注射。本实施例以埃博拉病毒特异性抗体13C6(Mapp Biopharmaceutical)注射组为阴性对照，人源化PD-1.C抗体为处理组进行平行实验，每组10只小鼠。
小鼠分组 抗体注射及剂量 小鼠数量 阴性抗体对照组 10mg/kg，100μL 10 hu-PD-1.C抗体组 10mg/kg，100μL 10
抗体注射：小鼠成瘤明显后(7天)，分7次注射抗体，第一次200μg/只，之后间隔两天，即第三天第二次注射200μg/只，之后每三天或四天注射(均为200μg/只)。
成瘤后每三到四天检测一次肿瘤大小，最后一次注射后继续观察两周。
4.治疗效果观察：
1)肿瘤大小检测：
a)在抗体注射后用卡尺进行直径测量，单位为mm，计算公式为：v＝1/2×a×b×b(a为长径，b为短径)；
b)最后一次观察后实验终止，分离肿瘤组织直接拍照观察；
结果表明，注射13C6抗体的对照组小鼠在13C6抗体注射后均快速生长。hu-PD-1.C抗体注射组在抗体注射后肿瘤生长迅速进入平台期，有两只小鼠分别在抗体注射10天和14天后加速生长，但仍显著小于13C6抗体对照组。本实施例结果表明，hu-PD-1.C抗体能够有效抑制肿瘤生长，具有潜在的肿瘤治疗价值(如图8)。
序列信息
1)SEQ ID NO.：1：PD-1.C鼠源PD-1.C抗体重链：
2)SEQ ID NO.：2：PD-1.C鼠源PD-1.C抗体轻链
3)SEQ ID NO.：3：PD-1.C重链CDR1
GDTFTDYE
4)SEQ ID NO.：4：PD-1.C重链CDR2
IHPGSGGT
5)SEQ ID NO.：5：PD-1.C重链CDR3
TREGMNTDWYFDV
6)SEQ ID NO.：6：PD-1.C轻链CDR1
QTIVHTNGNTY
7)SEQ ID NO.：7：PD-1.C轻链CDR2
KVS
8)SEQ ID NO.：8：PD-1.C轻链CDR3
FQGSHVPYT
9)SEQ ID NO.：9：人源化PD-1.C重链
10)SEQ ID NO.：10：人源化PD-1.C轻链
11)SEQ ID NO：11：鼠源PD-1.C抗体的重链可变区
12)SEQ ID NO：12：鼠源PD-1.C抗体的轻链可变区
13)SEQ ID NO：13：人源化PD-1.C抗体的重链可变区
14)SEQ ID NO：14：人源化PD-1.C抗体的轻链可变区
15)SEQ ID NO：15：鼠源PD-1.C抗体的重链可变区的编码序列
16)SEQ ID NO：16：鼠源PD-1.C抗体的轻链可变区的编码序列
17)SEQ ID NO：17：人源化PD-1.C抗体的重链可变区的编码序列
18)SEQ ID NO：18：人源化PD-1.C抗体的轻链可变区的编码序列
19)SEQ ID NO：55：鼠源PD-1.C抗体的重链的编码序列
20)SEQ ID NO：56：鼠源PD-1.C抗体的轻链编码序列
21)SEQ ID NO：57：人源化PD-1.C抗体的重链编码序列
22)SEQ ID NO：58：人源化PD-1.C抗体的轻链编码序列