技术领域
本发明总地涉及多靶点结合分子和其治疗应用领域、更具体涉及融合蛋白及其组合物和治疗应用，所述融合蛋白由转化生长因子β(TGFβ)拮抗剂结构域和拮抗异源靶点如IL6、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF1或IGF2的另一结合域组成，或由TGFβ拮抗剂结构域和激动异源靶点如GITR的另一结合域组成。
背景技术
转化生长因子-β(TGFβ)是对免疫系统有显著影响的强效细胞因子。TGFβ在免疫系统中的主要功能是维持对外来病原体的耐受和初始免疫应答。在哺乳动物中鉴定到TGFβ的三种同种型，即TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，其中TGFβ1是主要的同种型。TGFβ以潜伏形式分泌，分泌的全部TGFβ中只有一小部分在生理条件下活化。TGFβ的生物学作用大部分通过TGFβ与受体ALK5和TGFβ受体II(TGFβR2)的结合而实现。具体说，活性TGFβ二聚体能结合四聚体ALK5和TGFβR2复合物，以启动信号转导。TGFβ的初始结合不需要ALK5，但信号转导需要它。
TGFβ能影响许多细胞功能，例如细胞增殖、分化、细胞-细胞和细胞-基质粘附、细胞运动和淋巴细胞的活化。(有关TGFβ在调节免疫应答中的作用的综述可参见Li等(2006)Annu.Rev.Immunol.24：99-146。)而且，相信TGFβ能诱导或介导许多疾病的进展，例如骨质疏松症，高血压，动脉粥样硬化，肝硬化，肾、肝和肺的纤维性疾病，以及肿瘤进展。在某些疾病，例如糖尿病性肾病、血管球性肾炎、环孢菌素介导的肾脏损伤和系统性红斑狼疮(SLE)的动物模型中，TGFβ可提高慢性炎症引起的末端器官损伤，而TGFβ拮抗剂能有效减轻这种损伤(Border等(1990)Nature346：371-374；Border等(1992)Nature 360：361-364；Isaka等(1999)KidneyInt.55：465-475；Sharma等(1996)Diabetes 45：522；Xin等(2004)Transplantation 15：1433；Benigni等(2003)J.Am.Soc.Nephrol.14：1816)。在癌症方面，TGFβ对恶性细胞可能有直接抑制作用，并可能提高一系列肿瘤生长因子和血管新生因子的产量或活性。
虽然TGFβ敲除小鼠具有与无限制的炎症和自身免疫相关严重病理，但小鼠和人均能良好耐受TGFβ拮抗剂的给药(Rusek等(2003)Immunopharmacol.Immunotoxicol.25：235-57；Denton等(2007)ArthritisRheum.56：323-33)。用本领域已知的TGF拮抗剂的治疗方法包括使用TGFβ的抗体、使用TGFβR2胞外域Ig融合蛋白以及使用TGFβRI激酶活性的小分子抑制剂。所有这些方法在疾病的啮齿动物模型中或在人的临床试验中产生适度有益影响(Denton等(2007)Arthritis Rheum.56：323)。实际上，对小鼠长期使用TGFβ拮抗剂不会激活免疫系统，正如由TGFβ-/-敲除小鼠的表型预计的那样。这很可能部分反映出人类疾病中细胞因子、白介素、化学因子和生长因子的生物学作用的复杂特质，以及需要同时抑制一条以上通路以便使患者获得最大益处。
附图简要说明
图1A-1C显示通过ELISA检测到含有与TNFR胞外域融合的各种不同超级(Hyper)-IL6结合域之一的多特异性(交叉受体(Xceptor))融合蛋白能特异性结合超级-IL6，与单独的IL6和IL6R相比这些多特异性融合蛋白优先结合超级-IL6。经测试，只有两种融合蛋白结合IL6，而没有融合蛋白结合sIL6R。
图2显示通过ELISA检测到含有融合于各种不同超级-IL6结合域之一的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白能特异性结合TNF-α。
图3显示通过ELISA检测到含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白可同时结合超级-IL6和TNF-α。
图4显示通过ELISA检测到含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白能阻断gp130与超级-IL6的结合。
图5A和5B显示含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白能阻断(A)IL6或(B)超级-IL6诱导的TF-1细胞增殖。
图6显示通过ELISA检测到含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白能阻断TNF-α与TNFR的结合。
图7显示含有融合于各种不同超级-IL6结合域之一的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白能阻断TNF-α诱导的对L929细胞的杀伤作用。
图8显示通过ELISA检测到含有融合于各种不同超级-IL6结合域之一的TGFβR2胞外域的多特异性融合蛋白能特异性结合TGFβ1。
图9显示含有融合于TGFβRII胞外域的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白能阻断TGFβ-1诱导的对HT2细胞IL-4增殖的抑制作用。
图10显示含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白不结合HepG2(肝)细胞。
图11显示含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白在小鼠中阻断HIL6诱导的SAA应答。
图12显示含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白在小鼠中阻断HIL6诱导的sgp130应答。
图13A和B显示关于含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白在给药后2小时和24小时阻断TNFα-诱导的小鼠SAA应答的能力的研究结果。
发明详述
本发明提供多特异性融合蛋白，在本文中称为交叉受体(xceptor)分子。这种多特异性融合蛋白的示范性结构包括N-BD-ID-ED-C、N-ED-ID-BD-C，和N-ED1-ID-ED2-C，其中N-和-C分别代表氨基-和羧基-末端，BD是免疫球蛋白样或免疫球蛋白可变区结合域，ID是间插结构域，ED是胞外域(例如细胞外的结构域)，如受体配体结合域、富半胱氨酸结构域(A结构域；参见WO02/088171和WO 04/044011)，脑信号蛋白或脑信号蛋白样结构域等。在一些构建物中，ID可以包含安置在第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区域。在另一构建物中，BD和ED各自通过相同或不同的接头(如包含1-50个氨基酸的接头)，如免疫球蛋白绞链区(由(例如)上部区域和核心区域构成)或其功能性变体，或凝集素域间区或其功能性变体，或分化群(CD)分子杆区域(stalk region)或其功能性变体连接于ID。
在更详细地阐述本发明之前，提供本文所用某些术语的定义可能有助于理解本发明。其它定义在本说明书全文中列出。
在本说明书中，任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。另外，本文所述的有关物理特征，例如聚合物亚基、大小或厚度的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数，除非另有说明。本文所用术语″约″或″由...组成″至所述范围、数值或结构的±20％，除非另有说明。应理解，本文所用术语“一个”和“一种”指一个或多个所列举的组件。另选方式的使用(如“或”)应理解为所述另选方式中的一个、两个或任何组合。在本文中，术语“包含”和“包括”可作为同义词使用。此外，应理解本申请公开衍生自本文所述结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组时，就好像每种化合物或每组化合物单独列出那样。因此，特定结构或特定取代基的选择属于本发明范围。
本发明所述的“结合域”或“结合区”可以是(例如)能够特异性识别和结合生物分子(如TGFβ或IL6)或一个以上相同或不同分子的复合物或组装体或聚集体(不论它是稳定的或是瞬变的，如IL6/IL6R复合物)的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。这类生物分子包括蛋白质、多肽、寡肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂质、脂肪酸或其衍生物；碳水化合物、糖类或其衍生物；核苷酸、核苷、肽核酸、核酸分子或其衍生物；糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂类或其衍生物；生物学样品中可能存在的其它生物分子；或者它们的任何组合。结合区包括生物分子或其它感兴趣靶点的任何天然产生的、合成的、半合成的或重组产生的结合伙伴。已知各种鉴定特异性结合特定靶点的本发明结合域的实验方法，包括Western印迹、ELISA或Biacore分析。
可能，如果本发明的结合域和其融合蛋白结合靶分子的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的平衡结合常数，单位是1/M)是(例如)大于或等于约105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1，则它们能够以所需程度结合，包括“特异性或选择性”结合靶点，而不显著结合试样中的其它组分。“高亲和力”结合域指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的结合域。或者，亲合力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，单位是M(如10-5M至10-13M)。本发明结合域多肽和融合蛋白的亲和力不难用常规技术测定(参见例如，Scatchard等(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660；和美国专利号5,283,173；5,468,614；分析；或等同物)。
可根据本文所述方法或本领域已知的各种方法产生本发明结合域(参见例如，美国专利6,291,161；6,291,158)。来源包括来自各种物种，包括人、驼科动物(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼；Hamers-Casterman等(1993)Nature，363：446和Nguyen等(1998)J.Mol.Biol.，275：413)、鲨鱼(Roux等(1998)Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)95：11804)、鱼(Nguyen等(2002)Immunogenetics，54：39)、啮齿动物、禽类、羊的抗体基因序列(形式可以是抗体、sFv、scFv或Fab，如噬菌体文库中)，编码随机肽文库的序列或编码其它非抗体支架的环区域中工程改造的多种氨基酸的序列，如血纤蛋白原结构域(参见例如，Weisel等(1985)Science 230：1388)、Kunitz结构域(参见例如，美国专利6,423,498)、脂质运载蛋白结构域(参见例如，WO2006/095164)、V样结构域(参见例如，美国专利申请公开号2007/0065431)、C-型凝集素结构域(Zelensky和Gready(2005)FEBS J.272：6179)、mAb2或FcabTM(参见例如，PCT专利申请书公开号WO 2007/098934；WO2006/072620)，等等。此外，也可通过将合成的单链IL6/IL6R复合物，如人IL6/IL6R复合物或超级-IL6(IL6通过肽接头连接于IL6R)用作方便系统(如小鼠、HuMAbTC小鼠TM、KM-美洲驼、鸡、大鼠、仓鼠，家兔等)中的免疫原的传统杂交瘤开发策略来开发本发明结合域。
除非另有说明，抗体技术领域技术人员理解的术语各自具有所述领域获得的含义。例如，术语“VL”和“VH”分别指衍生自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的良好限定的亚区域构成，这些区域称为“互补决定”(CDR)和“构架区”(FR)。术语“CL”和“CH”指“免疫球蛋白恒定区”，分别指衍生自抗体轻链或重链的恒定区，后者还可根据衍生该区域的抗体的同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)进一步分为CH1、CH2、CH3和CH4恒定区结构域。恒定区结构域的一部分构成Fc区(″可结晶片段″区)，其包含负责免疫球蛋白效应物功能如ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)、ADCP(抗体依赖的细胞介导的吞噬作用)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体结合、与Fc受体结合、相对于缺少Fc区的多肽体内半衰期延长、蛋白A结合、可能甚至是胎盘转移的结构域(参见Capon等(1989)Nature，337：525)。而且，含有Fc区的多肽能够发生二聚化或多聚化。在本文中，“绞链区”也称为“接头”，它是介于抗体某一条链的可变结合区和恒定区之间并连接二者的氨基酸序列，本领域已知它能够以绞链形式为抗体或抗体样分子提供柔韧性。
免疫球蛋白的结构域结构适合工程改造，因为在免疫球蛋白分子不同类和亚类之间可交换抗原结合区和产生效应物功能的结构域。有关免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如Harlow等编，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，第14章(冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，1988)。有关重组抗体技术的各个方面的详细介绍和信息可参见《重组抗体》教科书(纽约州约翰韦利森出版社(John Wiley&Sons，NY)，1999)。有关抗体工程的详细实验方案的集合可参见R.Kontermann和S.Dübel编，抗体工程实验室手册(The AntibodyEngineering Lab Manual)(纽约/海德堡的施普林格出版社(Springer Verlag，Heidelberg/New York)，2000)。
本文所用的“衍生物”指化学或生物学改性的化合物，其结构类似于母体化合物且(实际或理论上)可从该母体化合物获得。通常，“衍生物”不同于“类似物”，因为母体化合物可以是产生“衍生物”的原料，但母体化合物不一定用作产生“类似物”的原料。类似物可具有与母体化合物不同的化学或物理特性。例如，与母体化合物相比衍生物可能亲水性更高或反应性改变，例如具有使其靶点亲和力改变的氨基酸变化的CDR。
术语“生物学样品”包括血样、活检样品、组织外植体、器官培养物、生物流体，或任何其它组织或细胞，或者来自对象或生物来源的其它制备物。对象或生物来源可以是(例如)人或非人动物、原代细胞培养物或适合培养的细胞系，包括含有染色体整合的或附加体形式的重组核酸序列的遗传工程改造细胞系、体细胞杂交细胞系、已永生化或可永生化细胞系、已分化或可分化细胞系、转化的细胞系等等。在本发明的其它实施方式中，可怀疑对象或生物来源患有疾病、失调或病症，或处于患上疾病、失调或病症的风险中，所述疾病、失调或病症包括恶性疾病、失调或病症或B细胞疾病。在某些实施方式中，对象或生物来源可以是怀疑患有过度增殖、炎性或自身免疫性疾病或者处于发生这些疾病的风险中，在本发明某些其它实施方式中对象或生物来源可以是已知未患这种疾病、失调或病症，或者不处于患上疾病、失调或病症的风险中。
在某些实施方式中，本发明可能通过提供多特异性融合蛋白消耗或调节与TGFβ活性异常有关的细胞，所述融合蛋白能结合TGFβ和除TGFβ外的第二靶点，例如IL6、IL6R、IL6/IL6R复合物、IL10、GITR、VEGF、TNF、HGF、肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导物(TWEAK；也称为肿瘤坏死因子(配体)超家族成员12，TNFSF12)、IGF1或IGF2。在某些实施方式中，多特异性融合蛋白包含第一和第二结合域、第一和第二接头和间插结构域，其中所述间插结构域的一端通过接头与作为TGFβR2胞外域(如胞外结构域)的第一结合域融合，另一端通过接头与第二结合域融合。在一些实施方式中，采用小于完整TGFβR2胞外域的部分。具体说，采用胞外域内用作TGFβ拮抗剂或赋予配体结合作用的结构域。
在某些实施方式中，所述第二结合域是IL6拮抗剂(如对IL6、IL6R或IL6/IL6Ra复合物特异性的免疫球蛋白可变区)、IL10拮抗剂(如对IL10、IL10R1胞外域(如SEQ ID NO：745)或IL10R1胞外域的亚结构域特异性的免疫球蛋白可变区)、GITR激动剂(如对GITR、GITRL胞外域(例如，Genbank登录号NP_005083.2的氨基酸74-181，SEQ ID NO：746)或GITRL胞外域的亚结构域特异性的免疫球蛋白可变区)、VEGF拮抗剂(如对VEGF、VEGFR2胞外域(参见Genbank登录号NP_002244.1，SEQ ID NO：747)或VEGFR2胞外域的亚结构域特异性的免疫球蛋白可变区)、TNF拮抗剂(如对TNF、TNFR1胞外域(参见Genbank登录号NP_001056.1；SEQ ID NO：749)、TNFR1胞外域的亚结构域、TNFR2胞外域(参见Genbank登录号NP_001057.1；SEQ ID NO：748)或TNFR2胞外域的亚结构域特异性的免疫球蛋白可变区)、HGF拮抗剂(如对HGF、c-Met胞外域或c-Met胞外域的亚结构域(如SEQ ID NO：750-752)特异性的免疫球蛋白可变区)、TWEAK拮抗剂(如对TWEAK或TWEAKR，或者TWEAKR胞外域(如SEQ ID NO：761)或其TWEAK结合片段特异性的免疫球蛋白结合域)，或者IGF1或IGF2拮抗剂(如对IGF1或IGF2，IGF1R胞外域(例如Genbank登录号NP_000866.1的IGF1R胞外域(SEQ ID NO：753)或其亚结构域)或IGFBP(例如，Genbank登录号NP_000587.1(IGFBP1；SEQ ID NO：754)、NP_000588.2(IGFBP2；SEQ ID NO：755)、NP_001013416.1(IGFBP3同种型a；SEQ IDNO：756)、NP_000589.2(IGFBP3同种型b；SEQ ID NO：757)、NP_001543.2(IGFBP4；SEQ ID NO：758)、NP_000590.1(IGFBP5；SEQ ID NO：759)或NP_002169.1(IGFBP6；SEQ ID NO：760)的IGFBP胞外域)或其亚结构域特异性的免疫球蛋白可变区)。
在本文中，提及IL6与膜IL6Rα或可溶性IL6Rα(sIL6Rα)的复合物时，将IL6与膜或可溶性IL6受体(IL6Rα)的复合物称为IL6xR，仅提及IL6与sIL6Rα的复合物时，称之为sIL6xR。在一些实施方式中，含有IL6xR的特异性结合域的多特异性融合蛋白具有以下一种或多种特性：(1)对IL6xR复合物的亲和力高于或等于对单独IL6或单独IL6Rα的亲和力，或者对单独IL6Rα或IL6xR复合物的亲和力大于对单独IL6的亲和力；(2)与膜gp130竞争结合sIL6xR复合物或增强可溶性gp130与sIL6xR复合物的结合；(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导；和(4)不抑制除IL6外的gp130家族细胞因子的信号转导。
TGFβ拮抗剂
如上所述，TGFβ与若干疾病，例如纤维化、自身免疫病和癌症相关联。在肿瘤的早期发展阶段，TGFβ用作生长抑制因子。然而，随着肿瘤的发展，它们发展出避开TGFβ的生长抑制作用的机制，导致肿瘤侵袭增加、转移潜能提高并能抑制周围的免疫应答(Luwor等(2008)J.Clin.Neurosci.6月10日(电子公开))。本发明TGFβ拮抗剂抑制TGF的促肿瘤活性。该拮抗剂结构域可阻断TGFβ二聚化或TGFβ结合，或者该结构域可结合受体系统的组分并通过防止配体活性或防止受体复合物的组装而阻断活性。
在一些实施方式中，TGFβ拮抗剂可以是TGFβR2的细胞外结构域(“胞外域”)。在某些实施方式中，TGFβ拮抗剂包含SEQ ID NO：743、744或其任何组合所列的TGFβR2胞外域。
一方面，本发明的TGFβ拮抗剂或其融合蛋白对TGFβ有特异性，其亲和力表征为离解常数(Kd)约为10-5M-10-13M或更低。在某些实施方式中，TGFβ拮抗剂或其融合蛋白结合TGFβ的亲和力小于约300pM。另一种量度，即动力学解离(kd)(在本文中也称为kOFF)是复合物解离速率的衡量，因此是本发明多肽结合域结合靶分子的‘停留时间’的衡量。kd(kOFF)的单位是1/秒。本发明的示范性TGFβ拮抗剂的kOFF可为约10-4/秒(如约一日)至约10-8/秒或更低。在某些实施方式中，kOFF范围可以是约10-1/秒、约10-2/秒、约10-3/秒、约10-4/秒、约10-5/秒、约10-6/秒、约10-7/秒、约10-8/秒、约10-9/秒、约10-10/秒或更低(参见Graff等(2004)Protein Eng.Des.Sel.17：293)。在一些实施方式中，与关联TGFβ受体与TGFβ的结合相比，本发明TGFβ拮抗剂或其融合蛋白将以较高亲和力和较低kOFF速率结合TGFβ。在其它实施方式中，与关联TGFβ受体的亲和力和二聚化速率相比，阻断或改变TGFβ二聚化或其它细胞表面活性的本发明的TGFβ拮抗剂或其融合蛋白可具有较为中等的亲和力(即，Kd为约10-8M至约10-9M)和较为中等的解离速率(即，kOFF更接近约10-4/秒)。
可根据本文所述方法或本领域已知的各种方法产生用作本发明TGFβ拮抗剂的示范性结合结构域(参见例如，美国专利6,291,161，6,291,158)。来源包括来自各种物种，包括人、驼科动物(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼；Hamers-Casterman等(1993)Nature，363：446和Nguyen等(1998)J.Mol.Biol.，275：413)、鲨鱼(Roux等(1998)Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)95：11804)、鱼(Nguyen等(2002)Immunogenetics，54：39)、啮齿动物、禽类、羊的抗体基因序列(形式可以是scFv或Fab，如噬菌体文库中)，编码随机肽文库的序列或编码其它非抗体支架的环区域中工程改造的多种氨基酸的序列，如血纤蛋白原结构域(参见例如，Weisel等(1985)Science230：1388)、Kunitz结构域(参见例如，美国专利6,423,498)、脂质运载蛋白结构域(参见例如，WO 2006/095164)、V样结构域(参见例如，美国专利申请公开号2007/0065431)、C-型凝集素结构域(Zelensky和Gready(2005)FEBS J.272：6179)等等。此外，也可通过将合成的TGFβ或单链TGFβR2胞外域用作方便系统(如小鼠、HuMAbTC小鼠TM、KM-美洲驼、鸡、大鼠、仓鼠，家兔等)中的免疫原的传统杂交瘤开发策略来开发本发明结合域。
在一个示范性例子中，可利用Fab片段噬菌体文库，通过筛选与合成或重组的TGFβ(使用GenBank登录号NP_000651.3所示的氨基酸序列或其片段)的结合，来鉴定对TGFβ特异性的本发明TGFβ拮抗剂(参见例如，Hoet等(2005)Nature Biotechnol.23：344)。本文所述或本领域已知的TGFβ可用于这类筛选。在某些实施方式中，用于产生TGFβ拮抗剂的TGFβ还可包含本文所述的间插结构域或二聚化结构域，例如免疫球蛋白Fc结构域或其片段。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ拮抗剂结构域包含本文所述的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。在其它实施方式中，提供的本发明TGFβ拮抗剂结构域的序列与一种或多种轻链可变区(VL)或一种或多种重链可变区(VH)或二者的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同，其中各个CDR至多有三个氨基酸发生改变(即，许多改变发生在构架区)，如本文所列。
在一些实施方式中，本发明的TGFβ拮抗剂结构域包含本文所列的VH和VL结构域，它们与这类VH结构域、VL结构域或二者的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同，其中各CDR至多含有3个氨基酸改变(即，许多改变发生在构架区)。
在两种或多种多肽或核酸分子序列中，术语“相同”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列在指定区域相同或其中有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST 2.0算法，分别可参见Altschul等(1977)NucleicAcids Res.25：3389和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403。
在本文所述的任何这些或其它实施方式中，VL和VH结构域可以任何取向安置，可由本文所述的约5-30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接VH和VL结构域的接头包含SEQ ID NO：497-604和1223-1228所示的氨基酸序列，如接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)。多特异性结合域将具有至少两个特异性亚结合域，其类似于羊驼抗体组织；或具有至少四个特异性亚结合域，其类似于成对VH和VL链的更常规的哺乳动物抗体组成。
在其它实施方式中，本发明的TGFβ拮抗剂结构域和其融合蛋白可包含含有一个或多个互补决定区(“CDR”)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR的结合域，这类CDR是由抗-TGFβ或抗-TGFβR2scFv或Fab片段的可变区或者由重链或轻链可变区获得、衍生或设计出的。
本领域以多种方式定义了CDR，包括Kabat、Chothia、AbM和接触定义。Kabat定义基于序列变异性，是最常用的预测CDR区域的定义(Johnson等(2000)Nucleic Acids Res.28：214)。Chothia定义基于结构环区域的定位(Chothia等(1986)J.Mol.Biol.196：901；Chothia等(1989)Nature 342：877)。AbM定义在Kabat和Chothia定义之间作出妥协，它是牛津分子集团(Oxford MolecularGroup)开发的用于抗体结构建模的完整程序包(Martin等(1989)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)86：9268；Rees等，ABMTM，用于抗体可变区建模的计算机程序(a computer program for modeling variable regions of antibodies)，Oxford，UK；牛津分子公司(Oxford Molecular，Ltd.))。近年来引入了称为接触定义的另外一种定义(参见MacCallum等(1996)J.Mol.Biol.5：732)，该定义基于对可用复合物晶体结构的分析。
通常，重链中的CDR结构域称为H1、H2和H3，它们是从氨基端向羧基端顺序编号的。CDR-H1长约10-12个残基，按照Chothia和AbM定义从Cys之后第四个残基开始，或按照Kabat定义从其后五个残基开始。H1可后接Trp、Trp-Val、Trp-Ile或Trp-Ala。按照AbM定义，H1的长度约为10-12个残基，而Chothia定义则排除了最后四个残基。按照Kabat和AbM定义，CDR-H2从H1末端后15个残基处开始，通常其前接序列Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(但已知许多变异)且通常后接序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。按照Kabat定义，H2的长度为约16-19个残基，而AbM定义预测其长度为9-12个残基。通常，CDR-H3从H2末端后33个残基处开始，通常前接氨基酸序列Cys-Ala-Arg且后接氨基酸Gly，其长度范围是3-约25个残基。
通常，轻链中的CDR区称为L1、L2和L3，它们是从氨基端向羧基端顺序编号的。CDR-L1通常大概从残基24处开始，并且通常前接Cys。CDR-L1后的残基总是Trp，以其为首的后接序列为：Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln或Trp-Tyr-Leu。CDR-L1的长度近似为10-17个残基。CDR-L2从L1末端后约16个残基处开始，通常前接残基Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L2长约7个残基。CDR-L3通常从L2末端后33个残基处开始，通常前接Cys，且通常后接序列Phe-Gly-XXX-Gly，其长度约为7-11个残基。本发明结合域可包含来自抗-TGFβ或抗-TGFβR2的可变区的单个CDR，或者可包含多个相同或不同的CDR。
因此，本发明结合域可包含来自抗-TGFβ或抗-TGFβR2的可变区的单个CDR，或者可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明结合域包含对TGFβ或TGFβR2特异性的VH和VL结构域，其含有构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述VH结构域包含重链CDR3的氨基酸序列；或(b)所述VL结构域包含轻链CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，并且VH和VL存在于同一参比序列中。在其它实施方式中，本发明结合域包含对TGFβ或TGFβR2特异性的VH和VL结构域，其包含构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述VH结构域包含重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(b)所述VL结构域包含轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，其中所述VH和VL氨基酸序列来自同一参比序列。
在本文所述的包含特异性CDR的任何实施方式中，结合域可包含(i)具有与VH结构域氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的VH结构域，其中各CDR至多有三个氨基酸发生改变(即，许多改变发生在构架区)；或(ii)具有与VL结构域氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的VL结构域，其中各CDR至多有三个氨基酸发生改变(即，许多改变发生在构架区)；或(iii)(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域；或者(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域，其中VH和VL来自同一参比序列。
本发明融合蛋白的TGFβ拮抗剂结构域可以是免疫球蛋白样结构域，如免疫球蛋白支架。本发明的免疫球蛋白支架包括scFv、结构域抗体或仅含重链的抗体。在scFv中，本发明考虑到重链和轻链可变区由本领域已知的任何接头肽连接，以便与结合分子中结合的结构域或区域相容。示范性接头是基于Gly4Ser接头基序的接头，例如(Gly4Ser)n，其中n＝1-5。如果本发明融合蛋白的结合域基于非人免疫球蛋白或包含非人CDR，则所述结合域可以是根据本领域已知方法“人源化的”。
或者，本发明融合蛋白的TGFβ拮抗剂结构域可以是除免疫球蛋白支架以外的支架。本发明考虑的其它支架能以功能性构象递呈TGFβ-特异性CDR。所考虑的其它支架包括但不限于：A结构域分子、纤连蛋白III结构域、抗脂质运载蛋白(anticalin)，锚蛋白重复工程改造的结合分子、腺连蛋白(adnectin)，库尼茨(kunitz)结构域或蛋白AZ结构域亲和蛋白(affibody)。
IL6拮抗剂
如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为IL6拮抗剂(例如，优先抑制IL6反式信号转导或同时抑制IL6顺式-和反式-信号转导)的结合区或结合域的多肽。在某些实施方式中，本发明提供含有对IL6/IL6R复合物特异性的结合区或结合域的多特异性融合蛋白，所述结合区或结合域具有以下一种或多种特性：(1)对IL6/IL6R复合物的亲和力大于或等于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力，或者对单独IL6Rα或IL6/IL6R复合物的亲和力大于对单独的IL6的亲和力，(2)与膜gp130竞争结合sIL6/IL6R复合物或提高可溶性gp130与sIL6/IL6R复合物的结合，(3)与IL6顺式细胞转导相比优先抑制IL6反式信号转导，或者(4)不抑制IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。在某些优选实施方式中，根据本发明对IL6/IL6R复合物特异性的结合域具有以下特性：(1)对单独IL6Rα或IL6xR复合物的亲和力大于对单独IL6的亲和力，(2)增加可溶性gp130与sIL6/IL6R复合物的结合，(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导，和(4)不抑制除IL6以外的gp 130家族细胞因子的信号转导。例如，对IL6/IL6R复合物特异性的结合区或结合域可以是免疫球蛋白如抗体、Fab、scFv等的可变区或其衍生物。就本发明而言，应理解对IL6/IL6R复合物特异性的结合区或结合域不是本文所述的gp130。
如本文所用，“IL6xR复合物”或“IL6xR”指IL6与IL6受体的复合物，其中IL6受体(也称为，例如，IL6Rα、IL6RA、IL6R1和CD126)是膜蛋白(本文称为mIL6R或mIL6Rα)或可溶形式(本文称为sIL6R或sIL6Rα)。术语“IL6R”包括mIL6Rα和sIL6Rα。在一个实施方式中，IL6xR包括IL6和mIL6Rα的复合物。在某些实施方式中，IL6xR复合物通过一个或多个共价键保持在一起。例如，IL6R的羧基端可通过肽接头融合于IL6的氨基端，该接头在本领域中称为超级-IL6(参见例如，Fischer等(1997)Nat.Biotechnol 15：142)。超级-IL6接头可由交联化合物、1-50个氨基酸的序列或其组合组成。超级-IL6还可包含二聚化结构域，如免疫球蛋白Fc结构域或免疫球蛋白恒定结构域亚区。在某些实施方式中，IL6xR复合物通过非共价相互作用，例如氢键、静电相互作用、范德华力、盐桥、疏水性相互作用等或其组合保持在一起。例如，IL6和IL6R可天然地非共价结合(如天然情况下，或者作为合成或重组的蛋白)，或者各自融合于促进多聚化的结构域，如免疫球蛋白Fc结构域，以进一步提高复合物的稳定性。
本文所用的“gp130”指结合于IL6xR复合物的信号转导蛋白。gp130蛋白可位于膜内(mgp130)、呈可溶形式(sgp130)或其任何其它功能形式。示范性gp130蛋白具有GenBank登录号NP_002175.2所列序列或者其任何可溶或衍生形式(参见例如，Narazaki等(1993)Blood 82：1120或Diamant等(1997)FEBSLett.412：379)。为了说明且不希望受限于理论，mgp130蛋白可结合于IL6/mILR或IL6/sILR复合物，而sgp130主要与IL6/sILR复合物结合(参见Scheller等(2006)Scand.J.Immunol.63：321)。因此，本发明结合域或其融合蛋白的某些实施方式可通过以高于单独IL6或IL6Rα的亲和力结合IL6xR，优选通过与sIL6xR复合物竞争结合mgp130，从而抑制IL6xR复合物反式信号转导。当(1)结合域或其融合蛋白阻止gp130结合sIL6xR，且所述结合域结合sIL6xR的亲和力等于或高于gp130与sIL6xR的结合亲和力，或者(2)结合域或其融合蛋白增强或促进sgp130与sIL6xR结合时，称本发明结合域与gp130“竞争”结合sIL6xR。
一方面，本发明的IL6拮抗剂对IL6或IL 6xR复合物的亲和力是对单独IL6Rα的亲和力的至少2倍至1000倍；或者对IL6Rα或IL6xR复合物的亲和力是对单独IL6的亲和力的至少2倍至1000倍。通过结合IL6、IL6R或IL6xR复合物，本发明的IL6拮抗剂优先抑制IL6顺式-和反式信号转导。在某些实施方式中，结合域对IL6或sIL6xR复合物的亲和力与gp130对IL6xR复合物的亲和力大致相同-“大致相同”指亲和力相等或高至多约2倍。在某些实施方式中，所述结合域对IL6、IL6R或IL6xR复合物的亲和力是gp130对IL6xR复合物的亲和力的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、1000倍或更高。例如，如果gp130对IL6xR复合物的亲和力为约2nM(参见例如，Gaillard等(1999)Eur.Cytokine Netw.10：337)，那么对IL6xR复合物的亲和力是gp130的至少10倍的结合域的解离常数(Kd)为约0.2nM或更低。
在其它实施方式中，本发明IL6拮抗剂结合域包含具有以下特性的多肽序列：(a)与sIL6xR复合物的结合亲和力为对单独IL6或单独IL6Rα的亲和力的至少2倍、10倍、25倍、50倍、75倍至100倍、100倍至1000倍，(b)与膜gp130竞争结合sIL6xR复合物或增加可溶性gp130与sIL6xR复合物的结合。在其它实施方式中，结合sIL6xR复合物的亲和力是结合单独IL6或单独IL6Rα的亲和力的至少2倍、10倍、25倍、50倍、75倍至100倍、100倍至1000倍的本发明多肽结合域也可以(i)相对于IL6顺式信号转导更显著地或优选地抑制IL6反式信号转导，(ii)不抑制除IL6以外的gp130细胞因子家族成员的信号转导，(iii)相对于IL6顺式信号转导优选抑制IL6反式信号转导，不在可检测水平抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导，(iv)可具有以上两种或多种特性，或者(v)可具有所有上述特性。
在某些实施方式中，本发明的多肽IL6拮抗剂结合域结合sIL6xR复合物的亲和力是结合单独IL6或单独IL6Rα的亲和力的至少2倍至1000倍，并且相对于IL6顺式信号转导能更显著地或优选地抑制IL6反式信号转导。术语“相对于IL6顺式信号转导优选地抑制IL6反式信号转导”指在不显著改变IL6顺式信号转导(即抑制很小、不存在或检测不到)的情况下，将反式信号转导改变至可检测到sIL6xR活性降低的程度。例如，可检测sIL6xR活性的生物标记物(如，在HepG2细胞中急性期表达抗胰凝乳蛋白酶(ACT))来检测反式信号转导抑制。代表性实验可参见Jostock等(Eur.J.Biochem.，2001)-简要说，可刺激HepG2细胞以便在sIL6xR(反式信号转导)或IL6(顺式信号转导)存在下过度表达ACT，然而，加入spg130会抑制sIL6xR诱导的ACT过度表达而不显著影响IL6诱导的表达。相似地，相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导的本发明多肽结合域将抑制sIL6xR诱导的ACT过度表达(即，抑制反式信号转导)，而不显著影响IL6诱导的表达(即，不可检测到顺式信号转导降低)。本领域已知的这种和其它试验可用于测定相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导(参见例如，Sporri等(1999)Int.Immunol.11：1053；Mihara等(1995)Br.J.Rheum.34：321；Chen等(2004)Immun.20：59所述的其它生物标记物)。
在其它实施方式中，通过除IL6以外的gp130家族细胞因子进行的信号转导基本不受本发明结合域多肽或其多特异性融和蛋白的抑制。例如，IL6xR复合物通过gp130进行的顺式和反式信号转导会受到抑制，但一种或多种其它gp130家族细胞因子的信号转导，如通过(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生成素(neuropoietin、NPN)、心肌营养蛋白样细胞因子(CLC)、(OSM)、IL-11、IL-27、IL-31、心肌营养蛋白-1(CT-1)或其任何组合的信号转导受到的影响很小或不受影响。
本领域技术人员应理解，本发明结合域的体内半衰期优选为数天或数周的数量级，然而，虽然结合域浓度可以较低，但靶点可能已经足够因为在疾病状态下IL6和sIL6的产量明显提高(参见例如，Lu等(1993)Cytokine 5：578)。因此，在某些实施方式中，本发明结合域的kOFF为约10-5/秒(如，大约一天)或更短。在某些实施方式中，kOFF范围可以是约10-1/秒、约10-2/秒、约10-3/秒、约10-4/秒、约10-5/秒、约10-6/秒、约10-7/秒、约10-8/秒、约10-9/秒、约10-10/秒或更低。
在示范性实例中，通过筛选与合成的IL6xR复合物的结合，在Fab噬菌体片段文库中鉴定对IL6或IL6xR复合物特异性的本发明结合域(参见Hoet等(2005)Nature Biotechnol.23：344)。用于此种筛选的合成的IL6xR复合物包括N-IL6R α(片段(frag))-L1-IL6(frag)-L2-ID-C结构，其中N是氨基末端且C是羧基末端，IL6Rα(frag)是全长IL6Rα的片段，IL6(frag)是IL6的片段，L1和L2是接头，ID是间插或二聚化结构域，例如免疫球蛋白Fc结构域。
更具体说，用于鉴定对IL6xR复合物特异性的结合域的IL6xR(超级IL6的形式之一)从氨基端到羧基端的结构如下：(a)来自IL6Rα的丢失全长蛋白前110个氨基酸的212个氨基酸的中心片段和取决于所用同种型(参见GenBank登录号NP_000556.1，同种型1或NP_852004.1，同种型2)的羧基端部分，其融合于(2)G3S接头，进而融合于(3)IL6的175个氨基酸的羧基末端片段(即，丢失全长蛋白前27个氨基酸；GenBank登录号NP_000591.1)，进而融合于(4)作为如SEQ ID NO：589所示IgG2A铰链的接头，最后融合于由免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域构成的二聚化结构域。在某些实施方式中，由IgG1 Fc结构域组成的所述二聚化结构域中以下一个或多个氨基酸被突变(即，在该位置具有不同的氨基酸)：234位的亮氨酸(L234)、235位的亮氨酸(L235)、237位的甘氨酸(G237)、318位的谷氨酸(E318)、320位的赖氨酸(K320)、322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(EU编号)。例如，可将任一上述氨基酸改变为丙氨酸。在另一实施方式中，IgG1 Fc结构域中L234、L235、G237、E318、K320，和K322(按照Kabat进行编号)各自突变为丙氨酸(即，分别是L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A)。
在一个实施方式中，用于鉴定本发明IL6拮抗剂结合域的IL6xR复合物具有如SEQ ID NO：606所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，提供了含有对IL6xR复合物特异性的结合域的多肽，其中所述IL6xR是sIL6xR且具有如SEQ ID NO：606所示的氨基酸序列。在其它实施方式中，含有对IL6xR复合物特异性的结合域的多肽(1)对IL6xR复合物的亲和力大于或等于对单独IL6或单独IL6Rα的亲和力，或者对单独IL6Rα或IL6xR复合物的亲和力大于对单独IL6的亲和力，(2)与膜gp130竞争结合sIL6xR复合物或增加可溶性gp130与sIL6xR复合物的结合，(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导，或者(4)不抑制除IL6外的gp130家族细胞因子的信号转导，(5)具有特性(1)-(4)的任何组合，或者(6)具有(1)-(4)的所有特性。可用于鉴定本发明结合域或者用作参比复合物来测定任何上述结合特性的其它示范性IL6xR复合物可参见例如，美国专利公开号2007/0172458；2007/0031376；和美国专利7,198,781；5,919,763。
在一些实施方式中，本发明IL6拮抗剂结合域包含对IL6、IL6R或IL6xR复合物(如本文所述)，优选对人IL6、人IL6R或人IL6xR复合物特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。含有这类对IL6、IL6R或IL6xR特异性的VH和VL结构域的结合域的例子分别列于SEQ ID NO：435-496和373-434。在其它实施方式中，提供了对IL6xR特异性的多肽结合域，其中所述结合域包含与分别如SEQ ID NO：373-434和435-496所列的一个或多个轻链可变区(VL)或者一个或多个重链可变区(VH)或二者的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中各CDR具有至多三个氨基酸改变(即，许多改变发生在一个或多个构架区中)。
在其它实施方式中，本发明结合域包含对IL6xR特异性的分别如SEQID NO：435-496和373-434所列的VH和VL结构域，它们与这种VH结构域、VL结构域或二者的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同，其中各CDR含有0、1、2或3个氨基酸改变。例如，本发明的VH结构域、VL结构域或二者的氨基酸序列可以分别与来自含有结合域TRU6-1002的示范性交叉受体分子(参见SEQ ID NO：608)的VH结构域(如氨基酸512-636)、VL结构域(如氨基酸652-759)或二者的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同，其中各CDR具有0、1、2或3处氨基酸改变。
在本文所述的任何这些或其它实施方式中，VL和VH结构域可以任何取向安置，可由本文所述的至多约10个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接VH和VL结构域的接头包含SEQ ID NO：497-604和SEQID NO：1223-1228所列的氨基酸序列，如接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)。
在其它实施方式中，本发明IL6拮抗剂结合域可包含一种或多种互补决定区(″CDR″)，或者多个拷贝的一种或多种这类CDR，这类CDR是由抗-IL6、抗-IL6R或抗-IL6xR复合物scFv或Fab片段，或者由它们的重链或轻链可变区获得、衍生或设计出的。因此，本发明结合域可包含来自IL6或抗-IL6xR的可变区的单个CDR，或者可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明IL6拮抗剂结合域包含VH和VL结构域，其含有构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述VH结构域包含SEQ IDNO：435-496中任一项所列的重链CDR3的氨基酸序列；或(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：373-434中任一项所列的轻链CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，并且VH和VL存在于同一参比序列中。在其它实施方式中，本发明结合域包含对IL6xR复合物特异性的VH和VL结构域，其含有构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述VH结构域包含SEQ ID NO：435-496中任一项所列的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：373-434中任一项所列的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，并且VH和VL氨基酸序列来自同一参比序列。SEQ ID NO：1-186和1187-1192，以及187-372和1193-1198分别提供针对IL6、IL6R或IL6xR复合物的示范性轻链和重链可变区CDR。
SEQ ID NO：373-434和1199-1204提供了IL6拮抗剂轻链可变区的氨基酸序列，而SEQ ID NO：435-496和1205-1210分别提供相应重链可变区的氨基酸序列。
在本文所述的包含对IL6、IL6R或IL6xR特异性的CDR的任何实施方式中，结合域可包含(i)VH结构域，其具有与SEQ ID NO：435-496中任一项所示的VH结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或(ii)VL结构域，其具有与SEQ ID NO：373-434中任一项所示的VL结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或(iii)同时包含(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域；或者同时包含来自同一参比序列的(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域。
在某些实施方式中，本发明结合域可以是免疫球蛋白样结构域，如免疫球蛋白支架。本发明的免疫球蛋白支架包括scFv、Fab、结构域抗体或仅含重链的抗体。在其它实施方式中，提供了抗-IL6或抗-IL6xR抗体(例如，非人如小鼠或大鼠，嵌合，人源化，人)或Fab片段或scFv片段，其具有与分别由SEQ ID NO：435-496和373-434中任一项列出的VH和VL结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且也可具有以下一种或多种特性：(1)对IL6xR复合物的亲和力高于或等于对单独IL6或单独IL6Rα的亲和力，或者对单独IL6Rα或IL6xR复合物的亲和力大于对单独IL6的亲和力；(2)与膜gp130竞争结合sIL6xR复合物或增强可溶性gp130与sIL6xR复合物的结合；(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导；或(4)不抑制除IL6外的gp130家族细胞因子的信号转导。本文所述的任何方法可使用这类抗体、Fab或scFv。在某些实施方式中，本发明提供含有IL6拮抗性结合域(即，可抑制IL6顺式和反式信号转导)的多肽。在其它实施方式中，本发明IL6拮抗剂不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。示范性IL6拮抗剂包括IL6或IL6xR特异性结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)。
或者，本发明结合域可以是除免疫球蛋白以外的支架的一部分。所考虑的其它支架包括A结构域分子、纤连蛋白III结构域、抗脂质运载蛋白，锚蛋白重复工程改造的结合分子、腺连蛋白，库尼茨结构域或蛋白AZ结构域亲和蛋白。
IL10拮抗剂
在某些实施方式中，本发明提供含有IL10拮抗性(即，可抑制IL10信号转导)的结合区或结合域的多肽。示范性IL10拮抗剂包括对IL10或IL10R1特异性的结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)，或IL10R1胞外域。
IL10是共同具有α螺旋结构的细胞因子超家族的成员。虽然没有经验证据，但据提示所有家族成员都具有六个α-螺旋(Fickenscher，H.等，(2002)TrendsImmunol.23：89)。IL10含有四个半胱氨酸，其中只有一个是在家族成员中保守的。由于IL10显示了有助于二聚化的V-形折叠，所以似乎二硫键对该结构并不重要。IL10家族成员的氨基酸相同性从20％(IL-19)到28％(IL-20)(Dumouter等，2002，Eur.Cytokine Netw.13：5)。
IL10最初被认为是小鼠中能抑制Th1细胞产生IFN-α和GM-CSF细胞因子的Th2细胞因子(Moore等，2001，Annu.Rev.Immunol.19：683；Fiorentino等，1989，J.Exp.Med.170：2081)。
人IL10长178个氨基酸，其中包含18个氨基酸的信号序列和160个氨基酸的成熟区段，分子量约为18kDa(单体)。人IL10不含潜在的N连接糖基化位点，并且不发生糖基化(Dumouter等，(2002)Eur.Cytokine Netw.13：5；Vieira等(1991)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 88：1172)。它含有四个半胱氨酸残基，形成两个链内二硫键。人IL10中α-螺旋A至F的长度分别是21、8、19、20、12和23个氨基酸。一个单体的螺旋A-D与第二单体的螺旋E和F发生非共价相互作用，形成非共价的V-形同源二聚体。已对IL10分子上的功能性区域作图。在N-末端，前螺旋A残基编号1-9参与肥大细胞增殖，而在C-末端，螺旋F残基编号152-160介导白细胞分泌和趋化性。
已知表达IL10的细胞包括CD8+T细胞、小胶质细胞、CD14+(但不是CD16+)单核细胞、Th2CD4+细胞(小鼠)、角质形成细胞、肝星状细胞、Th1和Th2CD4+T细胞(人)、黑色素瘤细胞、活化的巨噬细胞、NK细胞、树突细胞、B细胞(CD5+和CD19+)和嗜曙红细胞。
现在认为，最初观察到IL10对T细胞IFN-γ生产的抑制是辅助细胞介导的间接作用。然而，其它对T细胞的作用包括：IL10诱导的CD8+T细胞趋化性、抑制CD4+T细胞向IL-8的趋化性、抑制激活后的IL-2生产、通过Bc1-2上调抑制T细胞凋亡和伴随B7/CD28共同刺激的低抗原暴露后阻断T细胞增殖(Akdis等，2001，Immunology 103：131)。
IL10对B细胞具有若干有相关性、但独特的功能。IL10能与TNF-β和CD40L一起诱导幼稚(IgD+)B细胞产生IgA。相信TGF-β/CD40L能促进类型转换，而IL10能启动分化和生长。不存在TGF-β时，IL10与CD40L合作诱导IgG1和IgG3(人)，因而可能是IgG亚型的直接转换因子。IL10对IL-4诱导的IgE分泌的作用有分歧。如果IL-4诱导类型转换时存在IL10，那么它能逆转这种作用；如果在IgE定型后存在IL10，它会增加IgE的分泌。IL10存在下CD27/CD70的相互作用会促进由记忆B细胞形成浆细胞(Agematsu等，1998，Blood 91：173)。
肥大细胞和NK细胞也受IL10的影响。IL10能诱导肥大细胞释放组胺，并阻断其释放GM-CSF和TNF-α。这种作用可以是自分泌作用，因为已知大鼠的肥大细胞能释放IL10。作为其多效性的证据，IL10对NK细胞具有相反的作用。IL10实际上能促进NK细胞生产TNF-α和GM-CSF，而非阻断该功能。此外，它能增强IL-2诱导的NK细胞增殖且有助于IL-18引发的NK细胞分泌IFN-γ。与IL-12和/或IL-18一致的是，IL10能增强NK细胞的细胞毒性(Cai等，1999，Eur.J.Immunol.29：2658)。
IL10对嗜中性粒细胞有显著的抗炎作用。它能抑制趋化因子MIP-1α、MIP-1β和IL-8的分泌，并阻断促炎介导物IL-1β和TNF-α的产生。此外，它能降低嗜中性粒细胞产生超氧化物的能力，因而会干扰PMN-介导的抗体依赖性细胞毒性。IL10也阻断IL-8和fMLP-诱导的趋化性，很可能是通过CXCR1发挥这种作用(Vicioso等，1998Eur.Cytokine Netw.9：247)。
IL10通常对树突细胞(DC)具有免疫抑制作用。它似乎能以DC为代价促进CD14+巨噬细胞分化。巨噬细胞虽然是吞噬细胞，但抗原递呈能力较差。IL10似乎能降低DC刺激T细胞，特别是Th1型细胞的能力。尚不明确IL10如何实现此种功能，因为文献中的数据互相矛盾。相对于MHC-II表达，它可能会下调、不变或上调(Sharma等，1999，J.Immunol.163：5020)。至于B7-1/CD80，IL10能上调或下调其表达。B7-2/CD86在T细胞活化中起到核心作用。就此分子而言，IL10参与它的上调和下调。然而，最显著的调节作用也许出现在CD40上(IL10似乎降低其表达)。在区域水平，IL10可通过响应于促炎细胞因子抑制朗格汗斯细胞迁移而阻断免疫刺激。或者，IL10阻断炎症诱导的DC成熟步骤，通常包括CCR1、CCR2和CCR5下调以及CCR7上调。这种阻断作用以及CCR1、CCR2和CCR5的保持导致DC无法迁移到区域性淋巴结。结果是产生不会刺激T细胞但会结合(和清除)促炎趋化因子而不是对其产生反应的不移动的DC(D-Amico等，2000，Nat.Immunol.1：387)。
已报道，IL10对单核细胞有许多作用。例如，IL10似乎能明显降低细胞表面MHC-II的表达。在刺激后，它也抑制IL-12产生。虽然它能与M-CSF联合促进单核细胞向巨噬细胞转变，但巨噬细胞的表型不明显(即CD16+/细胞毒性与CD16-)。IL10也能降低单核细胞的GM-CSF分泌量和IL-8产量，还能提高IL-1ra的释放(Gesser等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：14620)。透明质粘连蛋白是结缔组织的组分，已知它由单核细胞响应于IL10分泌。这可能对细胞迁移，特别是肿瘤细胞转移有重要影响，已知透明质粘连蛋白能破坏细胞通过胞外空间的迁移(Gesser等，1997)。
人IL10R1是90-110kDa的、I型单次跨膜糖蛋白，其表达于有限数量的细胞类型上(Liu等，1994，J.Immunol.152：1821)。在胰脏、骨骼肌、脑、心和肾中观察到弱表达。胎盘、肺和肝脏中出现中等水平的表达，而单核细胞、B细胞、大颗粒淋巴细胞和T细胞中高水平表达(Liu等，1994)。表达的蛋白是578个氨基酸的蛋白，它含有21个氨基酸的信号肽、215个氨基酸的胞外区、25个氨基酸的跨膜区和317个氨基酸的胞质域。在胞外区内有两个FNIII基序，胞质域中有STAT3停靠位点和JAK1结合区(Kotenko等，2000Oncogene 19：2557；Kotenko等，1997，EMBO J.16：5894)。IL10R1结合人IL10的Kd约200pM。
在一些实施方式中，本发明结合域包含对IL10或IL10R1特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。含有这类对IL10特异性的VH和VL结构域的结合域的例子包括但不限于，美国专利申请公开号US2007/0178097A1所述的那些。本发明结合域还可以，或者另外可包含SEQID NO：745所示的IL10R1胞外域，或其片段。在其它实施方式中，提供了对IL10特异性的多肽结合域，其中所述结合域包含与SEQ ID NO：745的氨基酸序列或SEQ ID NO：745的氨基酸22-401至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，所述多肽结合域结合IL10并抑制其活性。
GITR激动剂
在某些实施方式中，本发明提供含有GITR激动性(即，可提高GITR信号转导)的结合区或结合域的多肽。示范性GITR激动剂包括对GITR或GITRL特异性的结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)，或GITRL胞外域。
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR；也称为AITR)是I型跨膜蛋白质和TNF受体超家族的成员(Nocentini等，(2007)Eur.J.Immunol.37：1165-9)。该胞质域与4-1BB和CD27的胞质域有同源性。GITR在外周血T细胞、骨髓、甲状腺、脾脏和淋巴结中表达，并且在CD4+CD25+调节性T细胞中组成性表达(Kwon等，(2003)Exp.Mol.Med.35：13)。此外，它在天然杀伤(NK)细胞中低水平组成性表达，它在用Toll-样受体配体或IL-15刺激后诱导(Liu等，(2008)J.Biol.Chem.283：8202)。
T细胞激活后GITR表达水平提高。激活GITR会同时激活效应物T淋巴细胞，并调节调节性T细胞活性。GITR与其配体GITRL的结合显示赋予CD4+CD25-效应物T细胞耐受CD4+CD25+调节性T细胞的抑制作用。
GITR配体(GITRL)是II型膜蛋白。它的长度为173个氨基酸，预计分子量为20kDa。25-28kDa的实验分子量表明发生了糖基化。GITRL在抗原递呈细胞(APC)中表达，并在人脐静脉内皮细胞中组成性表达(Nocentini等，同上)。然而，它不在静息或经刺激的T细胞、B细胞系或外周血单核的细胞中表达。
GITR/GITRL系统能提高对肿瘤和病毒感染的耐受(Nocentini等，同上)。具体说，抗-GITR单克隆抗体DTA-1能抑制调节性T细胞-依赖性抑制或增强T细胞应答。在小鼠中给予DTA-1能诱导B16黑色素瘤发生肿瘤排斥。GITR也参与自身免疫/炎性过程，并调节白细胞外渗。GITR-/-小鼠对炎性疾病病症的敏感性降低，表明GITR在炎症中的积极作用。
在一些实施方式中，本发明结合域包含对GITR或GITRL特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。含有这类GITR特异性的VH和VL结构域的结合域的例子包括但不限于，美国专利申请公开号US2007/0098719A1所述的那些。本发明结合域还可以，或者另外可包含GITRL胞外域(如Genbank登录号NP_005083.2(SEQ ID NO：746)的氨基酸74-181)或其片段。在其它实施方式中，提供了GITR特异性多肽结合域，其中所述结合域包含与SEQ ID NO：746的氨基酸74-181至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中所述多肽结合域结合于GITR并提高其活性。
VEGF拮抗剂
在某些实施方式中，本发明提供含有VEGF拮抗性(即，可抑制VEGF信号转导)的结合区或结合域的多肽。示范性VEGF拮抗剂包括VEGF或VEGFR2特异性的结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)，或VEGFR2胞外域。
血管内皮生长因子(VEGF或VEGF-A)是进化上保守的同源二聚糖蛋白和强效的内皮细胞特异性促分裂源，它在血管新生和血管生成中起到重要作用(Lee等(2007)PLOS Medicine 6：1101-1116)。VEGF诱导对血管新生至关重要的各种胞内信号转导和生理应答，如胞内Ca2+内流，趋化作用(迁移)，纤溶酶原激活物、尿激酶受体和胶原酶的表达，以及血管通透性。其生物学作用由主要在内皮细胞中表达的两种高亲和受体酪氨酸激酶，即VEGF受体1(VEGFR1)和2(VEGFR2)诱发。
VEGFA是分泌型蛋白质，它是通过二硫键连接的同源二聚体。它也与PlGF形成异源二聚体。VEGF mRNA的另路剪接产生各种同种型，包括人中的VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206；以及小鼠中的VEGF120、VEGF164和VEGF188。对只表达一种VEGF同种型的遗传工程改造小鼠的研究表明，VEGF同种型在血管发育和功能中具有独特但有些重叠的作用，正如这些小鼠中组织特异性血管缺陷所表明的那样。VEGF同种型的生物化学性质有差异，包括VEGF165和VEGF188与神经毡蛋白和硫酸乙酰肝素发生受体结合，而VEGF120不与它们结合。与硫酸乙酰肝素的不同亲和力在它们与VEGFR1和VEGF2的结合中至关重要，因为硫酸乙酰肝素可介导这些受体的结合和反式激活。而且，据报道与硫酸乙酰肝素的不同结合会导致不同的VEGF作用，包括内皮细胞存活、粘附和血管分支形成。VEGF164和VEGF188都能结合硫酸乙酰肝素，分别使它们部分或完全与细胞结合，而VEGF120不结合硫酸乙酰肝素，并且是自由扩散的。
VEGF同种型显示出组织特异性表达模式。VEGF189、VEGF-165和VEGF-121同种型广泛表达，而VEGF206和VEGF-145则少有表达。其表达受生长因子、细胞因子、促性腺素、氮氧化物、低氧、低血糖和致瘤性突变的调节。
VEGF在肿瘤进展中的经典作用是作为血管新生(从现有血管形成新毛细血管的过程)的正调节物。肿瘤生长高度依赖肿瘤诱导其自身血管化的能力。已报道在多种癌细胞系和衍生自乳腺、脑和卵巢癌的若干临床样品中发现VEGF的表达。因此，拮抗VEGF可通过形成不完整的血管有效预防肿瘤生长。VEGF被其它细胞如肿瘤细胞释放后以旁分泌模式对内皮细胞起作用，或者在产生VEGF的内皮细胞中以自分泌方式起作用。VEGF结合其关联受体VEGFR1(也称为FLT1)、VEGFR2(也称为KDR或FLK1)和神经毡蛋白1(NRP1)。
在成人中VEGF的表达是细胞类型特异性的，在从转录到翻译的许多水平上受控制，并且在肿瘤和多种疾病状态中上调。刺激VEGF转录的一种经良好鉴定的方式是低氧，它通过稳定低氧诱导因子-1α(HIF1α)转录因子起作用。在转录后，VEGF的低氧调节通过mRNA稳定进行。VEGF的表达由其它生长因子和细胞因子诱导，包括IGF-1、Il-6、Il-1、PDGF、TNF-αt、TGF-β和FGF-4。此外，VEGF表达也受物理力，包括拉伸的刺激，一种推定转录因子是Kruppel样因子-2。对VEGF启动子的分析揭示出许多其它可能的转录因子效应元件，已揭示这些效应元件的若干途径，例如通过SP1效应元件的EGF和HGF信号转导。
VEGF家族成员能促进两种非常重要的体内过程，即血管新生和淋巴管新生，其分别包括由现有脉管长出新的血管和淋巴管。这些过程控制正常的伤口愈合过程、卵泡发育、子宫内膜生长以及诸如视网膜病、类风湿性关节炎和实体瘤生长等病理过程。推测一种新鉴定的VEGF剪接变体，即VEGF165b具有血管新生抑制作用。淋巴管新生与淋巴结转移和癌症通过淋巴系统散播相关。
VEGF活性由主要在内皮细胞中表达的高亲和受体酪氨酸激酶介导。它们是：主要由血管内皮细胞表达的VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，和淋巴内皮细胞表达的VEGFR-3(Flt-4)。这些受体的特征是结合生长因子的七个胞外免疫球蛋白样结构域，后接间插有激酶惰性序列的单次跨膜区和保守性胞内酪氨酸激酶结构域。这些受体本身是酶，一旦通过配体结合激活，它们就发生二聚化和自身磷酸化。这一步骤能提高受体通过在特定酪氨酸残基上进行磷酸化而直接激活其它靶蛋白的能力。
VEGF-激酶配体/受体信号转导系统在血管发育和血管通透性的调节中起到核心作用。在HIV-1感染的情况下，与胞外病毒Tat蛋白的相互作用似乎能增强卡波济氏肉瘤病损中的血管新生。
虽然VEGF能结合VEGFR1、VEGFR2、Nrp-1和Nrp-2，但其在内皮中的主要信号转导受体是VEGFR2。VEGFR2属于受体酪氨酸激酶家族，VEGF结合后，酪氨酸激酶发生二聚化和激活，导致胞质尾上的特定酪氨酸残基发生磷酸化，进而促进信号转导分子的停靠。VEGFR2负责启动内皮细胞内的信号转导通路。VEGF与VEGFR2结合后，VEGF在内皮细胞内介导其对增殖、存活、粘附、迁移、毛细管形态发生和基因表达的作用。与VEGFR2相比，VEGFR1在VEGF介导的信号转导中的作用较小，因为它的激酶活性比VEGFR2低10倍。乳腺癌细胞系表达VEGF以及VEGF受体VEGFR1、VEGFR2和NRP1。近期研究显示，VEGF用作表达VEGF受体的肿瘤细胞的自分泌生长和存活因子。然而，VEGF介导肿瘤细胞存活的机理尚待深入研究(Lee等，2007，PLOSMedicine 6：1101-1116)。
虽然内皮细胞(EC)也表达VEGFR1，但相信它主要用于调节VEGFR2信号转导。内皮细胞的有丝分裂发生、趋化性、细胞存活和形态改变主要由VEGFR-2介导。有丝分裂发生信号是通过激活Raf-Mek-Erk通路诱导的，而抗凋亡作用和趋化性则是通过激活PI3K/Akt介导的。VEGF与VEGFR-2结合也导致以PI3K/Akt依赖方式激活若干整联蛋白，它们是参与血管新生的粘着分子。除在内皮细胞中表达外，还在造血干细胞和视网膜祖细胞中发现VEGFR-2，它在造血干细胞中能提高细胞存活，在视网膜祖细胞中能对神经发生和血管生成起到重要作用。
在一些实施方式中，本发明结合域包含对VEGF或VEGFR2特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。含有这类VEGF特异性的VH和VL结构域的结合域的例子包括但不限于，美国专利申请公开号US2007/0141065A1所述的那些。本发明结合域还可以，或者另外可包含VEGFR2胞外域(参见GenBank登录号NP_002244.1，SEQ ID NO：747)，或其片段。在其它实施方式中，提供了VEGF特异性的多肽结合域，其中所述结合域包含与SEQ ID NO：747的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中所述多肽结合域结合于VEGF并抑制其活性。
TNFα拮抗剂
在某些实施方式中，本发明提供含有TNFα拮抗性(即，可抑制TNFα信号转导)的结合区或结合域的多肽。示范性TNFα拮抗剂包括对TNFα特异性的结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)，或者TNFR1或TNFR2胞外域。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)是肿瘤坏死因子受体超家族成员，并且是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的受体，也称为CD120或恶病质素。此种细胞因子受体有两种变体，即TNFR1和TNFR2(是CD120a受体和CD120b受体)。TNFR1(Genbank登录号NP_001056.1)的分子量约为55KD，因此有时称为p55。可用作本发明融合蛋白中的TNFα结合域的TNFR结构域位于TNFR1序列的氨基酸44-149处。TNFR2(Genbank登录号NP_001057.1)的分子量约为75KD，因此有时称为p75。可用作本发明融合蛋白中的TNFα结合域的TNFR结构域位于TNFR2序列的氨基酸40-141处。
大多数细胞类型和组织似乎都表达这两种TNF受体。尽管它们都以可溶形式存在于细胞表面并且都在信号转导中有活性，但它们能够介导不同的细胞应答。TNFR1似乎负责转导大部分TNF应答。TNFR2具有刺激胸腺细胞增殖、激活NF-Kβ、在主要由TNFR1介导的应答如细胞毒性的信号转导中辅助TNFR1等其它活性。
TNF拮抗剂，例如抗TNF抗体可能对各种炎性病症产生有利的影响。例如，在美国英利昔单抗适用于治疗类风湿性关节炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、斑块状银屑病和溃疡性结肠炎。近年来，髓周递送TNFα抑制剂依那西普能减轻阿尔茨海默病患者的症状(Tobinick和Gross(2008)BMC Neurol.8：27-36；Griffin(2008)J.Neuroinflammation，5：3-6)。
根据(英利昔单抗)处方信息，归因于TNF的生物活性包括：诱导促炎细胞因子如白细胞介素(IL)1和6，通过提高内皮层渗透性以及内皮细胞和白细胞的粘着分子表达增强白细胞迁移，激活嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的功能性活动，诱导急性期反应物和其它肝蛋白，以及滑膜细胞和/或软骨细胞产生的组织降解酶。
在一些实施方式中，本发明结合域包含对TNFα特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，所述VH和VL结构域是人结构域。含有这类TNFα特异性的VH和VL结构域的结合域的例子包括但不限于，美国专利申请公开号US 2007/0249813所述的那些。本发明结合域还可以，或者另外可包含TNFR1胞外域(参见GenBank登录号NP_001056.1，SEQ ID NO：749)或其片段，或者TNFR2胞外域(参见GenBank登录号NP_001057.1，SEQ IDNO：748)或其片段。TNFR1和TNFR2胞外域可参见美国专利申请公开号US 2007/0128177。在其它实施方式中，提供了TNFα特异性的多肽结合域，其中所述结合域包含与SEQ ID NO：748或749的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中所述多肽结合域结合于TNFα并抑制其活性。
HGF拮抗剂
如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有HGF拮抗性(即，可抑制HGF信号转导)结合区或结合域的多肽。示范性HGF拮抗剂包括HGF的特异性结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)，或c-Met胞外域或其亚结构域(如Sema结构域、PSI结构域或c-Met的两个结构域)。
胚胎发生和组织修复的正常过程中，酪氨酸激酶受体c-Met(也称为肝细胞生长因子受体HGFR，因为肝细胞生长因子(HGF)是其配体之一)有活性。在这两个过程中，细胞与邻近细胞分离开并进入血流。在血流中，c-Met诱导的凋亡保护作用和以锚定依赖方式生长的能力使该细胞存活，直到从脉管中溢出、增殖并最终分化。在组织修复中，与损伤部位相邻的上皮细胞脱离、改变形状并向受损区域迁移，进而增殖和重建上皮层时，c-Met参与上皮-间充质转化过程。
然而，c-Met组成性激活时，表达它的细胞变为致瘤性和转移性细胞。已证明，c-Met组成性激活可通过多种机制发生。最常见的机理是受体过表达，这是由c-Met基因扩增(例如，在结直肠肿瘤中)、其它癌基因诱导c-Met转录增强或低氧激活转录引起的。另一机制包括c-Met基因结构改变，包括点突变(例如，在遗传性乳头状肾癌、儿童期肝细胞癌、偶发性乳头状肾癌、胃癌和头颈部鳞状细胞癌)和染色体易位。另一机制包括c-Met结构改变，例如翻译后加工异常、不切割前体蛋白、防止受体下调的突变和受体截短(例如，骨骼肌肿瘤中)。另一机制是HGF依赖性自分泌/旁分泌激活。在间充质细胞异常产生HGF时，旁分泌激活可致病。肿瘤细胞异常表达c-Met和HGF时发生自分泌激活(例如，骨肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质瘤、甲状腺癌、乳腺癌和肺癌中)。最后，c-Met组成性激活也可能是其它膜受体(如RON、EGF-受体家族成员、FAS和B丛蛋白)的反式激活作用所致。参见Corso等，TRENDS Mol.Med.11：284(2005)。
靶向c-Met信号传导途径的抗癌方案也参见Corso等，同上。它们包括拮抗或中和HGF、抑制c-Met激酶活性、防止c-Met二聚化、抑制c-Met胞内活性和沉默c-Met或Hgf表达。Michielli等，Cancer Cell，6：61-73(2004)记载了一种可溶性c-Met受体，称为“陷阱Met”，它干扰HGF与c-Met的结合和c-Met同源二聚化。据报道，在小鼠中通过慢病毒载体递送陷阱Met能抑制人异种移植瘤中的肿瘤细胞增殖和存活。观察到陷阱Met能损害肿瘤的血管新生、抑制自发性转移灶的形成并与放疗协同诱导肿瘤消退。
在一些实施方式中，本发明结合域包含对HGF特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。含有这类HGF特异性的VH和VL结构域的结合域的例子包括但不限于，美国专利申请公开号US 2005/0118643所述的那些。本发明结合域还可以，或者另外可包含SEQ ID NO：750、751或752所示的cMet胞外域或其片段。在其它实施方式中，提供了HGF特异性的多肽结合域，其中所述结合域包含与SEQ ID NO：750、751或752的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中所述多肽结合域结合于HGF并抑制其活性。
在一些实施方式中，本发明结合域是包含本文所述的VH和VL结构域的c-Met拮抗剂结构域。在某些实施方式中，所述VH和VL结构域是人结构域。含有这类VH和VL结构域的结合域的例子分别列于SEQ ID NO：1132-1184和1079-1131。在其它实施方式中，提供的本发明c-Met拮抗剂结构域的序列与SEQ ID NO：1079-1131和1132-1184分别所列的一种或多种轻链可变区(VL)或一种或多种重链可变区(VH)或二者的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同，其中各CDR至多有三个氨基酸改变。
在其它实施方式中，本发明c-Met拮抗剂结构域包含分别如SEQ ID NO：1132-1184和1079-1131所列的VH和VL结构域，它们与这种VH结构域、VL结构域或二者的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同，其中各CDR含有不多于0、1、2或3个突变。例如，本发明VH结构域、VL结构域或二者的氨基酸序列可分别与示范性结合域TRU(H)-343的VH结构域(SEQ ID NO：1174)、VL结构域(SEQ IDNO：1121)或二者的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。
本发明结合域可包含来自抗-HGF或抗-c-Met的可变区的单个CDR，或者可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明结合域包含对HGF或c-Met特异性的VH和VL结构域，其含有构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述VH结构域包含SEQ ID NO：1132-1184中任一项所列的重链CDR3的氨基酸序列；或(b)所述VL结构域包含SEQ IDNO：1079-1131中任一项所列的轻链CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，并且VH和VL存在于同一参比序列中。在其它实施方式中，本发明结合域包含对HGF或c-Met特异性的VH和VL结构域，其含有构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述VH结构域包含SEQ ID NO：1132-1184中任一项所列的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：1079-1131中任一项所列的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列，并且VH和VL氨基酸序列来自同一参比序列。
在本文所述的包含特异性CDR的任何实施方式中，结合域可包含(i)VH结构域，其具有与SEQ ID NO：1132-1184中任一项所示的VH结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或(ii)VL结构域，其具有与SEQ ID NO：1079-1131中任一项所示的VL结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；或(iii)同时包含(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域；或者同时包含来自同一参比序列的(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域。SEQ ID NO：762-920和921-1078分别提供针对c-Met的示范性轻链和重链可变区CDR。
SEQ ID NO：1079-1131和1132-1184分别提供c-Met拮抗剂轻链和重链可变区的氨基酸序列。
TWEAK拮抗剂
在某些实施方式中，本发明提供含有TWEAK拮抗性(即，可抑制TWEAKR信号转导)的结合区或结合域的多肽。示范性TWEAK拮抗剂包括对TWEAK特异性的结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)，或者TWEAKR胞外域或其片段。
TWEAK是属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的细胞因子，它调节多种细胞反应，包括促炎活性、血管新生和细胞增殖。TWEAK是II型跨膜蛋白，切割后产生具有生物学活性的可溶性细胞因子。TWEAK蛋白内各个结构域的位置参见例如，已公开的美国专利申请2007/0280940。TWEAK与TNF的信号传导功能有重叠，但TWEAK的组织分布更广泛。TWEAK可通过多种细胞死亡通路以细胞类型特异性方式诱导凋亡，也发现它能促进内皮细胞的增殖和迁移，因此可用作血管新生调节物。
关联TWEAK受体、TWEAKR或成纤维细胞生长因子诱导蛋白14(Fn14)是非淋巴细胞类型表达的TNF受体超家族成员(Wiley等(2001)Immunity15：837)。TWEAK和TWEAKR在正常组织中的表达相对较低，但在组织损伤和疾病状态中显著上调。TWEAK/R通路有助于急性组织修复功能，因此在急性损伤后发挥生理功能，但在慢性炎性疾病状态中产生致病作用。与TNF相反，TWEAK在发育或内稳态中没有显著作用。关于TWEAK/R通路的综述可参见Burkly等(2007)Cytokine 40：1。持续激活的TWEAK会促进慢性炎症、病理性增生和血管新生，并且可能通过抑制祖细胞分化阻碍组织修复。已经在活化的单核细胞和T细胞表面上及肿瘤细胞系上，以及在静息和活化的单核细胞、树突细胞和NK细胞内鉴定到TWEAK蛋白。在急性损伤、炎性疾病和癌症中，TWEAK表达在靶组织中局部显著提高，这类疾病均与炎性细胞的浸润和/或存留性先天免疫细胞类型的激活相关。已证明，在慢性炎性疾病如多发性硬化症和系统性红斑狼疮患者中，循环中的TWEAK水平显著提高。
已证明，阻断TWEAK的单克隆抗体在小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中有效(Kamata等(2006)J.Immunol.177：6433；Perper等(2006)J.Immunol.177：2610)。TWEAK和TNF对人滑膜细胞的关节炎发生活性常常是叠加或协同的，并且似乎相互独立，表明TWEAK和TNF在类风湿性关节炎病理中可能是平行作用。据推测，RA患者对TNF抑制剂的临床反应的多变性可能反映TWEAK的病理学贡献。
美国专利7,169,387记载了TWEAK的特异性单克隆抗体的制备和它在小鼠慢性GVHD模型中阻断移植物抗宿主病(GVHD)产生方面的应用。美国专利申请公开号2007/0280940记载了TWEAKR陷阱受体以及TWEAKR和TWEAK的抗体，还有它们在治疗与脑水肿和细胞死亡有关的中枢神经系统疾病中的应用。
在一些实施方式中，本发明结合域包含对TWEAK特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。含有这类TWEAK特异性的VH和VL结构域的结合域的例子包括(例如)美国专利7,169,387所述的那些。已证明，阻断TWEAK的单克隆抗体在胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)模型中有效(Kamata等(2006)J.Immunol.177：6433；Perper等(2006)J.Immunol.177：2610)。
在某些实施方式中，TWEAK拮抗剂可以是TWEAKR的胞外结构域(“胞外域”)(也称为FN14)。本文所用的TWEAKR胞外域指TWEAKR的细胞外部分、可溶性TWEAKR或其任何组合。在某些实施方式中，TWEAK拮抗剂包含TWEAKR的氨基末端部分，如GenBank登录号NP_057723.1所列TWEAKR的前70个氨基酸(SEQ ID NO：761)，或仍能用作TWEAK拮抗剂的它的任何片段。在其它实施方式中，TWEAK拮抗剂包含SEQ IDNO：761的氨基酸28-70(即不含天然先导序列)。在其它实施方式中，TWEAK拮抗剂包含与SEQ ID NO：761的氨基酸序列或SEQ ID NO：761的氨基酸28-70至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中所述拮抗剂结合TWEAK并抑制其活性。
可利用本领域技术人员已知试验测定本文所述结合蛋白或融合蛋白降低TWEAK与TWEAKR结合的能力，包括美国专利申请公开号2007/0280940所述的那些试验。
IGF拮抗剂
如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有IGF1或IGF2拮抗性(即，可抑制IGF1或IGF2信号转导)结合区或结合域的多肽。示范性IGF1或IGF2拮抗剂包括对IGF1或IGF2特异性的结合域，如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)，或者IGF1R或IGFBP胞外域或其亚结构域。
胰岛素样生长因子(IGF)包括在哺乳动物生长和发育中起重要作用的一类肽。胰岛素样生长因子1(IGF1)是分泌型蛋白质，其具有以下特征：二硫键(氨基酸54-96、66-109、95-100)；D肽结构域(氨基酸111-118)；羧基端前肽结构域(E肽)(氨基酸119-153)；胰岛素链A样结构域(氨基酸90-110)；胰岛素链B样结构域(氨基酸49-77)；胰岛素连接C肽样结构域(氨基酸78-89)；前肽结构域(氨基酸22-48)；和信号序列结构域(氨基酸1-21)。
IGF1在多种组织，包括肝脏、骨骼肌、骨和软骨中合成。IGF1的血液浓度变化反映了它在肝脏中的合成和分泌的变化，在实验动物中肝脏合成和分泌的IGF1占总血清IGF1的80％。其余IGF1在外周合成，通常由结缔组织细胞类型，如大部分组织中存在的基质细胞合成。外周合成的IGF1可通过自分泌和旁分泌机制起到调节细胞生长的作用。在这些组织中，新合成和分泌的IGF1可结合结缔组织细胞上本身存在的受体并刺激生长(自分泌)，或者可结合不实际合成IGF1但局部分泌的IGF1会刺激其生长的相邻细胞类型(常常是上皮细胞类型)上的受体(旁分泌)(Clemmons，2007，Nat Rev Drug Discov.6(10)：821-33)。IGF1合成受若干因素的控制，包括人垂体生长激素(GH，也称为生长激素)。在胎儿生长期间IGF2浓度较高，但在成年阶段与IGF1相比对GH的依赖性较低。
在各种组织，包括骨骼肌系统、肝、肾、肠、神经系统组织、心和肺中，IGF1能促进细胞的生长和/或存活。IGF1也在促进细胞生长方面具有重要作用，因此尝试将抑制IGF1作为治疗动脉粥样硬化的潜在辅助手段。提出将抑制IGF1作用作为加强其它抗癌治疗形式疗效或直接抑制肿瘤细胞生长的具体治疗。
类似于IGF1，IGF2通过IGF1R发挥作用。由于促有丝分裂和抗凋亡功能，IGF2是肿瘤中重要的自分泌生长因子(Kaneda等，2005，Cancer Res 65(24)：11236-11240)。在各种恶性肿瘤，包括结直肠癌、肝癌、食道癌、肾上腺皮质癌以及肉瘤中常常发现IGF2表达升高。通过IGF2进行的旁分泌信号传导也在包括乳腺癌在内的肿瘤中起作用，因为在恶性乳腺上皮细胞周围的基质成纤维细胞中发现IGF2表达丰富。
胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)是通过二硫键连接的两条α链和两条β链的四聚体。切割前体产生α和β亚基。IGF1R与蛋白激酶超家族、酪氨酸蛋白激酶家族和胰岛素受体亚家族有关。它含有三个纤连蛋白III型结构域和一个蛋白激酶结构域(Lawrence等，2007，Current Opinion in Structural Biology17：699-705)。α链帮助形成配体-结合域，而β链携带激酶结构域。它是一次跨膜的I型膜蛋白，在各种组织中表达。
激酶结构域具有酪氨酸-蛋白激酶活性，这是激活IGF1-或IGF2-刺激的下游信号传导级联反应所必需的。自身磷酸化能激活激酶活性。IGF1R在体外与PIK3R1，以及IRS1和SHC1的PTB/PID结构域相互作用，此时在β亚基的胞质结构域中的酪氨酸残基上发生自身磷酸化。IGF1R在转化事件中起到至关重要的作用。它在大多数恶性组织中高度过表达，并通过提高细胞存活起抗凋亡剂的作用。除v-Src以外，不含该受体的细胞无法被大多数癌基因转化。
胰岛素样生长因子-结合蛋白(IGFBP)家族包括六种约含250个残基的可溶性蛋白质(IGFBP1-6)，其结合IGF的亲和力为纳摩尔级。由于其序列同源性，推测这些IGFBP共享共同的总体折叠，并且预计它们具有紧密相关的IGF结合决定簇。各IGFBP可分成长度大约相同的三个独特结构域：即高度保守的富含半胱氨酸的N和C结构域，以及各IGFBP独有的中心接头结构域。N和C结构域参与结合IGF，但尚未明确确定这些结构域各自在IGF结合中的具体作用。C-末端结构域可能负责IGFBP相对于一种IGF对另一种IGF的优选；C-末端结构域也通过与胞外基质组件相互作用参与调节IGF-结合亲和力，最可能致力于介导不依赖IGF1的作用。中心接头结构域是保守性最低的区域，且从未被引用为任何IGFBP的IGF-结合位点的一部分。该结构域是已知IGFBP的翻译后修饰、特异性蛋白水解以及酸不稳定性亚基和胞外基质结合的位点。相信在该结构域发生的蛋白水解切割能产生较低亲和力的不与IGF受体竞争IGF的N-和C-末端片段，因此，认为所述蛋白水解是IGFBP释放IGF的主要机制。然而，近期研究表明，所得的N-和C-末端片段仍可抑制IGF活性并具有不同于完整蛋白质的功能特性(Sitar等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103(35)：13028-33)。
IGF结合蛋白是延长IGF半衰期并被证明能抑制或刺激IGF对细胞培养物的生长促进作用的分泌型蛋白质。它们改变了IGF与其细胞表面受体的相互作用，也促进了细胞的迁移。它们与IGF1和IGF2同等良好地结合。.所有IGFBP的C末端结构域均显示与甲状腺球蛋白1型结构域的序列同源性，并且共享以下共同二级结构元件：α-螺旋和3至4条β链的β-片层。该分子的核心通过共有的三个二硫键配对连接，并具有保守的Tyr/Phe氨基酸和QC、CWCV基序。CBP1、CBP4和CBP-6中保留了这些必要特征，C结构域的结构已被解析，但细节方面有显著差异。例如，CBP4具有α2螺旋，而CBP1中的相应残基形成可在甲状腺球蛋白1型结构域超家族的其它结构中观察到的短β-链。CBP的这个特定区域具有高序列多样性，并参与IGF复合物形成，因而可发挥亲和力调节物的作用。
抑制IGF/IGF-受体结合会干扰细胞生长，并代表开发IGFBP和变体作为天然IGF拮抗剂用于IGF系统失调引起的许多常见病，包括糖尿病、动脉粥样硬化和癌症中的策略。
在一些实施方式中，本发明结合域包含对IGF1或IGF2特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中，VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。本发明结合域也可以，或者另外包含Genbank登录号NP_000866.1的IGF1R胞外域(SEQ ID NO：753)或其亚结构域，或者Genbank登录号为NP_000587.1(IGFBP1；SEQ ID NO：754)、NP_000588.2(IGFBP2；SEQ ID NO：755)、NP_001013416.1(IGFBP3同种型a；SEQ ID NO：756)、NP_000589.2(IGFBP3同种型b；SEQ ID NO：757)、NP_001543.2(IGFBP4；SEQ ID NO：758)、NP_000590.1(IGFBP5；SEQ IDNO：759)或NP_002169.1(IGFBP6；SEQ ID NO：760)的IGFBP胞外域或其亚结构域。在其它实施方式中，IGF1或IGF2拮抗剂包含与SEQ ID NO：754-760的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％相同的序列，其中所述拮抗剂能抑制IGF1和IGF2中至少一种的活性。
多特异性融合蛋白
本发明提供包含TGFβ拮抗性结构域(“TGFβ拮抗剂结构域”)和除TGFβ配体以外的配体的拮抗性或激动性结构域(“异源结合域”)，如IL6拮抗剂、IL10拮抗剂、GITR激动剂、VEGF拮抗剂、TNF拮抗剂、HGF拮抗剂、TWEAK拮抗剂或IGF拮抗剂的多特异性融合蛋白。考虑到，TGFβ拮抗剂结构域可能是在融合蛋白的氨基末端且异源结合域在融合蛋白的羧基末端，或者异源结合域在氨基末端且TGFβ拮抗剂在羧基末端。如本文所述，本发明结合域可融合于间插结构域(如免疫球蛋白恒定区或其亚区)的任一端。而且，两个或多个结合域各自可通过本领域已知或本文所述的接头连接于间插结构域。
本文所用的“间插结构域”指一种氨基酸序列，其简单地用作一个或多个结合域的支架以使融合蛋白主要(如，50％或更多融合蛋白)或基本(如，90％或更多融合蛋白)以单链多肽形式存在于组合物中。例如，某些间插结构域可具有结构功能(如间隔、柔韧性、刚性)或生物学功能(如血浆，如人血半衰期延长)。可延长本发明融合蛋白的血浆半衰期的示范性间插结构域包括清蛋白、转铁蛋白、结合血清蛋白的支架结构域等，或其片段。
在某些优选实施方式中，本发明多特异性融合蛋白所含的间插结构域是“二聚化结构域”，“二聚化结构域”指能够促进至少两种单链多肽或蛋白质通过非共价或共价相互作用，例如通过形成氢键、静电相互作用、范德华力、二硫键、疏水相互作用等或其任何组合而结合的氨基酸序列。示范性二聚化结构域包括免疫球蛋白重链恒定区或亚区。应理解，二聚化结构域可促进二聚体或更高级多聚体复合物(如三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等)的形成。
“恒定亚区”是本文定义的术语，指对应于或衍生自一个或多个免疫球蛋白恒定区结构域的全部或一部分，但不含有来源抗体中发现的所有恒定区结构域的肽、多肽或蛋白质序列。在优选实施方式中，本发明融合蛋白的恒定区结构域含有IgG、IgA或IgD的CH2结构域和CH3结构域，更优选IgG1CH2和CH3，更优选人IgG1CH2和CH3。在一些实施方式中，本发明融合蛋白的恒定区结构域缺乏或具有很弱的下述效应物功能：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)以及补体活化和补体依赖性细胞毒性(CDC)，同时保持结合某些FC受体(如FCRn结合)的能力并保持较长的体内半衰期。在某些实施方式中，本发明结合域融合于IgG1恒定区或亚区，其中所述IgG1恒定区或亚区中一个或多个以下氨基酸被突变：234位的亮氨酸(L234)、235位的亮氨酸(L235)、237位的甘氨酸(G237)、318位的谷氨酸(E318)、320位的赖氨酸(K320)、322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(按照EU进行编号)。
本领域已知在Fc结构域内或外作出可改变Fc与Fc受体(CD16、CD32、CD64、CD89、FcεR1、FcRn)或补体组分C1q相互作用的突变的方法(参见例如，美国专利5,624,821；Presta(2002)Curr.Pharma.Biotechnol.3：237)。本发明的具体实施方式包括含有恒定区或亚区来自人IgG的免疫球蛋白或融合蛋白的组合物，其中结合FcRn和蛋白A的功能被保留，并且Fc结构域不再与其它Fc受体或C1q相互作用或与它们的相互作用很少。例如，本发明结合域可融合于人IgG1恒定区或亚区，其中297位的天冬酰胺(按照EU编号记作N297)被突变成另一种氨基酸，以便减少或消除此位点的糖基化，因而消除了Fc与FcγR和C1q的有效结合。另一示范性突变是P331S，这一突变消除了C1q结合但不影响Fc结合。
在其它实施方式中，免疫球蛋白Fc区可能相对于免疫球蛋白参比序列改变了糖基化模式。例如，可采用各种遗传技术来改变构成糖基化位点的一个或多个特定氨基酸残基(参见Co等(1993)Mol.Immunol.30：1361；Jacquemon等(2006)J.Thromb.Haemost.4：1047；Schuster等(2005)CancerRes.65：7934；Warnock等(2005)Biotechnol.Bioeng.92：831)。或者，可工程改造产生本发明融合蛋白的宿主细胞，以产生改变的糖基化模式。例如，本领域已知的一种方法提供改变的糖基化模式，具体形式是ADCC提高的平分的非岩藻糖基化变体形式。这种变体由含有寡糖修饰酶的宿主细胞表达而来。或者，也考虑用BioWa/Kyowa Hakko的Potelligent技术来降低本发明糖基化分子的岩藻糖含量。在一种已知方法中，提供了用于产生重组免疫球蛋白的CHO宿主细胞，它能通过产生GDP-岩藻糖改变免疫球蛋白Fc区的糖基化模式。
或者，利用化学技术改变本发明融合蛋白的糖基化模式。例如，各种糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制剂提供提高ADCC活性、提高Fc受体结合和改变糖基化模式中的一种或多种所需特性。在某些实施方式中，在含有糖修饰物的培养基中培养表达本发明多特异性融合蛋白(含有连接于IL6、IL6R、IL6xR、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF拮抗剂或GITR激动剂的TGFβ拮抗剂结构域)的细胞，所述糖修饰物的浓度能提高所述宿主细胞产生的免疫糖蛋白分子的ADCC，并且小于800μM。在优选实施方式中，在含有浓度为100-800μM，如100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM或800μM的澳粟精胺或几夫碱，更优选澳粟精胺的培养基中培养表达这些多特异性融合蛋白的细胞。美国专利申请公开号2009/0041756或PCT公开号WO 2008/052030中提供了用糖修饰物如澳粟精胺改变糖基化的方法。
在另一实施方式中，免疫球蛋白Fc区可具有影响与效应物细胞Fc受体结合的氨基酸修饰。可利用本领域已知的任何技术，例如Presta等(2001)Biochem.Soc.Trans.30：487所述的方法制备这些修饰。在另一种方法中，可使用Xencor XmAb技术工程改造对应于Fc结构域的恒定亚区，以增强细胞杀伤性效应物功能(参见Lazar等(2006)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)103：4005)。例如，可以使用这种方法产生对FCγR的特异性和结合有所改进的恒定亚区，从而提高细胞杀伤性效应物功能。
在其它实施方式中，与缺少这类间插结构域的相应融合蛋白相比，恒定区或亚区可任选地增加血浆半衰期或胎盘转移。在某些实施方式中，本发明融合蛋白在人体内的延长的血浆半衰期是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少12、至少18、至少20、至少24、至少30、至少36、至少40、至少48小时，至少数日，至少一周，至少2周，至少数周，至少一个月，至少两个月，至少数个月，或更长时间。
恒定亚区可包含任意以下结构域的一部分或全部：CH2结构域、CH3结构域(IgA、IgD、IgG、IgE或IgM)和CH4结构域(IgE或IgM)。因此，本文所述的恒定亚区可以指对应于免疫球蛋白恒定区某部分的多肽。恒定亚区可包括衍生自相同或不同的免疫球蛋白、抗体同种型或等位基因变体的CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方式中，CH3结构域被截短，并包含PCT公开号WO 2007/146968中列作SEQ ID NO：366-371的羧基末端序列，通过引用将这些序列纳入本文。在某些实施方式中，本发明多肽的恒定亚区具有CH2结构域和CH3结构域，它们可任选具有氨基末端接头、羧基末端接头或在两端具有接头。
“接头”是结合或连接其它肽或多肽的肽，如约2至150个氨基酸的接头。在本发明融合蛋白中，接头可将间插结构域(如免疫球蛋白衍生的恒定亚区)连接于结合域，或者接头可连接结合域的两个可变区。例如，接头可以是由抗体绞链区序列获得、产生或设计出的氨基酸序列，将结合域连接于受体的序列，或者是将结合域连接于细胞表面跨膜区或膜锚定物的序列。在一些实施方式中，接头可具有至少一个能够在生理条件或其它标准肽条件(如，肽纯化条件、肽储存条件)下参与至少一个二硫键的半胱氨酸。在某些实施方式中，对应于或类似于免疫球蛋白铰链肽的接头保留了对应于朝向该铰链氨基端设置的铰链半胱氨酸的半胱氨酸。在其它实施方式中，接头来自IgG1或IgG2A铰链，并含有对应于铰链半胱氨酸的一个半胱氨酸或两个半胱氨酸。在某些实施方式中，在间插结构域之间形成一个或多个二硫键，称为链间二硫键。在其它实施方式中，本发明融合蛋白可具有直接融合于结合域的间插结构域(即，没有接头或铰链)。在一些实施方式中，所述间插结构域是二聚化结构域。
本发明多特异性融合蛋白的间插或二聚化结构域可通过肽接头连接于一个或多个末端结合域。除提供间隔功能外，接头可在融合蛋白内以及融合蛋白和其靶点之间提供适合将融合蛋白的一个或多个结合域适当定向的弹性或刚性。另外，在给予需要的对象如人后，接头可在体外和体内支持全长融合蛋白的表达和纯化蛋白的稳定性，在这些对象中接头优选无免疫原性或免疫原性较低。在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插或二聚化结构域的接头可包含人免疫球蛋白铰链的一部分或全部。
此外，结合域可包含VH和VL结构域，这些可变区结构域可通过接头结合起来。示范性可变区结合域接头包括属于(GlynSer)家族的接头，如(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)n、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)n，其中n是1-5的整数(参见例如，分别对应于SEQ ID NO：518、525、542、585、586和603的接头22、29、46、89、90和116)。在优选实施方式中，这些基于(Gly4Ser)的接头用于连接可变区，不用于将结合域(如scFv)连接于间插结构域(如IgG CH2CH3)。
可用于将间插结构域(例如，免疫球蛋白分子衍生的恒定亚区)连接于结合域或者连接结合域的两个可变区的示范性接头可参见SEQ ID NO：497-604和1223-1228。
本发明考虑到的接头包括例如，衍生自免疫球蛋白超家族成员的任何域间区(如抗体绞链区)或C型凝集素(II型膜蛋白家族)的杆区域的肽。这些接头的长度可以是约2-150个氨基酸、或约2-40个氨基酸、或约8-20个氨基酸、优选约10-60个氨基酸、更优选约10-30个氨基酸、最优选约15-25个氨基酸。例如，接头1(SEQ ID NO：497)长为2个氨基酸，接头116(SEQ ID NO：603)长为36个氨基酸。
除通常的长度考量外，适用于本发明融合蛋白的接头包括选自下组的抗体绞链区：IgG绞链、IgA绞链、IgD绞链、IgE绞链或其变体。在某些实施方式中，接头可以是选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、其片段或变体的抗体绞链区(上部和核心区域)。本文所用的作为“免疫球蛋白绞链区”的接头指在CH1羧基端和CH2氨基端(对IgG、IgA和IgD而言)或CH3氨基端(对IgE和IgM而言)之间发现的氨基酸。本文所用的“野生型免疫球蛋白绞链区”指在抗体重链中发现的置于CH1和CH2区之间并连接这两个区域(对IgG、IgA和IgD而言)或置于CH2和CH3区之间并连接这两个区域(对IgE和IgM而言)的天然产生的氨基酸序列。在优选实施方式中，野生型免疫球蛋白绞链区序列是人序列。
根据结晶图象研究，可根据功能和结构将IgG绞链区再分成以下三个区域：上部绞链区、核心或中部绞链区和下部绞链区(Shin等，(1992)ImmunologicalReviews 130：87)。示范性上部绞链区包括IgG1中发现的EPKSCDKTHT(SEQID NO：1240)、IgG2中发现的ERKCCVE(SEQ ID NO：1241)、IgG3中发现的ELKTPLGDTT HT(SEQ ID NO：1242)或EPKSCDTPPP(SEQ ID NO：1243)、以及IgG4中发现的ESKYGPP(SEQ ID NO：1244)。示范性中部绞链区包括IgG1和IgG2中发现的CPPCP(SEQ ID NO：1245)、IgG3中发现的CPRCP(SEQID NO：1246)和IgG4中发现的CPSCP(SEQ ID NO：1247)。虽然IgG1、IgG2和IgG4抗体各自具有一个上部和中部铰链，IgG3具有四个串联铰链-一个是ELKTPLGDTT HTCPRCP(SEQ ID NO：1248)，三个是EPKSCDTPPP CPRCP(SEQ ID NO：1249)。
IgA和IgD抗体看来缺少IgG-样核心区，IgD看来具有两个串联的上部绞链区(参见SEQ ID NO：1250和1251)。SEQ ID NO：1252和1253中列出了IgA1和IgA2抗体中发现的示范性野生型上部绞链区。
相反，IgE和IgM抗体包含具有铰链样特性的CH2区域而不是典型的绞链区。SEQ ID NO：1254( VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQLLCLVSGYTPG TINITWLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQKHWLSDRTYTC Q
“改变的野生型免疫球蛋白绞链区”或“改变的免疫球蛋白绞链区”指(a)含有至多30％氨基酸改变(如至多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区，(b)长度为至少10个氨基酸(如至少12、13、14或15个氨基酸)、含有至多30％氨基酸改变(如至多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分，或者(c)包含核心绞链区的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分(该部分长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方式中，野生型免疫球蛋白绞链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其它氨基酸残基(如，一个或多个丝氨酸残基)所取代。另选地或额外地，改变的免疫球蛋白绞链区可使野生型免疫球蛋白绞链区的脯氨酸残基被另一氨基酸残基(如丝氨酸残基)取代。
可用作连接区的另选的铰链和接头序列可从连接IgV-样或IgC-样结构域的细胞表面受体诸部分制备。当细胞表面受体含有多个串联的IgV-样结构域时在IgV-样结构域之间以及细胞表面受体含有多个串联的IgC-样区域时在IgC-样结构域之间的区域也可用作连接区或接头肽。在某些实施方式中，铰链和接头序列的长度是5-60个氨基酸，可能是基本呈柔韧性，但也可能提供更刚性的特征，也可主要含有α-螺旋结构而β-片层结构很少。优选地，序列是在血浆和血清中稳定，并且能耐受蛋白水解切割。在一些实施方式中，序列可含有能形成一个或多个二硫键以稳定该分子的C末端的天然产生的或添加的基序，例如CPPC。在其它实施方式中，序列可含有一个或多个糖基化位点。铰链和接头序列的例子包括CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD96、CD150、CD166和CD244的IgV样和IgC样结构域之间或IgC样或IgV样结构域之间的结构域间区。另选铰链也可从非免疫球蛋白超家族成员的II型受体如CD69、CD72和CD161中含二硫键的区域制备。
在一些实施方式中，铰链接头具有一个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中，接头具有两个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中，铰链接头衍生自免疫球蛋白域间区(包含(例如)IgG1铰链的上部和核心序列的抗体绞链区)或II型C-型凝集素主干区(衍生自II型膜蛋白；参见例如，PCT申请公开号WO2007/146968所示的示范性凝集素主干区序列，如该公开文件的SEQ ID NO：111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、287、289、297、305、307、309-311、313-331、346、373-377、380或381)，这些序列通过引用纳入本文。
在一个方面，本文所述的含有TGFβ拮抗剂的示范性多特异性融合蛋白也含有至少一个对TGFβ以外靶点有特异性的额外的结合区或结构域，如IL6、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF拮抗剂或GITR激动剂。例如，本发明多特异性融合蛋白具有通过间插结构域(如人IgG1CH2CH3Fc区)连接于IL6、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF拮抗剂或GITR激动剂结构域的TGFβ拮抗剂结构域。在某些实施方式中，多特异性融合蛋白包含第一和第二结合域，第一和第二接头，以及间插结构域，其中所述间插结构域的一端通过第一接头融合于TGFβ拮抗性第一结合域(如TGFβR2胞外域、抗-TGFβR2胞外域、抗-TGFβ)，另一端通过第二接头融合于不同结合域，例如IL6、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF拮抗剂或GITR激动剂。
在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的第一接头和第二接头各自独立地选自(例如)，SEQ ID NO：497-604和1223-1228。例如，所述第一和第二接头可能是接头102(SEQ ID NO：589)、47(SEQ ID NO：543)、80(SEQ ID NO：576)或其任何组合。在其它实例中，一个接头是接头102(SEQ ID NO：589)，另一个接头是接头47(SEQ ID NO：543)，或者一个接头是接头102(SEQ ID NO：589)，另一个接头是接头80(SEQ ID NO：576)。在其它实例中，包含VH和VL结构域，例如对IL6、IL6R、IL6xR、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF、GITR、TGFβR2胞外域或TGFβ特异性的结构域的本发明结合域在VH和VL结构域之间可具有另一(第三)接头，如接头46(SEQ ID NO：542)。在这些实施方式中，接头可侧接1-5个额外的连接氨基酸，它们可以简单地是产生这种重组分子所致(如，使用特定的限制性酶位点来连接核酸分子可能导致插入一个或数个氨基酸)，或者出于本发明目的可以认为是任何具体接头核心序列的一部分。
在其它实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域由免疫球蛋白恒定区或亚区(优选IgG、IgA或IgD的CH2CH3；或IgE或IgM的CH3CH4)构成，其中所述间插结构域位于TGFβ拮抗剂结构域和IL6、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF拮抗剂结合域或GITR激动剂结合域之间。在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域在氨基末端具有TGFβ拮抗剂，在羧基末端具有对IL6、IL6xR、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF或GITR特异性的结合域。在其它实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域在氨基末端具有对IL6、IL10、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF拮抗剂结合域或GITR激动剂结合域特异性的结合域，在羧基末端具有TGFβ拮抗剂。在其它实施方式中，免疫球蛋白恒定区或亚区包含免疫球蛋白G1(IgG1)的CH2和CH3结构域。在相关实施方式中，所述IgG1CH2和CH3结构域中以下一个或多个氨基酸被突变(即，在该位置具有不同的氨基酸)：234位的亮氨酸(L234)、235位的亮氨酸(L235)、237位的甘氨酸(G237)、318位的谷氨酸(E318)、320位的赖氨酸(K320)、322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(按照EU进行编号)。例如，可将任一上述氨基酸改变为丙氨酸。在另一实施方式中，根据Kabat编号，所述CH2结构域中L234、L235、G237、E318、K320和K322各自突变为丙氨酸(即分别是L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A)。
在一些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白具有包含TGFβR2胞外域或TGFβR2胞外域亚结构域或其任何组合的TGFβ拮抗剂。例如，TGFβ拮抗剂可包含GenBank登录号NP_001020018.1所列的氨基酸73-176、GenBank登录号NP_003233.4所列的氨基酸48-151，或其任何组合。在其它实施方式中，TGFβ拮抗剂包含SEQ ID NO：743或744所列的氨基酸序列。
在其它实施方式中，具有本发明TGFβ拮抗剂的本发明多特异性融合蛋白还具有IL6拮抗剂结合域，该结合域结合IL6xR的亲和力高于单独IL6或单独IL6Rα的并与sIL6xR复合物竞争结合mgp130或增强sgp130与sIL6xR复合物结合。在某些实施方式中，IL6xR特异性的结合域包含(i)VH结构域，其具有与SEQ ID NO：435-496中任一项所列VH结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(ii)VL结构域，其具有与SEQ IDNO：373-434中任一项所列VL结构域的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iii)(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域；或者同时包含来自同一参比序列的(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域。在一个实施方式中，这种VH和VL结构域可形成示范性结合域TRU6-1019(分别参见SEQ ID NO：453和391)。
在其它实施方式中，结合IL6xR的亲和力高于IL6或IL6Rα或单独IL6或单独IL6Rα并且与gp130竞争结合sIL6xR复合物或增强sgp130与sIL6xR复合物的结合的IL6拮抗剂结合域包括VH和VL结构域，这两个结构域包含构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)VH结构域包含SEQ ID NO：435-496中任一项所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(b)VL结构域包含SEQ ID NO：373-434中任一项所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列；或者所述结合域包含来自同一参比序列的(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列。这些多特异性融合蛋白的VL和VH结构域可以任何取向安置，并且可由本文所述的至多约5-30个氨基酸的接头隔开。在某些实施方式中，连接VH和VL结构域的接头包含接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含IL6拮抗剂结合域的多特异性融合蛋白可检测地抑制IL6顺式和反式信号传导，优选抑制反式信号转导，任选不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号传导。
这类多特异性融合蛋白，在本文中称为较差受体分子的示范性结构包括N-BD-X-ED-C、N-ED-X-BD-C、N-ED1-X-ED2-C，其中BD是免疫球蛋白样或免疫球蛋白可变区结合域，X是间插结构域，ED是受体胞外域等。在一些构建物中，X可以包含安置在第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区域。在一些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白中的间插结构域(X)从氨基端到羧基端包含下述结构：-L1-X-L2-，其中L1和L2各自独立地是含有2至约150个氨基酸的接头；X是免疫球蛋白恒定区或亚区。在其它实施方式中，所述多特异性融合蛋白具有的间插结构域是清蛋白、转铁蛋白或其它血清蛋白结合蛋白，其中所述融合蛋白在组合物中基本或主要保持单链多肽的形式。在另一实施方式中，本发明多特异性融合蛋白具有以下结构；N-BD1-X-L2-BD2-C，其中N和C分别代表氨基末端和羧基末端；BD1是与TGFβR2胞外域至少约90％相同的TGFβ拮抗剂；-X-是-L1-CH2CH3-，其中L1是任选通过取代第一个半胱氨酸而突变的第一IgG1铰链，-CH2CH3-是任选经突变消除了FcγRI-III相互作用能力而保持FcRn相互作用能力的IgG1Fc结构域的CH2CH3区；L2是选自SEQ IDNO：497-604和1223-1228的接头；BD2是IL6或IL6/IL6R复合物的特异性结合域。
在具体实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)IL6拮抗剂，其包含分别与SEQ ID NO：435-496所列序列至少80％-100％相同的具有CDR1、CD2和CDR3氨基酸序列的重链可变区和分别与SEQ ID NO：373-434所列序列至少80％-100％相同的具有CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中从氨基末端到羧基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的IL6拮抗剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于包含SEQ ID NO：625的氨基酸276-489的CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的IL6拮抗剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ ID NO：589)，IL6拮抗剂VH和VL结构域之间的另一(第三)接头是接头46(SEQ ID NO：542)。
在其它实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)IL10拮抗剂，其包含与SEQ ID NO：745的氨基酸序列或SEQ IDNO：745的氨基酸22-401至少80％-100％相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端或从羧基末端到氨基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的IL10拮抗剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的IL10拮抗剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ ID NO：589)。
在其它实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)VEGF拮抗剂，其包含与SEQ ID NO：747的氨基酸序列至少80％-100％相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端或从羧基末端到氨基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的VEGF拮抗剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的VEGF拮抗剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ IDNO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ IDNO：589)。
在其它实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)TNFα拮抗剂，其包含与SEQ ID NO：748或749的氨基酸序列至少80％-100％相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端或从羧基末端到氨基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的TNFα拮抗剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的TNFα拮抗剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ ID NO：589)。在特定实施方式中，所述多特异性交叉受体融合蛋白具有SEQ ID NO：1236的氨基酸序列。
在其它实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)HGF拮抗剂，其包含分别与SEQ ID NO：921-1078所列序列至少80％-100％相同的具有CDR1、CD2和CDR3氨基酸序列的重链可变区和分别与SEQ ID NO：762-920所列序列至少80％-100％相同的具有CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中从氨基末端到羧基末端或从羧基末端到氨基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的HGF拮抗剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的HGF拮抗剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ ID NO：589)，HGF拮抗剂VH和VL结构域之间的另一(第三)接头是接头46(SEQ ID NO：542)。
在其它实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)TWEAK拮抗剂，其包含与SEQ ID NO：761的氨基酸序列至少80％-100％相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端或从羧基末端到氨基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的TWEAK拮抗剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的TWEAK拮抗剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ ID NO：589)。在特定实施方式中，所述多特异性交叉受体融合蛋白具有SEQ ID NO：1237的氨基酸序列。
在其它实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)IGF拮抗剂，其包含与SEQ ID NO：754-760的氨基酸序列至少80％-100％相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端或从羧基末端到氨基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的IGF拮抗剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的IGF拮抗剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ ID NO：589)。
在其它实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ IDNO：743或744所列序列至少80％-100％相同的氨基酸序列的TGFβ拮抗剂，和(b)GITR激动剂，其包含与SEQ ID NO：746的氨基酸74-181至少80％-100％相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端或从羧基末端到氨基末端：(i)(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的GITR激动剂融合于第一接头，(ii)所述第一接头融合于CH2和CH3的免疫球蛋白重链恒定区，(iii)所述CH2CH3恒定区多肽融合于第二接头，和(iv)所述第二接头融合于(a)的TGFβ拮抗剂或(b)的GITR激动剂。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47(SEQ ID NO：543)或接头80(SEQ ID NO：576)，所述第二接头是接头102(SEQ ID NO：589)。
制备多特异性融合蛋白
为了高效产生本文所述的任何结合域多肽或融合蛋白，用先导肽促进所表达的多肽和融合蛋白的分泌。预计使用任何常规的先导肽(信号序列)就能指导初始表达的多肽或融合蛋白进入分泌通路并导致在先导肽和所述多肽或融合蛋白的连接点上或其附近从成熟多肽或融合蛋白上切掉先导肽。根据本领域已知因素选择特定的前导肽，例如使用易于在先导肽的编码序列起始处或末端包含限制性核酸内切酶切割位点以便于分子工程操作的多核苷酸编码的序列，前提是这类引入序列确定的氨基酸不会不可接受地干扰由初始表达的蛋白质的先导肽加工；或者如果在该多肽或融合蛋白成熟过程中不切掉该先导肽，则其不会不可接受地干扰多肽或融合蛋白分子的任何所需功能。本发明的示范性先导肽包括天然先导序列(即，随天然蛋白质一起表达的序列)或使用异源先导序列，如H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG(X)n-CO2H(其中X是任何氨基酸、n是0-3)(SEQ ID NO：1185)或H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO2H(SEQID NO：1186)。
如本文所述，也考虑了本文所述的结合域，如胞外域、轻链和重链可变区以及CDR的变体和衍生物。在一个实例中，提供将一个或多个氨基酸残基加入特定结合剂氨基酸序列的插入变体。插入可位于蛋白质的任一端或两端，或者可位于特定结合剂氨基酸序列的内部区域内。本发明的变异产物也包含成熟的特定结合剂产物，即去除先导或信号序列且所得蛋白质具有额外的氨基末端残基的特定结合剂产物。所述额外的氨基末端残基可来自另一种蛋白质，或者可包含无法鉴定为来自某具体蛋白质的一个或多个残基。考虑了在-1位上具有额外甲硫氨酸残基的多肽，以及在-2和-1位上具有额外甲硫氨酸和赖氨酸残基的本发明多肽。在提高细菌宿主细胞的重组蛋白产量中，具有额外的Met、Met-Lys或Lys残基(或总地具有一个或多个碱性残基)的变体特别有用。
本文所用的“氨基酸”指天然(天然产生)的氨基酸、取代的天然氨基酸、非天然氨基酸、取代的非天然氨基酸或其任何组合。在本文中，用标准的单字母或三字母代号表示天然氨基酸。天然极性氨基酸包括天冬酰胺(Asp或N)和谷胺酰胺(Gln或Q)；以及碱性氨基酸如精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)和其衍生物；以及酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)及其衍生物。天然疏水性氨基酸包括色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)和其衍生物；以及其它非极性氨基酸如甘氨酸(GIy或G)、丙氨酸(Ala或A)、脯氨酸(Pro或P)和其衍生物。中等极性的天然氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)和其衍生物。除非另有说明，本文所述的任何氨基酸可以是D-或L-构型。
取代变体包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被去除或用另一残基取代的融合蛋白。在一些实施方式中，取代的性质是保守取代；然而，本发明也包括非保守取代。可按照物理性质以及在蛋白质二级和三级结构中的贡献对氨基酸进行分类。本领域将保守取代认定为用性质相似的氨基酸进行取代。示范性保守取代可参见表1(参见WO 97/09433，第10页，1997年3月13日公开)，如下所示。
表1.保守取代I
或者，保守氨基酸可按照Lehninger(生物化学(Biochemistry)，第二版；WP出版公司(Worth Publishers，Inc.)NY：NY(1975)，第71-77页)进行分组，如下表2所示。
表2.保守取代II
变体或衍生物也可能因使用特定表达系统而具有额外的氨基酸残基。例如，使用将所需多肽表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物一部分的市售载体能提供在切掉所需多肽的GST组分后，在-1位上具有额外甘氨酸残基的所需多肽。也考虑到在其它载体系统中表达产生的变体，包括将组氨酸标签掺入氨基酸序列，通常位于序列的羧基和/或氨基末端的变体。
也考虑了本发明结合域中一个或多个氨基酸残基被去除的缺失变体。缺失可以在融合蛋白的一端或两端上进行，或者通过去除氨基酸序列内的一个或多个残基进行。
在某些示范性实施方式中，本发明融合蛋白是糖基化的，糖基化模式取决于各种因素，包括表达蛋白质的宿主细胞(如果在重组宿主细胞中制备)和培养条件。
本发明也提供融合蛋白的衍生物。衍生物包括携带插入、缺失或取代氨基酸残基以外的修饰的特异性结合域多肽。在某些实施方式中，修饰是共价修饰，包括例如与聚合物、脂质以及其它有机和无机部分发生化学键合。可制备能延长特异性结合域多肽的循环半衰期的本发明衍生物，或者可设计该衍生物以提高所述多肽对目的细胞、组织或器官的靶向容量。
本发明还包括经共价修饰或衍生而包含一个或多个水溶性聚合物连接体如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇的融合蛋白，如美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192和4,179,337所述。本领域已知的其它有用聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、右旋糖苷、纤维素和其它基于糖的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇(如甘油)和聚乙烯醇、以及这些聚合物的混合物。特别优选的是聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白质。水溶性聚合物可以在特定位置键合，例如在本发明蛋白质或多肽的氨基末端，或者随机连接于所述多肽的一个或多个侧链。美国专利6,133,426中记载了使用PEG来提高治疗能力。
本发明的具体实施方式是免疫球蛋白或Fc融合蛋白。这类融合蛋白可具有较长的半衰期，例如数小时、一天或更长时间，或者一周或更长时间，特别是在Fc结构域能够与FcRn，即新生儿Fc受体相互作用时。Fc结构域中与FcRn的结合位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。这些蛋白质之间的紧密结合可用作纯化本发明抗体或融合蛋白的手段，例如，在蛋白质纯化过程中使用蛋白A或蛋白G亲和色谱。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术在某一水平上包括对多肽和非多肽组分进行粗分级。常常需要使用色谱和电泳技术进行进一步纯化，以便实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合制备纯融合蛋白的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的肽纯化方法是快速蛋白质液相色谱和HPLC。
本发明的某些方面涉及融合蛋白的纯化，在具体实施方式中，涉及其显著纯化。本文所用术语“纯化的融合蛋白”指可与其它组分分离的组分，其中融合蛋白相对于天然可获得状态纯化至任何程度。因此，纯化的融合蛋白也指与其天然产生环境相分离的融合蛋白。
通常，“纯化”指经过分级去除了各种其它组分的融合蛋白组分，该组分基本保持了表达的生物学活性。本文所用术语“基本纯化”指融合结合蛋白组分，其中融合蛋白构成该组合物的主要成分，例如占组合物中蛋白质重量的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或更多。
本领域技术人员能够从本发明中获知定量测定纯化程度的各种方法。它们包括例如，测定活性组分的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析评估组分中融合蛋白的含量。评估蛋白质组分的纯度的优选方法是计算该组分的结合活性，将其与初始提取物的结合活性作比较，从而计算纯化程度，在本文中通过“纯化倍数”评价。当然，用于代表结合活性水平的实际单位取决于选择用于跟踪纯化的具体测定技术和表达的融合蛋白是否具有可检测的结合活性。
适用于蛋白质纯化的各种技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括例如，用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀，或者通过先热变性再离心进行沉淀；色谱步骤如离子交换、凝胶过滤、反相色谱、羟基磷灰石和亲和力色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的组合。正如本领域众所周知的那样，相信可改变进行各种纯化步骤的顺序，或者某些步骤可省略，并仍产生适合制备基本纯化的蛋白质的方法。
通常并不要求总是以最纯化状态提供融合蛋白。实际上，考虑到在某些实施方式中可使用纯化水平较低的蛋白质。可结合使用较少的纯化步骤，或利用同一总纯化方案的不同形式进行部分纯化。例如，应理解用HPLC设备实施的阳离子交换柱色谱的纯化水平通常高于利用低压色谱系统实施的相同技术的纯化水平。纯化程度相对较低的方法可能在蛋白质产物总回收率方面，或者在维持所表达蛋白质的结合活性方面具有优点。
已知随着不同的SDS/PAGE条件多肽迁移可发生改变(有时是显著改变)(Capaldi等(1977)Biochem.Biophys.Res.Comm.76：425)。因此，应理解在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的融合蛋白表达产物的表观分子量可能不同。
多核苷酸、表达载体和宿主细胞
本发明提供编码本发明多特异性融合蛋白的多核苷酸(分离或纯化或纯的多核苷酸)、包含这类多核苷酸的载体(包括克隆载体和表达载体)以及用本发明多核苷酸或载体转化或转染的细胞(如宿主细胞)。
在某些实施方式中，考虑了编码本发明结合域，或含有一个或多个这类结合域的多特异性融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)。所附实施例中提供了编码多特异性融合蛋白构建物的表达盒。
本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体，具体是重组表达构建物。在一个实施方式中，本发明考虑了一种载体，其包含编码含有TGFβ拮抗剂结构域和IL6或IL6/IL6R结合域的本发明多特异性融合蛋白的多核苷酸，以及引起或促进这类多特异性融合蛋白编码序列的转录、翻译或加工的其它多核苷酸序列。
适合用于原核和真核宿主的克隆和表达载体可参见例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY，(1989)。示范性的克隆/表达载体包括可能基于质粒、噬菌粒、噬粒、粘粒、病毒、人工染色体或本领域已知适用于扩增、转移和/或表达所含多核苷酸的任何核酸载体的克隆载体、穿梭载体和表达构建物。
本文所用术语“载体”指能够运输所连接的另一核酸的核酸分子。示范性载体包括质粒、酵母人工染色体和病毒基因组。某些载体能够在宿主细胞中自发复制，而另一些载体可整合到宿主细胞基因组中从而随宿主基因组一起复制。此外，某些载体在本文中称为″重组表达载体″(或简称为″表达载体″)，其含有操作性连接于表达控制序列，因此能够指导这些序列表达的核酸序列。
在某些实施方式中，表达构建物衍生自质粒载体。说明性构建物包括修饰的pNASS载体(加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆泰克公司(Clontech，Palo Alto，CA))，其具有编码氨苄青霉素抗性基因、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点的核酸序列；pDEF38和pNEF38(CMC ICOS生物技术公司(CMC ICOS Biologics，Inc.))，其具有CHEF1启动子；和pD18(隆萨公司(Lonza))，其具有CMV启动子。其它合适的哺乳动物表达载体是众所周知的(参见例如，Ausubel等，1995；Sambrook等，同上；也参见，例如，加州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen，SanDiego，CA)、威斯康星州麦迪逊的诺华基公司(Novagen，Madison，WI)、新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia，Piscataway，NJ))的产品目录。可制备包含在合适调控下的二氢叶酸还原酶(DHFR)-编码序列，用来促进融合蛋白产量水平提高的有用构建物，所述产量水平取决于施加合适选择剂(如甲氨蝶呤)后的基因扩增。
通常，重组表达载体包含允许转化宿主细胞的复制起点和选择性标记，和衍生自高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子，如上所述。与本发明多核苷酸操作性连接的载体产生克隆或表达构建物。示范性的克隆/表达构建物含有至少一个操作性连接于本发明多核苷酸的表达控制元件，如启动子。也考虑在载体和本发明克隆/表达构建物中采用其它表达控制元件，如增强子、因子特异性结合位点、终止子和核糖体结合位点。本发明多核苷酸的异源结构序列以合适状态与翻译起始和终止序列组装在一起。因此，例如，本文提供的融合蛋白编码核酸可包含在任何表达载体构建物中，形成用于在宿主细胞中表达这类蛋白质的重组表达构建物。
可通过各种方法将合适的DNA序列插入载体中。通常，通过本领域已知方法将DNA序列插入合适的限制性核酸内切酶切割位点。考虑了用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的标准技术以及各种分离技术。许多标准技术可参见例如，Ausubel等(《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，马萨诸塞州波士顿的格林出版联合公司和约翰韦利森公司(Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons，Inc.，Boston，MA)，1993)；Sambrook等(《分子克隆》(Molecular Cloning)，第二版，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)，1989)；Maniatis等(《分子克隆》，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社，1982)；Glover(Ed.)(《DNA克隆》(DNA Cloning)第I卷和第II卷，英国牛津的IRL出版社(IRL Press，Oxford，UK)，1985)；Hames和Higgins(编)(《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，英国牛津的IRL出版社，1985)；等等。
表达载体中的DNA序列操作性连接于至少一个合适的表达控制序列(如组成型启动子或调节性启动子)，以指导mRNA合成。这类表达控制序列的代表性例子包括真核细胞或其病毒的启动子，如上所述。可利用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有选择性标记的其它载体从任何所需基因中选择启动子区域。真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I。本领域普通技术人员熟知如何选择合适的载体和启动子，本文记载了某些特别优选的包含操作性连接于本发明蛋白质或多肽的编码核酸的至少一个启动子或调节性启动子的重组表达构建物的制备。
也考虑了本发明多核苷酸的变体。变体多核苷酸与本文所述的确定序列的多核苷酸之一至少90％相同，优选95％、99％或99.9％相同，或者能够在严格杂交条件(0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，约65-68℃；或者0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺，约42℃)下与确定序列的多核苷酸之一杂交。多核苷酸变体应保持编码具有本文所述功能的结合域或其融合蛋白的能力。
术语“严格”用于指本领域通常理解的严格条件。杂交严格性通常取决于温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。用于杂交和洗涤的严格条件的例子是0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，约65-68℃；或者0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺，约42℃(参见Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，1989)。
也可采用更严格的条件(如更高的温度、更低的离子强度、更多的甲酰胺或其它变性剂)；然而，杂交速率会受影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，其它示范性严格杂交条件包括在37℃(用于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(用于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(用于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(用于23个碱基的寡核苷酸)下，用6x SSC、0.05％焦磷酸钠洗涤。
本发明另一方面提供用本发明的任何多核苷酸或载体/表达构建物转化、转染或含有本发明的任何多核苷酸或载体/表达构建物的宿主细胞。利用本领域已知的任何方法，包括转化、转染和转导，将本发明的多核苷酸或克隆/表达构建物引入合适细胞。宿主细胞包括接受离体细胞治疗，包括例如，离体基因治疗的对象的细胞。携带本发明多核苷酸、载体或蛋白质时，考虑作为本发明某一方面的真核宿主细胞除对象自身细胞(如人患者的自身细胞)外还包括VERO细胞、HeLa细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包括能够修饰所表达多价结合分子的糖基化模式的修饰的CHO细胞，参见美国专利申请公开号2003/0115614)、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞、HepG2细胞、N细胞、3T3细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(如Sf9细胞)、酿酒酵母细胞以及本领域已知可用于表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何其它真核细胞。还考虑了原核细胞，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、链霉菌、或者本领域已知适用于表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何原核细胞。具体说，在由原核细胞分离蛋白质或肽时，考虑可采用本领域已知的用于从包含体提取蛋白质的技术。本领域技术人员根据本文教导能够了解如何选择合适的宿主。考虑了能糖基化本发明融合蛋白的宿主细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)指含有重组表达载体的细胞。应理解，这类术语不仅指特定细胞，还指该细胞的后代。在连续传代过程中可能因突变或环境影响而发生某些改变，所以这类后代实际上可能不与亲代细胞完全相同，但仍应落入本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
可以在经修饰适合激活启动子、选择转化子或扩增特定基因的常规营养培养基中培养重组宿主细胞。本领域普通技术人员不难了解选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件，例如温度、pH等。也可利用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括如Gluzman(1981)Cell23：175所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，以及能够表达相容性载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、合适启动子和任选的增强子，还包含任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′-侧接的非转录序列，例如，本文中关于多价结合蛋白表达构建物的制备中所述。衍生自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。可通过本领域技术人员熟悉的各种方法包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染或电穿孔将所述构建物引入宿主细胞(Davis等(1986)《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology))。
在一个实施方式中，用指导本发明蛋白质或多肽的重组病毒构建物转导宿主细胞。转导的宿主细胞能产生含有所表达的蛋白质或多肽的病毒颗粒，所表达的蛋白质或多肽来自病毒出芽期间掺入病毒颗粒的宿主细胞膜的某部分。
组合物及其使用方法
为了治疗患有与TGFβ、IL6、IL10、GITR、VEGF、TNF、HGF、TWEAK、IGF1或IGF2调节异常有关的疾病状况的人和非人哺乳动物，按照一次或多次给药的方案将本发明多特异性融合蛋白给予对象，给药量应能有效改善该疾病状况的症状。作为多肽，本发明多特异性融合蛋白可悬浮于或溶解于药学上可接受的稀释剂，其任选包含其它药学上可接受的赋形剂的稳定剂，这类稀释剂可用于静脉内注射或输注给药，如下文所详述。
药学有效剂量是预防、抑制疾病状况的发生或治疗疾病状态(在某种程度上缓解其症状，优选所有症状)的剂量。药学有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、给药途径、所治疗对象的类型、考虑治疗的特定对象的身体特征、同时用药和医学领域技术人员应认识到的其它因素。例如，可根据本发明的结合域多肽或多特异性蛋白融合物的强度，给予0.1mg/kg至100mg/kg体重的活性成分(可作为一次剂量给予，或作为多次剂量每小时、每天、每周、每月给予一次，或以合适间隔组合给予)。
在某些方面，本发明提供融合蛋白的组合物。本发明的药物组合物通常包含一种或多种类型的结合域或融合蛋白，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这类载体在所用剂量和浓度下应对接受者无毒。用于治疗目的的药学上可接受的载体是药剂学领域众所周知的，参见例如《雷明顿药物科学》(麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，A.R.Gennaro编，1985)。例如，可采用生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。药物组合物可包含防腐剂、稳定剂、染料等。例如，苯甲酸钠、山梨酸或对羟基苯甲酸酯可作为防腐剂添加，同上，1449。此外，也可采用抗氧化剂和助悬剂，同上。本发明化合物可以游离碱或盐形式使用，这两种形式都落入本发明范围。
药物组合物也可含有稀释剂如缓冲液，抗氧化剂如抗坏血酸，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白质，氨基酸，糖(如葡萄糖、蔗糖或糊精)，螯合剂(如EDTA)，谷胱甘肽，或者其它稳定剂或赋形剂。中性缓冲盐水或混有非特异性血清白蛋白的盐水是示范性的合适稀释剂。优选地，用合适赋形剂溶液作为稀释剂，将产物配制成冻干物。
本发明组合物可用于治疗人或非人哺乳动物中TGFβ或IL6调节异常引起或相关的疾病状态。TGFβ产量或活性提高与各种疾病过程有关，例如肿瘤发生、血管发生、转移、转移性迁移以及上皮和间充质癌(参见例如，Off等(1998)Curr.Biol.8：1243；Pardali和Mousaka(2007)Biochim.Biophys.Acta 1775：21)。此外，TGFβ信号转导与血管发生和血管疾病的发展有关(Bertolino等，(2005)Chest 128：585S)。
据报道，IL10可能在淋巴细胞疾病的发生中起到关键作用(美国专利号5,639,600)，IL10可能增加非霍奇金淋巴瘤细胞的增殖(Voorzanger等(1996)Cancer Res.56：5499)。近年来，有人提出TGFβ和IL10共同作用以确保炎症反应受控(Li和Flavell，(2008)Immunity 28：468)。据报道，人体内肿瘤表达的GITRL能介导免疫破坏(immunosubversion)(Baltz等(2007)FASEB J.21：2442)。过度表达VEGF和TGF β与宫颈癌的发生有关(Baritaki等(2007)Int.J.Oncol.31：69)。TNFα与肾细胞癌的发生有关(Harrison等(2007)J.Clin.Oncol.25：4542-9)。已证明，TGFβ能促进鳞状癌细胞的HGF依赖性的侵袭(Lewis等(2004)Br.J.Cancer，90：822)，HGF在人胰腺癌细胞中能刺激细胞生长和提高TGFα表达(Ohba等(1999)J.Gastroenterol.34：498-504)。此外，已证明TGFβ和HGF能刺激胃癌细胞的侵袭(Inoue等，(197)Jpn.J.Cancer Res.88：152)。在治疗癌症，包括肉瘤时鉴定到IGF1R(Scotlandi和Picci(2008)Curr.Opin.Oncol.20：419-27；Yuen和Macaulay(2008)Expert Opin.Ther.Targets 12：589-603)。
许多恶性疾病，如结肠癌中涉及IL-6反式信号转导，而某些恶性疾病，包括、不依赖激素的前列腺癌、B细胞增殖病如B细胞非霍奇金淋巴瘤，以及肾、乳腺、结肠、肺、脑和其它组织的晚期癌症中涉及IL6顺式信号转导(参见例如，Sansone等(2007)J.Clin Invest.117：3988)。因此，本发明多特异性融合蛋白可用于治疗各种TGFβ相关性自身免疫病(如系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎)、阿耳茨海默病、过度增殖病或恶性疾病，包括多囊性肾病、肺癌、结肠癌、尿道癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、头颈癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌或肝癌等。
“药学上可接受的盐”指药学上可接受且具有母体化合物的所需药理活性的本发明结合域多肽或融合蛋白的盐。这类盐包括：(1)与以下酸形成的酸加成盐：无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子，如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代时形成的盐；或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等的配位化合物。
在具体的示范性实施方式中，通过(例如)推注或输注方式，静脉内给予本发明多肽或融合蛋白。除静脉内给药外，给药途径还包括口服、外用、胃肠道外(如舌下或口颊)、舌下、直肠、阴道和鼻内途径。本文所用术语“胃肠道外”包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵体内、鞘内、耳道内(intrameatal)、尿道内注射、脊髓周(perispinal)注射或输注技术。配制药物组合物，以使该组合物给予患者后其中所含的活性成分可被生物利用。给予患者的组合物可以是一个或多个剂量单位的形式，例如，片剂可以是单一剂量单位，气溶胶形式的一种或多种本发明化合物的容器中可包含多个剂量单位。
在口服给药中，可存在赋形剂和/或粘合剂，如蔗糖、高岭土、甘油、淀粉右旋糖苷、环糊精、藻酸钠、乙基纤维素和羧甲基纤维素。任选地，可存在甜味剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂或其任何组合。任选地，也可使用包衣壳。
在准备进行注射给药的组合物中，可任选包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、助悬剂、缓冲液、稳定剂、等张剂中的一种或多种或其任何组合。
就基于核酸的制剂或包含本发明表达产物的制剂而言，通过，例如，皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径、或本领域已知适合在给定情况下使用的任何途径给予约0.01μg/kg至约100mg/kg体重的剂量。例如，优选剂量为约1μg/kg至20mg/kg，特别优选约5μg/kg至10mg/kg。本领域技术人员可以明显看出，给药的次数和频率取决于宿主的反应。
本发明药物组合物可以是能够给予患者的任何形式，例如固体、液体或气体(气溶胶)形式。组合物可以是通过本文所述的任何途径给予的液体形式，如酏剂、糖浆剂、溶液剂、乳液剂或悬液剂。
本文所用的液体药物组合物，无论是溶液形式、混悬液形式或其它类似形式，均可包含一种或多种下述组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液(如生理盐水)、林格溶液、等张氯化钠、不挥发性油如合成的甘油单酯或甘油二酯(可用作溶剂或混悬介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；螯合剂如乙二胺四乙酸；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量药瓶中。生理盐水是优选的添加剂。可注射药物组合物优选无菌。
制剂中也可能需要包含其它组分，例如递送载体，包括铝盐、油包水乳剂、可生物降解的油载体、水包油乳剂、可生物降解的微胶囊和脂质体。这类载体中所用的佐剂的例子包括N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-D-异谷胺酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL12、GM-CSF、γ干扰素和IL15。
虽然本领域普通技术人员已知的任何合适载体均可用于本发明药物组合物，但可根据给药方式和是否需要缓释而改变载体类型。就胃肠道外给药而言，载体可包含水、盐水、醇、脂肪、蜡、缓冲剂或其任何组合。就口服给药而言，可采用任何上述载体或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁或其任何组合。
也考虑将本发明多特异性融合蛋白组合物与第二种药剂联合给药。第二种药剂可以是本领域接受的作为特定疾病状态(如炎症、自身免疫病和癌症)标准治疗的药剂。考虑到的示范性第二种药剂的例子包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、化疗、放疗或其它活性和辅助性药剂。
本发明考虑到包含本发明药物组合物的剂量单位。这种剂量单位包括例如，单剂量或多剂量药瓶或注射器，包括两室药瓶或注射器，一室包含冻干形式的本发明药物组合物，另一室包含用于重建的稀释剂。多剂量的剂量单位也可以是，例如，用于连接于静脉内输注装置的(输液)袋或管。
本发明也考虑到在单位剂量或多剂量容器如药瓶中包含本发明药物组合物，以及有关将该组合物给予本文所述疾病患者的一组说明的药盒。
本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、非专利发表物、表格、序列、网页等均通过引用整体纳入本文。以下实施例是为了说明而非限制本发明。
实施例
交叉受体(Xceptor)序列
本文公开了示范性IL6拮抗剂可变区(VL和VH)结合序列(SEQ IDNO：373-496)。也公开了包含TGFβR2胞外域和抗-IL6xR结合域的示范性交叉受体融合蛋白的氨基酸序列和核酸表达盒。在本文中，将氨基末端具有TGFβR2胞外域且羧基末端具有抗-IL6xR结合域的的交叉受体融合蛋白称为TRU(XB6)-1019.1和TRU(XB6)-1019.2(氨基酸序列分别参见SEQ IDNO：737和738，相应核苷酸序列分别参见SEQ ID NO：741和742)。取向相反的交叉受体融合蛋白-即氨基末端具有抗-IL6xR结合域且羧基末端具有TGFβR2胞外域的交叉受体融合蛋白在本文中称为TRU(X6B)-1019.1和TRU(X6B)-1019.2(氨基酸序列分别参见SEQ ID NO：735和736，相应核苷酸序列分别参见SEQ ID NO：739和740)。
活性实施例
如下所述检测本文所述的各种交叉受体融合蛋白的活性。除非另有说明，以下实施例中所用的缩写包括以下术语：
PBS-T：PBS，pH 7.2-7.4和0.1％吐温20
工作缓冲液：含有1％BSA的PBS-T
封闭缓冲液(含有3％BSA的PBS-T
实施例1
TGFβ结合域
基本按Hoet等(2005)Nature Biotechnol.23：344所述，从Fab结合域噬菌体文库中筛选对TGFβ或IL6xR复合物特异性的结合域。通过PCR扩增克隆所述结合域。简要说，用PCR SuperMix(加州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen，San Diego，CA))和通过重叠产生G4S接头的合适引物从Fab文库克隆中扩增VL区和VH区，最初以56℃的退火温度进行9个循环，然后以62℃的退火温度进行20个循环。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并用凯杰(Qiagen)(加州查特沃斯(Chatsworth，CA))PCR纯化柱纯化。第二轮缝合反应包括将等摩尔的VL和VH产物与扩增缓冲液和水混合，在95℃变性5秒，然后缓慢冷却至室温。为进行扩增，加入dNTP混合物和扩增酶，并在72℃温育10秒。加入外部引物(5′VH和3′VL)后，该混合物以62℃的退火温度和45分钟的延伸反应循环处理35次。对所得的750碱基对的产物进行凝胶纯化，并用EcoRI和NotI消化，然后克隆到质粒pD28中(详见美国专利申请公开号2005/0136049和PCT申请公开号WO2007/146968)。
实施例2
通过ELISA测定交叉受体与IL6和超级IL6的结合
基本如下所述，检测超级-IL6(HIL6或IL6xR)、重组人IL6(rhIL6)和人可溶性IL6R与示范性交叉受体TRU(XT6)-1002、1019、1025、1042、1058和TRU(X6T)-1019(分别是SEQ ID NO：608、625、631、648、664和670)的结合活性。这些交叉受体各自包含TNFRSF1B胞外域和抗-IL6xR结合域。
HIL6和IL6结合
向96孔板的各孔中加入100μl山羊抗人IgG-Fc(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA))，抗体是PBS，pH 7.2-7.4配制的2μg/ml溶液。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS(pH 7.2-7.4)和0.1％吐温20(PBS-T)洗涤四次后，将250μl封闭缓冲液(含3％BSA或10％正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中，将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后，向抗人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng/ml起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品和人gp130-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&DSystems，Minneapolis，MN))，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的150pM的人超级IL-6或重组人IL-6溶液，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的150ng/ml的抗-人IL-6-生物素(R&D系统公司)溶液，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶4,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(加州旧金山的甾酶公司(Zymed，San Francisco，CA))，该平板加盖，室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后，加入100微升/孔的3，3，5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))约3-5分钟，然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
sIL6R结合
向96孔板的各孔中加入100μl山羊抗人IgG-Fc(加州科斯拉梅萨的ICN制药公司(ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA))，抗体是PBS，pH7.2-7.4配制的2μg/ml溶液。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后，将250μl封闭缓冲液(含3％BSA或10％正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中，将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后，向抗人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng/ml起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照抗人IL-6R(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和阴性对照人IgG或人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司)，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的75pM的重组人sIL-6R(R&D系统公司)溶液，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的100ng/ml的抗-人IL-6R-生物素(R&D系统公司)，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶4,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(加州旧金山的甾酶公司)，该平板加盖，室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后，加入100微升/孔的3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)约3-5分钟，然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图1A-1C的数据表明，所有交叉受体融合蛋白，无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白分子的氨基端或羧基端，均可结合HIL6。而且，这些试验证明，交叉受体蛋白对IL6xR复合物有特异性，因为只有两种交叉受体结合rhIL6(图1B)且没有一种结合sIL6R(图1C)。在相关研究中，发现交叉受体TRU(XT6)-1002和SMIP TRU(S6)-1002能与来自非人灵长动物普通猕猴(Mucaca mulatta)的IL6发生交叉反应。
实施例3
通过ELISA测定交叉受体与TNF-α的结合
基本如下所述，检测TNF-α与交叉受体TRU(XT6)-1002、1042、1058、1019和TRU(X6T)-1019(分别是SEQ ID NO：608、648、664、625和670)的结合活性。
向96孔板的各孔中加入100μl山羊抗人IgG-Fc(加州科斯拉梅萨的ICN制药公司)，抗体是PBS，pH 7.2-7.4配制的2μg/ml溶液。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后，将250μl封闭缓冲液加入各孔中，将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后，向抗人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照(依坦西普)和重组人TNFR2(TNFRSF1B)-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)、以及阴性对照人IgG或人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司)，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的2ng/ml的重组人TNF-α(R&D系统公司)溶液，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的200ng/ml的抗-人TNF-α-生物素(R&D系统公司)溶液，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶1,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司)，该平板加盖，室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后，加入100微升/孔的3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)约3-5分钟，然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图2中的数据表明，测试的所有交叉受体融合蛋白均可结合TNF-α，无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白的氨基端或羧基端。
实施例4
通过ELISA检测交叉受体双配体结合
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1006(SEQ ID NO：612)同时与TNF-α和IL6xR复合物结合。
在96孔板的各孔中加入100μl人HIL-6溶液(5μg/ml的PBS溶液，pH7.2-7.4)。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后，将250μl封闭缓冲液加入各孔中，将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后，向HIL-6包被平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng/ml起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::HIL6样品。阴性对照仅包括人gp130-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)、(依那西普)和工作缓冲液。该平板加盖并在室温温育1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的2ng/ml的重组人TNF-α(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)，该平板加盖，室温下温育1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的200ng/ml的抗人TNF-α-生物素(R&D系统公司)，该平板加盖，室温下温育1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶1,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司)，该平板加盖，室温下温育30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后，加入100微升/孔的3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)3-5分钟，然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图3的数据表明交叉受体蛋白可同时结合两种配体(在本例中是TNF-α和超级IL6)。
实施例5
通过ELISA检测交叉受体阻断超级IL6与GP130的结合
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1004、1006、1007、1008、1013和1019(分别是SEQ ID NO：610、612、613、614、619和625)阻断超级IL6(IL6xR)与可溶性gp130受体的结合。
向96孔板的各孔中加入100μl 0.25-0.5μg/ml人gp130-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)的PBS溶液(pH 7.2-7.4)。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后，将250μl封闭缓冲液(含3％BSA或10％正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中，将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用工作缓冲液从50μg/ml起对以下样品品进行连续五倍稀释：交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司)和抗-人IL6R(R&D系统公司)以及阴性对照抗-人IL-6(R&D系统公司)、人IgG或(依那西普)。将等体积的连续稀释的交叉受体样品与超级IL-6混合(超级IL-6终浓度为2.5ng/ml)，室温温育1小时。用PBS-T洗涤该平板三次后，向人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的连续稀释的交叉受体/HIL6混合物、人gp130-Fc嵌合体、抗-人IL6R、抗-人IL-6、人IgG和(依那西普)，该平板加盖，室温下温育约1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶10,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型抗-小鼠IgG-Fc(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)，该平板加盖，室温下温育1小时。用PBS-T洗涤该平板六次后，加入100微升/孔的3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(皮尔斯公司)约5-15分钟，然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图4的数据表明，包含抗-IL6xR结合域的交叉受体蛋白可阻断可溶性gp130与HIL6的结合。
实施例6
交叉受体阻断IL6和超级IL6诱导的细胞增殖
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1011、1014、1025、1026、1002和TRU(X6T)-1019(分别是SEQ ID NO：617、620、631、632、608和670)阻断IL6或超级IL6(IL6xR)诱导的TF-1细胞增殖。
在用于增殖实验前一天，向96孔平底板的各孔中加入含0.3x106个TF-1细胞(人红白血病细胞)的新鲜生长培养基(10％FBS-RPMI 1640；2mML-谷胺酰胺；100单位/毫升青霉素；100微克/毫升链霉素；10mM HEPES；1mM丙酮酸钠；和2纳克/毫升Hu GM-CSF)。然后收获细胞，并用测定培养基(不含GM-CSF、无细胞因子，其余成分与生长培养基相同)洗涤细胞两次，然后以1x 105个细胞/毫升的密度重悬于测定培养基。为了阻断IL-6活性，在96孔板中将连续稀释的感兴趣的TNFSFR1B::抗-HIL-6交叉受体或抗体与固定浓度的重组人IL-6(rhIL-6)(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)或超级IL-6(HIL-6)在37℃5％CO2条件下预孵育1小时。所用对照包括人IgG；人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司)；抗-hIL-6抗体(R&D系统公司)；和抗-hIL-6R抗体(R&D系统公司)。预孵育后，各孔中加入1x1041个细胞(100μl)。最终的测定混合物(总体积为200微升/孔，含有TNFSFR1B::HIL-6、rhIL-6或HIL-6以及细胞)在37℃、5％CO2的条件下温育72小时。在培养的最后4-6小时，加入3H-胸苷(测定培养基配制的20μCi/ml溶液，25微升/孔)。将细胞收集到UniFilter-96GF/c平板上，用TopCount读数器(帕克得公司(Packard))测定掺入的3H-胸苷。数据表示为三复孔的cpm平均值±SD。阻断百分数＝100-(测试cpm-对照cpm/最大cpm-对照cpm)*100。
图5A和5B的数据表明，所有交叉受体蛋白，无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白分子的氨基端或羧基端，均可阻断IL6或超级IL6单独或同时诱导的细胞增殖。
实施例7
通过ELISA测定交叉受体阻断TNF-α与TNFR的结合
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1004、1006、1007、1008、1013和1019(分别是SEQ ID NO：610、612、613、614、619和625)阻断TNF-α与TNF受体的结合。
向96孔板的各孔中加入100μl 0.25-0.5μg/ml重组人TNFR2-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)的PBS溶液(pH 7.2-7.4)。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后，将250μl封闭缓冲液(含3％BSA或10％正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中，将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用工作缓冲液从50-250μM起对以下样品品进行连续五倍稀释：交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照(依那西普)和抗-TNF-α(R&D系统公司)以及阳性对照人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司)和人IgG。将等体积的连续稀释的交叉受体样品与TNFα混合(TNFα终浓度为2.5ng/ml)，室温温育1小时。用PBS-T洗涤该平板三次后，向重组人TNFR2-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的连续稀释的交叉受体/TNFα混合物、(依那西普)、抗-TNFα、人gp130-Fc嵌合体和人IgG，该平板加盖，室温下温育约1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的200ng/ml的抗-人TNF-α-生物素(R&D系统公司)溶液，该平板加盖，室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶1,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司)，该平板加盖，室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后，加入100微升/孔的3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)约3-5分钟，然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图6的数据表明，交叉受体蛋白能阻断TNF-α与TNF受体的结合，这种阻断作用与TNFR-Fc的阻断作用大致相等。
实施例8
交叉受体阻断TNF-α诱导的细胞杀伤作用
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1011、1014、1025、1026、1002和TRU(X6T)1019(分别是SEQ ID NO：617、620、631、632、608和670)阻断TNF-α诱导的L929细胞杀伤作用。
用培养基(10％FBS-RPMI 1640；2mM L-谷胺酰胺；100单位/毫升青霉素；100微克/毫升链霉素；和10mM HEPES)制备密度为2x 105个细胞/毫升L929小鼠成纤维细胞细胞(弗吉尼亚州玛纳萨斯的ATCC(ATCC，Manassas，VA))的悬液，然后将100μl悬液加入平底黑色96孔板的各孔中，在37℃、5％CO2的湿化培养箱中温育过夜。用测定培养基(与培养培养基的成分相同但补充有2％FBS)连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品与等体积的重组人TNF-α(rhTNFα；明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)混合，在37℃、5％CO2的湿化培养箱中温育1小时。阳性对照(即，阻断TNFα诱导的L929细胞杀伤作用的药剂)包括(依那西普)、rhTNFR2-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和抗-TNFα抗体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)。阴性对照包括单独的测定培养基(不加TNF-α)和抗体hIgG(加入TNFα)。为了分析TNFα活性，去除L929细胞的培养基，然后每孔加入50μl TNFα/交叉受体或对照混合物和50μl放线菌素D(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))(4μg/ml新鲜制备的工作溶液)。然后，在37℃、5％CO2的湿化培养箱中温育细胞24小时。为了测定细胞活力，根据生产商说明书每孔加入100μl ATPlite 1步试剂(马萨诸塞州沃尔瑟姆的帕金埃尔默公司(PerkinElmer，Waltham，MA))，振荡2分钟，然后用TopCount读数器(帕克得公司)测定发光。
图9的数据表明，在本试验中所有交叉受体蛋白，无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白分子的氨基端或羧基端，均可阻断TNF-α诱导的细胞杀伤作用。
实施例9
通过ELISA检测交叉受体与TGFβ的结合
基本如下所述，检测TGFβ与交叉受体X6B和XB6的结合活性。
向96孔板的各孔中加入100μl山羊抗人IgG-Fc(加州科斯拉梅萨的ICN制药公司)，抗体是PBS，pH 7.2-7.4配制的2μg/ml溶液。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后，将250μl封闭缓冲液(含10％NGS的PBS-T)加入各孔中，将该平板加盖并在室温下温育2小时。用PBS-T洗板三次后，向抗人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔交叉受体TGFβR2::抗-HIL6样品、阳性对照重组人TGFβRII-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和阴性对照重组人TNFR2(TNFRSF1B)-Fc嵌合体(R&D系统公司)，各自用工作缓冲液(含1％BSA的PBS-T)稀释至300ng/ml。该平板加盖并在室温温育约1小时。用洗涤缓冲液(PBS/0.1％吐温20(PBS-T))洗板五次后，加入100微升/孔用工作缓冲液从4ng/ml起连续两倍稀释的TGFβ-1配体(R&D系统公司)。该平板加盖并在室温温育1小时。用洗涤缓冲液洗板五次后，加入100微升/孔工作缓冲液配制的200ng/ml生物素化抗-TGFβ-1(R&D系统公司)溶液。该平板加盖并在室温温育1小时。用洗涤缓冲液洗涤该平板五次后，加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶20,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)，该平板加盖，室温下温育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤该平板五次后，加入100微升/孔QuantaBlu荧光过氧化物酶底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司，通过将9ml底物溶液与1ml过氧化物溶液混合制备)，该平板加盖，室温下温育20分钟。用50微升/孔QuantaBlu终止溶液终止该反应。在325nm读出各孔的吸光度。
图8的数据表明，测试的交叉受体融合蛋白能结合TGFβ-1，无论TGFβR2胞外域位于融合蛋白的氨基末端还是羧基末端。
实施例10
交叉受体融合蛋白的表达
利用FreeStyleTM293表达系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))，根据生产商说明书，在293细胞中表达某些本文所述的交叉受体融合蛋白。
每30ml转染体系中，使用28ml FreeStyleTM 293表达培养基中包含的3x 107个细胞。在转染当天，将小份细胞悬液转移到微量离心管中，并用台盼蓝排除法测定细胞团的活力和细胞量。剧烈涡旋该悬液45秒，以分散细胞团，用库尔特计数器(Coulter Counter)和血球计数器测定细胞总数。细胞的活力超过90％。将含有所需细胞的摇瓶放入置于轨道振荡器上的37℃培养箱中。
对每个转染样品，如下所述制备脂质-DNA复合物。用I稀释30μg质粒DNA，至总体积为1ml，温和混合。用I稀释60μl 293fectinTM，至总体积为1ml，温和混合，并在室温下温育5分钟。温育5分钟后，将稀释的DNA加入稀释的293fectinTM中，总体积为2ml，温和混合。将所得溶液在室温下温育20-30分钟，以便形成DNA-293fectinTM复合物。
在温育DNA-293fectinTM复合物时，从培养箱中取出细胞悬液并将合适体积的细胞悬液放入无菌的一次性125ml锥形摇瓶内。就30ml转染体系而言，加入新鲜、预热的FreeStyleTM293表达培养基至总体积为28ml。
DNA-293fectinTM复合物温育完成后，将2ml DNA-293fectinTM复合物加入摇瓶中。
将2mlI，而非DNA-293fectinTM复合物加入阴性对照瓶内。
每瓶所含的总体积为30ml，最终细胞密度约为1x 106个活细胞/毫升。在放置于轨道摇床上的8％CO2潮湿气氛的37℃培养箱中温育该细胞，摇床旋转速度为125rpm。转染后约7天收获细胞，测定重组蛋白的表达。
如上所述，在293细胞中表达具有TNFRSF1B胞外域和TGFβRII胞外域的交叉受体分子。
实施例11
通过ELISA检测交叉受体与配体的结合
基本如下所述地，分别检测包含TNFRSF1B胞外域以及TWEAKR胞外域、OPG胞外域、TGFβRII胞外域或IL7R胞外域的交叉受体分子结合配体TWEAK、RANKL、TGFβ或IL7的能力。
将PBS配制的浓度为1μg/ml的小鼠和人配体(明尼苏达州明尼苏达的R&D系统公司)加入96孔板孔中(100微升/孔)。将平板于4℃温育过夜。用PBS-T洗涤五次后，将250μl封闭缓冲液(含3％BSA的PBS-T)加入各孔中，将该平板加盖并在室温(RT)下温育2小时。用工作缓冲液缓冲液(含1％BSA的PBS-T)从300ng/ml起配制连续三倍稀释的交叉受体。使用无关交叉受体作为阴性对照。室温下培育该平板1小时。用PBS-T洗涤五次后，加入100微升/孔HRP偶联型抗人IgG-Fc(用工作缓冲液1∶5000稀释)，将该平板加盖，并在室温下温育1小时。用PBS-T洗涤五次后，各孔中加入100微升Quant-Blu底物(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)。在室温下温育该平板10-30分钟，在325/420nm测定荧光。
结果列于下表3。未检测TNFRxTGFβRII与小鼠TGFβ的结合，然而注意到小鼠和人的TGFβ99％相同。
表3.交叉受体与配体的结合
ND＝未检测
实施例12
交叉受体阻断TGFB-1诱导的细胞增殖抑制作用
用Tsang等(Tsang，M.等(1995)Cytokine 7：389)所述方法检测SEQ IDNO：1236的交叉受体阻断TGFβ-1诱导HT2细胞的IL-4增殖的抑制作用。
简要说，在96孔板中，用含有1ng/ml人TGFβ-1的培养基(RPMI，10％FCS，0.05mM β-巯基乙醇)连续稀释交叉受体TNFR::TGFβRII样品；100微升/孔。在37℃、5％CO2的湿化培养箱中温育该平板1.5小时。阴性对照包括无关交叉受体蛋白(加入TGFβ-1)和培养基(加入和不加TGFβ-1)。阳性对照是重组TGFβRII-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼苏达的R&D系统公司)。温育后，每孔中加入100微升含15ng/ml mIL4(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)的培养基，其中包含1x104个HT2细胞(弗吉尼亚州玛纳萨斯的ATCC)。然后在37℃、5％CO2的湿化培养箱中温育该平板72小时。
为了通过测定细胞活力分析TGFβ-1活性，从每孔中去除100μL培养基，并用10μL WST-8试剂(马里兰州罗克韦尔的岛京分子技术公司(DojindoMolecular Technologies，Rockville，MD))替代。在37℃培育该平板2小时，在450nM处读出各孔的吸光度。
图9的数据表明交叉受体蛋白阻断了TGFβ-1对HT2细胞的IL4介导增殖的抑制作用。
实施例13
结合超级IL6而不是其它GP130细胞因子的特异性
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白对IL6以及gp130细胞因子IL-11、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)和心肌营养蛋白-1(CT-1)诱导TF-1细胞增殖的影响。
在用于增殖实验前一天，向96孔平底板的各孔中加入含0.3x106个TF-1细胞(人红白血病细胞)的新鲜生长培养基(10％FBS-RPMI 1640；2mM L-谷胺酰胺；100单位/毫升青霉素；100微克/毫升链霉素；10mM HEPES；1mM丙酮酸钠；和2纳克/毫升Hu GM-CSF)。收获细胞，并用测定培养基(不含GM-CSF、无细胞因子，其余成分与生长培养基相同)洗涤细胞两次，然后以1x 105个细胞/毫升的密度重悬于测定培养基。为了检测对LIF、OSM和CT-1活性的阻断，在96孔板中将连续稀释的TNFSFR1B::抗-HIL-6交叉受体TRU(XT6)-1002(SEQ ID NO：608)、TRU(XT6)-1019(SEQ ID NO：625)、TRU(XT6)-1022(SEQ ID NO：628)和TRU(XT6)-1025(SEQ ID NO：631)与固定浓度的各个gp130细胞因子或者超级IL-6(HIL-6)在37℃、5％CO2条件下单独预孵育1小时。预孵育后，各孔中加入1x104个细胞(100μl)。最终的测定混合物(总体积为200微升/孔，含有TNFSFR1B::HIL-6、gp130细胞因子或HIL-6以及细胞)在37℃、5％CO2的条件下温育72小时。在培养的最后4-6小时，加入3H-胸苷(测定培养基配制的20μCi/ml溶液，25微升/孔)。将细胞收集到UniFilter-96GF/c平板上，用TopCount读数器(帕克得公司)测定掺入的3H-胸苷。阻断百分数＝100-(测试cpm-对照cpm/最大cpm-对照cpm)*100。
结果表明，交叉受体能阻断IL6活性，但不能阻断IL-11、LIF、OSM或CT-1的活性(数据未显示)，因此结合于超级IL6，但对所测试的其它gp130细胞因子无影响。
实施例14
SMIP和交叉受体与肝细胞上的IL6R结合
如下所述，测试TRU(S6)-1002、TRU(XT6)-1019和抗-IL6抗体hu-PM1与肝衍生的HepG2细胞上的IL6R结合的能力。
用FACS缓冲液洗涤HepG2细胞，并用FACS缓冲液(PBS+3％FBS)调节至2x 106个细胞/毫升。向96孔板孔中加入50μL该溶液(105个细胞/孔)。该平板在37℃保温，直到加入稀释的测试分子。用FACS缓冲液制备连续稀释的测试分子，以得到2X工作母液，加入细胞时将其稀释至1X。将稀释的测试分子加入细胞(50微升/孔)，将细胞置于冰上孵育20分钟。全IgG用作对照。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬于偶联藻红蛋白的山羊抗人抗体(杰克逊实验室研究公司(Jackson Labs)；用FACS缓冲液1∶200稀释)。在冰上避光孵育20分钟后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于200ul PBS，并在LSRIITM流式细胞仪(加州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences，San Jose，CA))上读数。
如图10所示，TRU(S6)-1002和TRU(XT6)-1029基本不结合HepG2细胞。
实施例15
SMIP和交叉受体在小鼠中阻断IL-6和TNF活性
如下所述，检测本文所述的SMIP和交叉受体融合蛋白在小鼠中阻断IL-6或TNF诱导的血清淀粉样A(SAA)蛋白生产的能力。SAA是人和小鼠中主要急性期蛋白之一。在慢性炎症中发现血浆SAA水平长时间升高，其导致淀粉样变，从而影响肝脏、肾脏和脾脏(Rienhoff等(1990)Mol.Biol.Med.7：287)。单独给予时，IL-6和TNF均能诱导SAA(Benigni等(1996)Blood87：1851；Ramadori等(1988)Eur.J.Immunol.18：1259)。
(a)阻断超级IL-6活性
对雌性BALB/C小鼠眼窝后(retro-orbitally)注射0.2ml PBS，或者(200μg)、TRU(S6)-1002(200μg)或TRU(XT6)-1002(300μg或500μg)的PBS溶液。一小时后，对小鼠IP注射0.2ml PBS或2μg人超级-IL6的PBS溶液。IP注射后2小时和24小时，收集小鼠血清。用ELISA测定SAA的血清浓度，用基于Luminex的小鼠可溶性受体试验测定sgp130浓度。如图11和12所示，TRU(S6)-1002和TRU(XT6)1002阻断超级IL6诱导的sgp130和SAA的表达。
(b)阻断TNF活性
对雌性BALB/C小鼠眼窝后(retro-orbitally)注射0.2ml PBS，或者(200μg)、TRU(S6)-1002(200μg)或TRU(XT6)-1002(300μg)的PBS溶液。一小时后，对小鼠IP注射0.2ml PBS或0.5μg小鼠TNFα的PBS溶液。IP注射后2小时和24小时，收集小鼠血清。用ELISA测定SAA的血清浓度，用基于Luminex的小鼠可溶性受体试验测定sgp130浓度。如图13A和B所示，交叉受体TRU(XT6)-1002阻断TNF α-诱导的SAA表达，注射后2小时观察到的SAA水平类似于用观察到的水平。
实施例16
交叉受体体内活性
如下所述，在疾病动物模型中检测本文所述的交叉受体分子的疗效。
(a)多发性骨髓瘤
利用两种良好表征的多发性骨髓瘤小鼠模型，即5T2多发性骨髓瘤(5T2MM)模型和5T33多发性骨髓瘤(5T33MM)模型中的至少一种检测交叉受体分子的活性。在5T33模型中，从注射肿瘤细胞时开始用交叉受体治疗小鼠(预防模式)。在5T2MM模型中，从疾病开始时治疗小鼠(治疗模式)。在两种模型中评估治疗对肿瘤发生和血管新生的影响，还利用5T2MM模型进行骨研究。
5TMM骨髓瘤鼠模型最初由Radl等开发(J.Immunol.(1979)122：609；也参见Radl等，Am.J.Pathol.(1988)132：593；Radl，J.Immunol.Today (1990)11：234)。其临床特征与人类疾病非常类似：该肿瘤细胞位于骨髓，血清副蛋白浓度是疾病发生的衡量，在5T2MM和5T33MM模型中新血管形成增加(Van Valckenborgh等，Am.J.Pathol.(1988)132：593)，在某些品系中明确出现溶骨性骨病。5T2MM模型包括中等肿瘤生长和溶骨性骨损伤的形成。这些损伤与癌性骨体积减少、骨矿物质密度降低和破骨细胞数量增加相关(Croucher等，Blood(2001)98：3534)。5T33MM模型具有更为快速的肿瘤捕获量(tumor take)，除骨髓外，肿瘤细胞也在肝中生长(Vanderkerken等，Br.J.Cancer(1997)76：451)。
已经详细鉴定了5T2和5T33MM模型。产生针对5T2和5T33MM的独特型的特异性单克隆抗体，以便通过ELISA以最大灵敏度检测血清副蛋白，通过对组织切片进行FACS分析和免疫染色对肿瘤细胞进行特异性染色(Vanderkerken等，Br.J.Cancer(1997)76：451)。VH基因的序列分析使得能够通过RT-PCR和Northern印迹分析检测细胞(Zhu等，Immunol.(1998)93：162)。可用于体外和体内实验的5TMM模型产生典型的MM疾病，可使用不同方法评估骨髓中的肿瘤负荷量、血清副蛋白浓度、骨髓血管新生(通过测定微血管密度)和溶骨性骨损伤(利用X光照相、密度测定和组织形态测定的组合)。研究后面这些参数以便在临床前研究中使用5TMM模型，并在完整的同源微环境中研究骨髓瘤细胞的生长和生物学。可研究靶向MM细胞本身的分子和靶向骨髓微环境的分子。具体说，虽然可使用5T33MM模型研究微环境和MM细胞本身，但也可用5T2MM模型研究骨髓瘤相关性骨病。
为了研究本文所述交叉受体分子的预防效果，在第0天对C57BL/KaLwRij小鼠注射2x 106个5T33MM细胞和交叉受体。在第28天处死小鼠，通过测定血清副蛋浓度和肿瘤细胞占分离骨髓细胞的百分数评估肿瘤发育情况(通过利用抗独特型抗体的流式细胞术或细胞涂片测定)。将脾脏和肝脏称重，用4％甲醛固定这些器官以便进一步分析。固定骨样品以便进一步加工，包括在石蜡切片上进行CD31免疫染色和对微血管密度进行定量测定。
为了研究本文所述交叉受体分子的治疗功效，在第0天对小鼠注射5T2MM细胞，发病后给予交叉受体，通过是否存在可检测水平的血清副蛋白进行测定。给予交叉受体大约五周后处死小鼠，如上文预防研究中所述评估肿瘤发育情况。此外，用X射线进行骨分析，以确定骨损伤的数量和小梁骨面积，进行TRAP染色以评估破骨细胞数量。
(b)类风湿性关节炎
利用两种类风湿性关节炎(RA)鼠模型，即胶原诱导性关节炎(CIA)和葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)模型中的至少一种模型评估本文所述的交叉受体分子的治疗功效。其他人已证明，这些模型均可用于预测某类治疗性药物在RA中的功效(参见Holmdahl(2000)Arthritis Res.2：169；Holmdahl(2006)Immunol.Lett.103：86；Holmdahl(2007)Methods Mol.Med.136：185；McDevitt(2000)Arthritis Res.2：85；Kamradt和Schubert(2005)Arthritis Res.Ther.7：20)。
(i)CIA模型
就其发病和免疫基础而言，CIA模型是表征最好的小鼠关节炎模型。此外，它是最广泛采用的RA模型，虽然在预测药物抑制患者疾病的能力方面并不完美，但仍有许多人认为它是研究RA的潜在新治疗途径的很好的模型(Jirholt，J.等(2001)Arthritis Res.3：87-97；Van den Berg，W.B.(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4：232-239；Rosloniec，E.(2003)胶原诱导性关节炎(Collagen-Induced Arthritis).刊于《新编免疫学研究方法》(Current Protocolsin Immunology)，Coligan等编，新泽西州霍波肯的约翰韦利父子公司(JohnWiley&Sons，Inc，Hoboken，NJ))。
在CIA模型中，用完全弗氏佐剂(CFA)配制的胶原II(CII)免疫雄性DBA/1小鼠，以诱导关节炎。具体说，在第-21天对小鼠皮内/皮下注射CFA配制的CII，在第0天用不完全弗氏佐剂(IFA)配制的CII加强免疫。在用CII/IFA加强免疫后若干天内，小鼠出现关节炎的临床迹象。一小组用CII/IFA免疫的小鼠(0％-10％)未经加强免疫时，在第0天或第0天左右就出现关节炎迹象，从本实验中排除这些动物。在一些CIA实验中，省去加强免疫，而是在CII/CFA免疫后21天(即第一次处理之日是第0天)开始用交叉受体或对照处理小鼠。
利用交叉受体、载体(PBS)或者阴性或阳性对照，以预防和/或治疗方案处理小鼠。预防性处理从第0天开始，一直持续到对照(未处理)小鼠的疾病峰值后。治疗性处理从大部分小鼠出现轻微关节炎迹象时开始。已证明对CIA和G6PI诱导的关节炎模型有良好功效的用作阳性对照。在每个实验中采集的数据包括关节炎的临床评分和累积发病率。用0-4分来衡量CIA模型的临床关节炎迹象，如下表4所示：
表4.
(ii)G6PI模型
在G6PI模型中，用佐剂配制的G6PI免疫DBA/1小鼠以诱导关节炎(Kamradt，T和D.Schubert(2005)Arthritis Res.Ther.7：20-28；Schubert，D等(2004)J.Immunol.172：4503-4509；Bockermann，R.等(2005)Arthritis Res.Ther.7：R1316-1324；Iwanami，K.等(2008)Arthritis Rheum.58：754-763；Matsumoto，I.等(2008)Arthritis Res.Ther.10：R66)。G6PI是基本上所有体内细胞中存在的酶，但尚不清楚为什么免疫诱导特定关节的疾病。在G6PI模型中，许多药剂，如CTLA4-Ig、TNF拮抗剂(如)和抗-IL6受体单克隆抗体都能抑制关节炎的发生。
用完全弗氏佐剂(CFA)配制的G6PI免疫雄性DBA/1小鼠，以诱导关节炎。具体说，在第0天对小鼠皮内/皮下注射CFA配制的G6PI，在免疫数天内小鼠发生临床关节炎迹象。如同上述CIA模型那样，利用交叉受体、载体(PBS)或者阴性或阳性对照，以预防和/或治疗方案处理小鼠。预防性处理从第0天开始，一直持续到对照小鼠的疾病峰值后。治疗性处理从大部分小鼠出现轻微关节炎迹象时开始。已证明对CIA和G6PI诱导的关节炎模型有良好功效的用作阳性对照。在每个实验中采集的数据包括关节炎的临床评分和累积发病率。用类似于CIA模型所用的评分来评估G6PI模型的临床关节炎迹象。
(c)多囊性肾病
利用Gattone等，Nat.Med.(2003)9：1323-6；Torres等，Nat.Med.(2004)10：363-4；Wang等，J.Am.Soc.Nephrol.(2005)16：846-851；和Wilson(2008)Curr.Top.Dev.Biol.84：311-50所述的鼠模型测试交叉受体融合蛋白(优选含有TNF拮抗剂和TGFβ拮抗剂，如本文所述)在治疗多囊性肾病中的功效。
SEQ ID NO：1-1255参见所附序列表。所附序列所用的核苷酸序列中的编码(包括符号“n”)符合WIPO标准ST.25(1998)，附件2，表1。