大豆疫霉无毒基因Avr5的标记.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102220415 A (43)申请公布日 2011.10.19 CN 102220415 A *CN102220415A* (21)申请号 201110094880.X (22)申请日 2011.04.15 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 董莎萌 王源超 张正光 郑小波 (74)专利代理机构 北京知本村知识产权代理事 务所 11039 代理人 刘江良 周自清 (54) 发明名称 大豆疫霉无毒。

2、基因 Avr5 的标记 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 了 一 种 大 豆 疫 霉 菌 (Phytophthora sojae) 无 毒 基 因 Avr5 的 特 异 分子标记 CAPS-80316 和 CAPS-80295， 属于生物 技术领域。通过利用 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)分子标记技术， 对大豆疫 霉病菌两个亲本菌株 (P6497， P7064) 及其 94 个 杂交后代群体进行无毒基因分子标记的筛选和鉴 定 ； 获得 2 个与大豆疫霉无毒基因 Avr5 共分离的 分子标记。 本发明不仅可以研究无毒基因Avr5在 自然。

3、群体中的分布情况， 揭示大豆疫霉菌在田间 致病型分化变异的特点， 而且可以为克隆该无毒 基因、 并最终鉴定大豆抗疫霉菌基因 Rps5 提供便 利。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 2 页 CN 102220424 A1/1 页 2 1. 一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记引物， 其特征在于 ： 上游引物核 苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示， 下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。 2. 一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记引物， 。

4、其特征在于 ： 上游引物核 苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示， 下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。 3. 一种大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记方法， 其特征在于 ： 利用权利要求 1 所述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组 DNA， 对扩增产物用 ScaI 酶进行酶切， 如果仅获得 475bp 的片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组含 Avr5 的纯合体 ； 若获得 157bp 和 318bp 的两 种片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组不含有 Avr5 ； 若获得 157bp、 318bp 和 475bp 三种片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组是含有 Avr5 的杂合。

5、子。 4. 一种大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记方法， 其特征在于 ： 利用权利要求 2 所述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组 DNA， 对扩增产物用 EcoRI 酶进行酶切， 如果仅获得 373bp 的片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组含 Avr5 的纯合体 ； 若获得 150bp 和 217bp 的两 种片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组不含有 Avr5 ； 若获得 150bp、 217bp 和 373bp 三种片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组是含有 Avr5 的杂合子。 权 利 要 求 书 CN 102220415 A CN 102220424 A1/6 页 3 大豆疫霉无毒基因 。

6、Avr5 的标记 技术领域 0001 本发明涉及大豆疫霉无毒基因的标记， 具体涉及与大豆疫霉无毒基因 Avr5 紧密 联锁的两个分子标记基因 CAPS-80316 和 CAPS-80295， 以及在无毒基因标记过程中所用的 标记方法。 背景技术 0002 大豆疫霉菌属于鞭毛生物界卵菌门霜霉亚纲、 腐霉目、 腐霉科、 疫霉属 (Tyler， 2007). 疫霉属包含有 80 多个疫霉种， 很多种都是农业生产上重要的病原菌。与多数疫霉 种不同， 大豆疫霉菌的寄主范围非常窄， 主要侵染大豆， 此外仅能侵染羽扇豆属 (Lupinus spp.) 的几种植物。大豆疫霉菌侵染大豆， 引起幼苗的猝死和成株的。

7、根腐， 是世界范围内 大豆生产的主要威胁之一。每年给世界范围内的大豆生产造成直接经济损失高达十几 亿美元 (Tyler， 2007)。该病于 1948 年首次在美国的印地安那州发现， 而后相继在澳大 利亚、 加拿大、 巴西、 阿根廷、 日本、 意大利、 新加坡、 俄罗斯、 白俄罗斯、 乌克兰、 哈萨克斯 坦、 匈牙利、 德国、 英国、 法国、 瑞士、 新西兰、 埃及、 尼日利亚、 印度等国家都发现了该病害 (Schmitthenner， 1985 ； Wrather et al.， 2001)。我国 1989 年由沈崇尧和苏彦纯 (1991) 首 次在东北大豆主产区分离到该病原菌， 之后在黑龙。

8、江、 吉林、 北京、 山东、 安徽、 河南、 江苏、 浙江、 内蒙古、 湖北、 福建、 新疆、 四川、 天津和贵州 ( 苏彦纯等， 1993 ； 朱振东等， 2003 ； 徐静 静等， 2009 ； 唐庆华等， 2009) 等 15 个省 ( 市区 ) 也相继被报道分离鉴定到大豆疫霉菌。其 中在黑龙江和福建两省发生较为严重， 其他省份零星发生， 目前仍是我国重要的对外检疫 对象。 0003 在植物与卵菌的长期协同进化过程中， 卵菌为了成功侵染植物， 分泌大量效应分 子 (effectors) 到植物细胞的不同部位来破坏或延缓植物的防卫反应 (Birch et al.， 2006 ； Kamou。

9、n， 2006 ； Vleeshouwers et al.， 2008)。大量研究表明大部分卵菌病害的发生 符合 Flor 的 “基因对基因” 假说， 因此， 与很多植物病原细菌和真菌一样， 卵菌中也存在一 类效应分子可以被寄主植物的抗病基因产物 (R protein) 识别， 从而引发强烈的植物免疫 反应进而阻止病害的发生， 而编码这类效应分子的基因被称为无毒基因 (Avr gene)。卵菌 分泌的 Avr protein 与寄主植物的 R protein 之间的相互作用直接决定着卵菌病害的发 生， 因此， 围绕 Avr 基因的研究一直是卵菌病害研究的重点之一。以前， 卵菌 Avr 基因的研。

10、 究主要集中在 Avr 基因的鉴定以及分子标记上， 最近， 由于疫霉菌基因组序列的公布以及 基因枪等新技术的广泛使用， 十多个卵菌 Avr 基因陆续被克隆。目前， 已经克隆到的卵菌 Avr基因包括来自来Hyaloperonospora arabidopsis的ATR1NdWsB和ATR13 ； 自P.infestans 的 PiAvr3a、 PiAvr4、 PiAvrblb1 和 PiAvrblb2， 以及来自 P.sojae 的 PsAvr1b， PsAvr1a， PsAvr3a、 PsAvr3c和PsAvr4/6(Allen et al.， 2004 ； Shan et al.， 2004。

11、 ； Armstrong etal.， 2005 ； Rehmany et al.， 2005 ； van Poppel et al.， 2008 ； Vleeshouwers et al.， 2008 ； Dong etal.， 2009 ； Qutob et al.， 2009 ； Sang-Keun et al.， 2009 ； Dou et al.， 2010)。此外这些 Avr 基因在基因和基因组结构上的特征、 进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有 说 明 书 CN 102220415 A CN 102220424 A2/6 页 4 的毒性功能研究也成为研究热点。从卵菌无毒基因。

12、的克隆入手， 探索无毒基因的起源和进 化， 明确其在病菌致病过程中的功能， 了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理， 对于 近一步认识和防治该类病害具有重要意义。 0004 前人发现大豆疫霉菌无毒基因Avr5和Avr3a位于同一个连锁群上， 两者之间的遗 传距离为 4.5cM(May et al， 2002)。Avr3a 最近已经被克隆， 该基因编码一个长度为 112 氨 基酸的外泌蛋白， 这为进一步寻找无毒基因 Avr5 提供了线索。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、 快速鉴定大豆疫霉无毒基因 Avr5 的分子标记、 方法及其引物， 筛选获得与无毒基因 Avr5。

13、 紧密连锁的分子标记。 0006 本发明提供的技术方案是 ： 一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记 引物， 上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0007 一种大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记方法， 利用上述的引物扩增待测 大豆疫霉菌基因组 DNA， 对扩增产物用 ScaI 酶进行酶切， 如果仅获得 475bp 的片段， 表明待 测大豆疫霉菌基因组含 Avr5 的纯合体 ； 若获得 157bp 和 318bp 的两种片段， 表明待测大豆 疫霉菌基因组不含有 Avr5 ； 若获得 157bp、 318bp 。

14、和 475bp 三种片段， 表明待测大豆疫霉菌 基因组是含有 Avr5 的杂合子。 0008 本发明提供另一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记引物， 上游引 物核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示， 下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。 0009 本发明提供另一种大豆疫霉菌株中无毒基因 Avr5 的分子标记方法， 利用上述的 引物扩增待测大豆疫霉菌基因组 DNA， 对扩增产物用 EcoRI 酶进行酶切， 如果仅获得 373bp 的片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组含Avr5的纯合体 ； 若获得150bp和217bp的两种片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组不含有。

15、 Avr5 ； 若获得 150bp、 217bp 和 373bp 三种片段， 表明待 测大豆疫霉菌基因组是含有 Avr5 的杂合子。 0010 利用已经完成测序并公布的大豆疫霉菌基因组数据库 (http:/genome.jgi-psf. org/annotator/servlet/jgi.annotation.Annotation？pDbPhyso1_1)， 确定已知无毒 基因 Avr3a 在基因组数据库中的序列位置为 Scaffold_80 ： 300039-300374， Avr5 和 Avr3a 之间的遗传距离为 4.5cM。 0011 利 用 大 豆 疫 霉 菌 基 因 组 数 据 库。

16、 的 查 询 和 下 载 功 能， 下 载 Scaffold_80 ： 280000-320000 的 40kb 基因组区域内的核苷酸序列， 通过其网站找到基因间隔区 (Intergenic Region)， 并针对这些区域设计扩增长度为1000bp的引物并进行PCR扩增， 通 过 PCR 扩增从两个亲本菌株的基因组 DNA 分别纯化回收产物， 送公司测序。 0012 通过测序回来的结果， 利用 Lasergene 中的 Seqman 程序寻找序列的替代突变， 或 者插入 / 缺失突变位点， 再通过 SeqBuilder 软件寻找差异的酶切位点， 然后对先前对应的 PCR 产物进行酶切， 电泳。

17、确定差异片段从而获得优质 CAPS 分子标记。 0013 同时利用分别含有 Avr5 和不含有 Avr5 基因的大豆疫霉菌株杂交产生 F1 代杂合 子， 再自交产生 94 个 F2 代， 将这些 F2 代菌株接种到 L85-3059( 含 Rps5 抗病基因 ) 的大豆 上， 确定这些菌株的毒性， 同时利用已经获得的 CAPS 分子标记在 F2 代不同位点上进行标 记。 说 明 书 CN 102220415 A CN 102220424 A3/6 页 5 0014 综合致病性测定和 CAPS 标记结果对 F2 代表现型和基因型进行比较， 发现 CAPS-80316 和 CAPS-80295 两。

18、个分子标记和 Avr5 的表现型在 94 个 F2 代中是完全一致的， 从而确定这两个分子标记与该无毒基因 Avr5 紧密联锁。 0015 与现有的分子标记技术相比， 其优点和积极效果表现在 ： 0016 本发明不仅可以研究无毒基因 Avr5 在自然群体中的分布情况， 揭示大豆疫霉菌 在田间致病型分化变异的特点 ； 比较国内外大豆疫霉菌在此位点上的差异， 澄清中国大豆 疫霉群体起源于国外 ； 可以研究无毒基因Avr5及共同连锁的Avr3a无毒基因的起源、 进化、 变异的过程 ； 本发明确定的两个标记可以为克隆无毒基因 Avr5 提供良好的线索、 并最终鉴 定大豆抗疫霉菌基因 Rps5 提供科学。

19、帮助， 有助于科学家进行大豆抗病品种的选育。 附图说明 0017 图 1 ： CAPS-80316 和 CAPS-80295 分子标记的酶切图谱。 0018 图 2 ： CAPS-80295 在 R2(P6497) 菌株和 R7(P7064) 菌株中核苷酸序列的比对。 0019 图 3 ： CAPS-80316 在 R2(P6497) 菌株和 R7(P7064) 菌株中核苷酸序列的比对。 具体实施方式 0020 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明， 但并不是对本发明的限 制， 仅仅作示例说明。 0021 实施例 1 0022 1、 供试菌株 0023 大豆疫霉全基因组测序菌株 R。

20、2(P6497) 和 R7(P7064) 为 Mark Gijzen 研究员 ( 加 拿大农业部南方作物保护研究所 ) 馈赠， 由南京农业大学植病系真菌分子生物学实验室保 存。该两个菌株公开于 Qutob D， Tedman-Jones J， Dong S， Kuflu K， Pham H， et al.(2009) Copy number variation and transcriptional polymorphisms of Phytophthora sojaeRXLR effector genes Avrla and Avr3a.PLoS One 4 ： e5066。 菌株保存于10。

21、V8固 体培养基， 保存温度为 14。 0024 其中， R2 菌株系含有 Avr5 的纯合体， R7 菌株系不含有 Avr5 的纯合体。 0025 2、 设计 CAPS 标记 0026 利用大豆疫霉菌基因组数据库的查询和下载功能， 下载 Avr3a 所在区域 Scaffold_80 ： 280000-320000 的 40kb 基因组区域内的核苷酸序列， 通过其网站找到基因间 隔区 (Intergenic Region)， 并针对这些区域设计能扩增 1000bp 产物的引物并进行 PCR 扩 增， 通过 PCR 扩增从两个亲本菌株的基因组 DNA 分别纯化回收产物， 测序。通过测序结果， 利。

22、用 Lasergene 中的 Seqman 程序寻找序列的替代突变， 或者插入 / 缺失突变位点， 再通过 SeqBuilder 软件寻找差异的酶切位点， 然后对先前对应的 PCR 产物进行酶切， 电泳确定差 异片段从而获得如表1所示优质CAPS分子标记及引物。 CAPS-80316的标记引物其上游引物 核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 CAPS-80295标 记的引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， 下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示。 CAPS-80295标记在R2(P6497)菌株中的核苷酸序列如S。

23、EQID NO.5所示， 在R7(P7064) 菌株中的核苷酸序列如 SEQ ID NO.6 所示 ； CAPS-80316 标记在 R2(P6497) 菌株中的核苷酸 说 明 书 CN 102220415 A CN 102220424 A4/6 页 6 序列如 SEQ ID NO.7 所示， 在 R7(P7064) 菌株中的核苷酸序列如 SEQ ID NO.8 所示。 0027 表 1 0028 0029 0030 3、 供试大豆幼苗的准备 0031 鉴别寄主大豆播种于装有蛭石(d2-4mm)的塑料花盆(d10cm)中， 每盆种12 粒种子， 放入 24-28、 14h 光照 ( 强光照射 。

24、)/10h 黑暗的温室中生长， 7 天后两片真叶长出 但未展开， 间苗使每盆 10 颗幼苗并充分浇水用于接种。所用大豆鉴别寄主 L85-3059 由加 拿大农业部南方作物保护研究所 Mark Gijzen 实验室提供， 感病对照品种为 Williams。 0032 4、 大豆疫霉菌致病性的测定 0033 采用下胚轴伤口接种法 (Qutob et al， 2009)， 测定大豆疫霉菌株对鉴别寄主的毒 性。大豆疫霉菌株在 LBA 平板上黑暗 25培养 7 天， 之后切成 2mm3mm 的小块作为接种 体 ； 用解剖刀在大豆幼苗的子叶下1cm处向下划约0.5cm长的伤口， 然后将接种体菌丝面朝 内贴。

25、在伤口处。接种后保湿 12h， 然后放入 24-28、 14h 光照 ( 强光照射 )/10h 黑暗的温室 中， 5 天后调查结果。每个鉴别寄主接种 10 株， 以植株死亡率作为抗感的分类标准， 植株死 亡率30， 记为抗病(A) ； 植株死亡率70， 记为感病(V) ； 植株死亡率在30-70之 间， 记为中间类型 (I)(Ryley et al.， 1998)。致病性试验结果重复 3 次。 0034 5、 基因组 DNA 的提取 0035 采 用 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 法 提 取 大 豆 疫 霉 基 因 组 DNA(Doyle&Doyle。

26、， 1987)， 具体操作如下 ： 0036 (1) 取大约 50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于 1.5ml EP 管中， 加入 900l 2 CTAB( 十六烷基三甲基溴化铵 ) 提取液 (2 CTAB ； 100mmol/L Tris-HCl， PH 8.0 ； 20mmol/ L EDTA， PH8.0 ； 1.4mol/L NaCl) 和 90l 10 SDS( 十二烷基苯磺酸钠 ) 后漩涡混合器上 充分混匀 ； 0037 (2)55-60水浴 1h， 每 15min 振荡混匀一次 ； 0038 (3)12000rpm/min 离 心 10min， 取 上 清 液， 加 等 体 积 的 酚。

27、 氯 仿 异 戊 醇 (25 24 1) 提 1 次 ； 0039 (4)12000rpm/min 离心 10min， 吸取上清液， 加等体积氯仿抽提 1 次 ； 0040 (5)12000rpm/min 离心 10min， 吸取上清液， 加 0.1 体积的 3MNaAC 溶液和 2 体 积的冰无水乙醇过夜沉淀基因组 DNA ； 0041 (6) 用预冷的 70乙醇洗涤两次， 然后置 37下干燥 ； 0042 (7) 干燥后的 DNA 用 40l 1TE(10mmol/L Tris-HCL， 0.1mmol/L EDTA， PH8.0) 说 明 书 CN 102220415 A CN 1022。

28、20424 A5/6 页 7 溶解后 (TE 中含 50g/ml RNase)， 于 37静置 1h 降解 RNA ； 0043 (8) 取 2l DNA 样品在 1的 Agarose 胶上电泳， 紫外分光光度计检测 DNA 浓度 和纯度， 并稀释至约 25ng/l 后 -20冰箱中备用。 0044 6、 PCR 扩增和酶切检测 0045 采用含 CAPS 标记 CAPS-80316 和 CAPS-80295 的两对 CAPS 分子标记引物扩增获得 的分子标记在两个亲本中进行与无毒基因 Avr5 连锁标记的筛选。CAPS 标记的 PCR 反应体 系为 ： 反应总体积 25ul， 其中 2.5u。

29、l PCR Buffer， 0.5ul Mg2+， 两条引物 ( 各 0.25ul)， rTaq 酶 (TAKARRA)0.1ul， dNTP 0.4ul， 基因组模板 0.1-0.5ng， ddH2O 为 20ul. 具体反应程序为 ： 98 30s， 58 30s， 72 40s， 扩增 35 个循环。取 5ul PCR 产物， 加入内切酶 0.2ul， 酶切 Buffer 1ul， ddH2O 为 3.8ul， 37反应 2 个小时， 取产物 5ul 上样于 0.8的琼脂糖胶电泳 分析。 0046 通过筛选获得两个 CAPS 分子标记 ： CAPS-80316 和 CAPS-80295。。

30、以疫霉菌基因 组 DNA 为模板和 CAPS-80316 的一对引物扩增结果为 475bp， 用 ScaI 酶切 R2 产物仍然获 得 475bp 片段， 酶切 R7 产物获得 157bp 和 318bp 的两种片段， 酶切杂合子产物获得 157bp、 318bp 和 475bp 三种片段 ( 见图 1)。以疫霉菌基因组 DNA 为模板和 CAPS-80295 的一对引 物扩增结果为 373bp， 用 EcoRI 酶切 R2 产物仍然获得 373bp 片段， 酶切 R7 产物获得 150bp 和 217bp 的两种片段， 酶切杂合子产物获得 150bp、 217bp 和 373bp 三种片段 。

31、( 见图 1)。 0047 以上结果说明两个分子标记CAPS-80316和CAPS-80295的电泳图谱与大豆疫霉菌 是否携带 Avr5 的表现型， 完全匹配。与 R2 一样说明是含有 Avr5 的纯合体， 与 R7 一样说明 是不含有 Avr5 的纯合体， 与 F1 一样说明是含有 Avr5 的杂合体。 0048 实施例 2 0049 为进一步验证上述CAPS标记， 对来源于R2(P6497)和R7(P7064)的有性交配的F1 和 F2 后代进行检测。 0050 1、 大豆疫霉 F1 后代的产生 0051 F1 后代来源于 R2(P6497) 和 R7(P7064) 的有性交配 ： 分别将。

32、两种菌丝切 5mm 的小 块放在同一块含 2.5 (v/v)V-8 和 10g/ml -sitosterol 的琼脂平板上， 25黑暗生 长至少 30 天挑取单卵孢子， 提取单卵孢子基因组 DNA， 用 CAPS 标记确认是杂合子。将杂合 子F1代菌丝切5mm的小块放在含2.5(v/v)V-8和10g/ml -sitosterol的琼脂平板 上。 0052 2、 大豆疫霉菌 F2 的获得和致病性测定 0053 将 F1 代自交产生 F2 代， 随机挑选 94 个 F2 后代菌株并按照顺序 1-94 排列编号， 94 个 F2 后代菌株接种到不含任何抗病基因的 Williams 大豆品种上都能够。

33、致病， 说明后代 致病力没有受到影响。接种到含有抗病基因 Rps5 的大豆品种 L85-3059 上发现有 69 个不 能够致病， 25 个能够致病， 进一步说明 Avr5 是一个单显基因控制。 0054 3、 F2 中 CAPS-80316 和 CAPS-80295 标记和 Avr5 的表现型相吻合 0055 分别提取了 1-94 号 F2 后代菌株的基因组 DNA。以 R2 和 R7 亲本菌株和 F1 代杂合 子为对照， 将每一个 F2 后代菌株的基因型 (CAPS-80316 和 CAPS-80295 标记类型 ) 和表现 型 ( 在含抗性基因 Rps5 的大豆 L85-3059 上的毒。

34、性 ) 进行了比对， 发现 69 个不能够致病的 F2 代菌株的 CAPS-80316 和 CAPS-8029 两个标记均显示为 R2 或者 H(F1 杂合子 ) 类型， 25 说 明 书 CN 102220415 A CN 102220424 A6/6 页 8 个能够致病的 F2 代菌株的 CAPS-80316 和 CAPS-8029 两个标记均显示为 R7 类型， 以上数据 说明 CAPS-80316 和 CAPS-80295 标记与无毒基因 Avr5 是紧密连锁的。 说 明 书 CN 102220415 A CN 102220424 A1/4 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102220415 A CN 102220424 A2/4 页 10 0003 序 列 表 CN 102220415 A CN 102220424 A3/4 页 11 0004 序 列 表 CN 102220415 A CN 102220424 A4/4 页 12 序 列 表 CN 102220415 A CN 102220424 A1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102220415 A CN 102220424 A2/2 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 102220415 A 。