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1、(10)授权公告号 CN 102220299 B (45)授权公告日 2013.03.13 CN 102220299 B *CN102220299B* (21)申请号 201110102026.3 (22)申请日 2011.04.22 C12N 9/18(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/84(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (73)专利权人 中国科学院成都生物研究所 地址 610041 四川省成都市人民南路四段九 号 (72)发明人 吴中柳 张帅兵 裴小琼 刘艳 (74)专利代理机构 成都赛恩斯知识产权代理事 务所 ( 普通合伙。
2、 ) 51212 代理人 肖国华 (54) 发明名称 一种阿魏酸酯酶 A 突变体及其用途 (57) 摘要 本发明属于基因工程和酶工程技术领域， 具 体涉及一种阿魏酸酯酶 A 突变体及其用途。本发 明利用易错 PCR 对阿魏酸酯酶 A 母本基因随机突 变， 构建随机突变文库， 通过高通量筛选体系筛选 出 12 个耐热性提高的阿魏酸酯酶 A 突变体位点， 并通过全序列合成方法将这 12 个突变位点整合 到一条编码序列上， 获得组合突变体。 该组合突变 体比母本的热稳定性有极大提高， 显示出在生物 能源、 饲料、 造纸、 保健食品， 医药等工业中潜在的 应用价值。 (51)Int.Cl. 审查员 刘。
3、贺 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 20 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 20 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种阿魏酸酯酶 A 突变体， 其特征在于 ： 以 SEQ ID NO.2 所示的阿魏酸酯酶 A 氨基 酸序列为基础， 经突变后在以下位点发生了突变的氨基酸序列 ： 第 235 位的半胱氨酸突变 为丝氨酸。 2. 一种阿魏酸酯酶 A 突变体， 其特征在于 ： 将权利要求 1 所述的突变体的第 14 位的亮 氨酸突变为苯丙氨酸、 第 35 位的苏氨酸突变为异亮氨酸、 第 37 位的赖。
4、氨酸突变为异亮氨 酸、 第 57 位的苏氨酸突变为异亮氨酸、 第 63 位的苏氨酸突变为异亮氨酸、 第 121 位的谷氨 酰胺突变为组氨酸、 第 140 位的丙氨酸突变为苏氨酸、 第 163 位的丝氨酸突变为苏氨酸、 第 177位的谷氨酰胺突变为组氨酸、 第178位的缬氨酸突变为丙氨酸和第185位的谷氨酰胺突 变为精氨酸。 3. 一种阿魏酸酯酶 A 突变体蛋白的获取方法， 其特征是将权利要求 1 或 2 所述的阿魏 酸酯酶A突变体的基因连入pPIC9K或pGAPZA载体， 并在宿主菌Pichiapastoris KM71 中表达， 获得突变体酶蛋白。 4. 权利要求 2 所述的阿魏酸酯酶 A 。
5、突变体在半纤维素降解中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102220299 B 2 1/7 页 3 一种阿魏酸酯酶 A 突变体及其用途 技术领域 0001 本发明属于基因工程和酶工程技术领域， 具体涉及一种阿魏酸酯酶 A 突变体及其 用途。 背景技术 0002 阿魏酸酯酶 （EC 3.1.1.73) 是能水解存在于植物细胞壁中的羟基肉桂酸类化合 物、 阿拉伯木聚糖与某些胶质之间的酯键， 是半纤维素完全降解所需的关键酶之一。其 中来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶 A 是目前研究最多的阿魏酸酯酶之一， 人们对其在底物作 用范围， 内源表达调控以及在毕赤酵母和大肠杆菌中表达方面作了大量研究。阿魏酸酯 酶 。
6、A 在生物能源、 饲料、 造纸、 保健食品、 医药等行业具有较大应用潜力。在酶的工业应 用中， 热稳定性是一个重要的参数。高稳定性的酶高温下反应可以提高反应速率和反应 物的溶解量， 减少酶投入量等， 从而降低成本 (L.Viikari,et al.Thermostable Enzymes in Lignocellulose Hydrolysis.Adv Biochem Eng Biotechnol 108(2007)121-145） 。 蛋白质定向进化技术是体外改良蛋白质性质的重要手段， 过去十年间人们成功地利用该 技术改造了上百种蛋白质的性质 （J.D.Bloom,F.H.Arnold.In。
7、 the light of directed evolution:Pathways of adaptive protein evolution.PNAS 106(2009)9995-10000） 。 同时， 理性设计手段也广泛应用于酶的改造中 (Vincent G.H.Eijsink,et al.Rational engineering of enzyme stability.J Biotech 113(2004)105-120)。目前生产上应用的 阿魏酸酯酶主要来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶 A， 但是其热稳定性仍然不理想。应用现有技 术， 进一步改造阿魏酸酯酶 A， 提高其热稳定性， 将推动该酶。
8、在相关领域的更广泛应用。 发明内容 0003 本发明利用易错 PCR 技术对来源于黑曲霉 （Aspergillus niger） 的阿魏酸酯酶 A 进行分子改良， 从而获得热稳定性提高的阿魏酸酯酶 A 突变酶。 0004 为了达到以上目的， 在前期已获得的母本基础上， 经一轮易错 PCR 对母本基因随 机突变， 建立突变文库， 通过高通量筛选体系筛选出 12 个耐热性提高的阿魏酸酯酶 A 突变 体位点， 并通过全序列合成方法将这 12 个突变位点整合到一条编码序列上， 获得组合突变 体 （命名为 ： CV-FAEA） ， 其热稳定性得到很大提高。 0005 本发明通过如下方式来实现 ： 000。
9、6 随机突变文库的构建和筛选 ： 我们已报道了黑曲霉 （Aspergillus niger CIB423.1）中克隆的编码 260 个氨基酸残基的阿魏酸酯酶 A 编码序列 (EMBL accession number ： FJ430154)， 并利用 PoPMuSiC 在线工具对其进行计算机辅助设计获得了耐热 性提高了的阿魏酸酯酶 A， 暂命名为 FAEA-D93G/S187F（见 SEQ ID NO.1） ， 该突变体作 为 下 述 基 因 操 作 的 母 本 （S.-B.Zhang,and Z.-L.Wu,Identification of amino acid residues resp。
10、onsible for increased thermostability of feruloyl esterase A from Aspergillus niger using the PoPMuSiC algorithm.Bioresour.Technol.102（2011） 说 明 书 CN 102220299 B 3 2/7 页 4 2093-2096） 。 0007 采取易错 PCR 方法对编码母本 FAEA-D93G/S187F 的基因进行随机突变， 以 pPIC9K 载体构建高效突变库， 再将含有突变基因的重组质粒转入毕赤酵母 （Pichia pastoris KM71） 中， 。
11、挑取突变子单克隆以及母本对照菌株于 96 孔板中培养并诱导阿魏酸酯酶 A 表 达。将酶表达后的菌液离心， 取部分上清液以 2- 氯对硝基苯酚为底物， 反应适当时间测定 酶活。 同时， 另取相同体积的上清液热处理一定时间， 以相同的方法测定残余酶活性。 然后， 将残余活性高于对照的菌株转接到新的 96 孔培养板中进行重复筛选。培养耐热性提高的 突变酶重组菌， 提取其基因组， 并用 PCR 技术获得其相应的突变阿魏酸酯酶 A 的基因， 送上 海英骏生物技术公司测序。详细方案见实施例 2。 0008 经上述随机突变库构建和筛选， 获得了 12 个由单个氨基酸残基的突变引起耐热 性有不同程度提高的阿魏。
12、酸酯酶 A 突变体， 分别将其命名为 ： Z1、 Z2、 Z3、 Z4、 Z5、 Z6、 Z7、 Z8、 Z9、 Z10、 Z11、 Z12， 序列信息见 SEQ ID NO.3NO.14， 其特征如下 ： 0009 Z1 ： 该酶的第 177 位的谷氨酰胺突变为组氨酸 ； DNA 序列由 CAG 变为 CAT。 0010 Z2 ： 该酶的第 63 位的苏氨酸突变为异亮氨酸 ； DNA 序列由 ACC 变为 ATC。 0011 Z3 ： 该酶的第 140 位的丙氨酸突变为苏氨酸 ； DNA 序列由 GCA 突变为 ACA。 0012 Z4 ： 该酶的第 235 位由半胱氨酸突变为丝氨酸 ； D。
13、NA 序列由 TGT 突变为 AGT。 0013 Z5 ： 该酶的第 57 位由苏氨酸突变为异亮氨酸 ； DNA 序列由 ACC 突变为 ATC。 0014 Z6 ： 该酶的第 178 位由缬氨酸突变为丙氨酸 ； DNA 序列由 GTC 突变为 GCC。 0015 Z7 ： 该酶的第 14 位由亮氨酸突变为苯丙氨酸 ； DNA 序列由 TTA 突变为 TTC。 0016 Z8 ： 该酶的第 163 位由丝氨酸突变为苏氨酸 ； DNA 序列由 AGC 突变为 ACC。 0017 Z9 ： 该酶的第 37 位由赖氨酸突变为异亮氨酸 ； DNA 序列由 AAA 突变为 ATA。 0018 Z10 ：。
14、 该酶的第 121 位由谷氨酰胺突变为组氨酸 ； DNA 序列由 CAG 突变为 CAC。 0019 Z11 ： 该酶的第 185 位由谷氨酰胺突变为精氨酸 ； DNA 序列由 CAG 突变为 CGG。 0020 Z12: 该酶的第 35 位由苏氨酸突变为异亮氨酸 ； DNA 序列由 ACT 突变为 ATT。 0021 12 个位点的整合 ： 通过全序列基因合成整合以上 12 个突变位点， 将合成的基因片 段连入 pGAPZA 载体并在毕赤酵母 （Pichia pastoris KM71） 中表达 （组合突变体阿魏酸 酯酶 A， 命名为 CV-FAEA， 氨基酸序列见 SEQ ID NO.15。
15、） 。母本和 CV-FAEA 纯化后做耐热性 比较发现， 与母本相比， 整合了12个突变位点的突变体CV-FAEA的热耐受性有了极大提高。 如母本在 55 C 处理 15 分钟时， 其酶活性就丧失了一半， 而 CV-FAEA 在 55 C 下处理 4000 分钟后仍保持 90% 以上的酶活性。需要指出的是， C235S 突变位点 （Z4） 在 50-90 C 温度 下处理一个小时能保持 50% 以上残余活力， 其对组合突变体 CV-FAEA 耐热性提高有很大贡 献。阿魏酸酯酶 A 突变体耐热性的显著提高显示了该酶在生物能源、 饲料、 造纸、 保健食品、 医药等行业潜在的应用价值。 附图说明 0。
16、022 图 1 为母本阿魏酸酯酶 A 和组合突变体 CV-FAEA 的耐热性比较。其中， 为母本 阿魏酸酯酶 A 的酶活变化曲线 ； 为组合突变型阿魏酸酯酶 A 的酶活变化曲线。T 为温度， Y 为残余酶活力。 说 明 书 CN 102220299 B 4 3/7 页 5 具体实施方式 0023 以下结合实施实例对本发明做进一步说明， 需要指出的是， 本实施例仅用于解释 本发明， 而非对本发明范围的限制。 0024 实施例 1 易错 PCR(errorprone PCR) 方法构建阿魏酸酯酶文库 0025 利用II Random Mutagenesis kit 对阿魏酸酯酶基因 ( 见 SEQ。
17、 ID NO.1) 进行随机突变。 0026 所用引物为 ： faeA-F ： 5 taggaggt gaattc gcctccacgcaaggcatctc-3 0027 faeA-R ： 5 taggaggt gcggccgc ttaccaagtacaagctccgctcg-3 0028 反应条件为 ： 94 C 预变性 5min， 94 C 变性 30s， 61 C 退火 1min 和 72 C 延 伸 1min， 共 25 个循环， 电泳后回收基因片段。 0029 将回收片段用 NotI 和 EcoRI 双酶切， 与经过相同酶切的 pGAPZA 载体 （含有博莱 霉素抗性基因） 进行连接。
18、反应。双酶切消化后的 pGAPZA 载体和目的基因片段的摩尔量 比 1 3 混合后， 加入 600 个单位的 T4连接酶， 16 C 连接过夜。然后将连接产物用酚 / 氯仿抽提两次， 离心， 浓缩连接产物并用 ddH2O 溶解后， 电击法转入大肠杆菌 DH5， 得到约 5104个克隆的一级突变库。收集一级突变库平板上的菌落培养 2-3 小时后提取质粒， 用 NotI 和 EcoRI 双酶切回收的目的片段， 与经过相同酶切的 pPIC9K 载体 （含有氨苄青霉素抗 性基因） 进行连接反应， 连接产物浓缩、 转化等操作均和一级突变库构建方法一致。最后得 到约 5104个克隆的二级突变库。 0030。
19、 实施例 2 阿魏酸酯酶突变体库的筛选 0031 将实施例1中二级突变库克隆收集后提取质粒并经PmeI内切酶线性化后， 电击转 化毕赤酵母 （Pichia pastoris KM71） 感受态细胞并涂布 MD 平板 （1.34%YNB， 410-5% 生物 素， 2% 葡萄糖） 。培养 2 天后， 挑取单克隆于 96 孔板， 每孔含有 150l BMGY 培养基 （含有 100mM、 pH 值 6.0 的磷酸钾缓冲液， 2% 胰蛋白胨， 1% 酵母提取物， 1% 甘油， 4x10-5% 生物素） ， 30C， 280rpm， 震荡培养2天。 用96孔板复制器复制各单克隆于MD固体培养基平板， 。
20、30C 培养 2 天后存放于 4 C 冰箱中。离心 96 孔板培养物后移出上清液， 并加入 150l BMMY （培养基成分中除了用 0.5% 甲醇代替 1% 甘油外， 其他成分和 BMGY 相同） ， 然后于 30 C， 280rpm 摇床中震荡培养 36 小时， 诱导阿魏酸酯酶表达。离心， 用排枪轻轻吸出 96 孔板各 孔中的上清液， 按相应位置分别加入 20l 上清液于两块 96 孔板中。一块装有 20l 上清 液的 96 孔板加入 180l 反应液 （0.85 倍体积的含 2.5%TritonX-100 的 100mM、 pH 6.4 的 磷酸钠缓冲液和 0.05 倍体积的含有 20m。
21、M 2- 氯对硝基苯酚底物的二甲基亚砜溶液混合而 成） ， 40 C 反应 15min。另一块装有 20l 上清液的 96 板置于 63 C 烘箱， 30min 处理后 迅速放置在 4 C 快速降温。如上述反应以测定突变体残余活性。残余活性比母本残余活 性高的菌株挑到新的 96 孔培养板中进行重复筛选。筛选到 27 个突变体， 残余活性是母本 对照的 2-5 倍不等 （见表 1） 。培养这些突变酶重组菌， 提取其基因组， 并用 PCR 技术获得其 相应的突变阿魏酸酯酶基因， 送上海英骏生物技术公司测序。对 27 个耐热性提高的阿魏酸 酯酶A突变体编码序列测序结果分析后， 确定突变酶热稳定的提高。
22、是由12个氨基酸突变引 起的。12 个单点突变体分别命名为 ： Z1、 Z2、 Z3、 Z4、 Z5、 Z6、 Z7、 Z8、 Z9、 Z10、 Z11、 Z12， 其具 体特征见本说明书发明内容部分。 0032 实施例 3 阿魏酸酯酶突变位点的整合 说 明 书 CN 102220299 B 5 4/7 页 6 0033 将以上获得的 12 个突变位点整合到一条核苷酸编码序列上并由上海生工生物技 术服务有限公司合成全序列。为了方便后续蛋白纯化， 将合成的全序列用 NotI 和 EcoRI 双 酶切回收目的片段， 连入经过相同酶切的 pGAPZA 载体 （含有博莱霉素抗性基因） 中 （连接 方法。
23、如实施例 1） 。将连接产物转化大肠杆菌 DH5， 挑取转化子培养并提取重组质粒。将 质粒用 BspHI 内切酶线性化后， 转化毕赤酵母 （Pichia pastoris KM71） 感受态细胞， 涂布 含有 100g/ml 的博莱霉素的 YPDS 培养基 ( 含有 2% 胰蛋白胨， 1% 酵母提取物， 2% 葡萄糖， 1M 山梨醇 ) 中， 30 C 培养 3 天。挑取单克隆于 YPD 培养基 （除不含有 1M 山梨醇外， 培养基 成分与 YPDS 培养基相同） 中培养 2 天以表达该组合突变体酶。 0034 实施例 4 母本和 12 个单点突变的阿魏酸酯酶 A 粗酶液的热稳定测定 0035。
24、 将表达母本和 12 个单点突变的阿魏酸酯酶 A 的单克隆分别挑到 25ml 的 BMGY 培 养基中培养两天后离心弃上清， 用 BMMY 培养基重悬菌体。0.5% 甲醇诱导表达两天后， 取培 养物上清于 55 C 温度下分别测定母本和除 Z4 突变酶外的其他 10 个单点突变的阿魏酸 酯酶 A 突变体的半失活时间 （t1/2） ； 而 Z4 突变酶于 90 C 温度下处理并测定其半失活时间 （t1/2） 。培养方法和酶活测定方法如实施例 2。实验结果见表 1。 0036 表 1 母本阿魏酸酯酶 A 以及单点突变体 t1/2测定 0037 0038 * 注解 ： Z4 突变酶的热稳定性于 90。
25、 C 温度下处理 10 分钟。 0039 实施例 5 母本和组合突变型阿魏酸酯酶 A 的纯化以及热稳定性 0040 5.1 母本和组合突变体 CV-FAEA 的纯化 0041 将同样转化到毕赤酵母 （Pichia pastoris KM71） 的母本和组合突变体 CV-FAEA 在 YPD 培养基中培养 2 天以表达蛋白。然后离心取上清， 并用 200mM， pH 8.0 的 Tris-HCl 说 明 书 CN 102220299 B 6 5/7 页 7 缓冲液调其 pH 为 8.0， 然后通过 Bio-Scale Mini UNOsphere Q 阴离子交换柱 (Bio-Rad， Hercu。
26、les， CA， USA) 分离纯化目的蛋白。对纯化蛋白质的酶活测定方法如实施例 2 所述。 0042 5.2 母本和组合突变体 CV-FAEA 的热稳定性 0043 将纯化后蛋白浓度为 118.5g/ml， pH 6.4 的母本以及组合突变体 CV-FAEA 酶液 50l 置于 200l 离心管中， 每个样品 3 个重复， 在 PCR 仪中不同温度下处理 15min， 迅速 放置冰上冷却。取 20l 酶液在 96 孔板中测定残余活性 （如实施例 2 所述） 。与未经过高 温处理的酶液比较， 得到残余酶活百分比。 结果显示 ： 组合突变体CV-FAEA的热稳定性比母 本有显著提高， 母本在 5。
27、5 C 处理 15min 后即丧失了 50% 活力， 而组合突变体在同样条件 下的酶活基本没有降低 ； 母本在 70 C 处理 15min 后基本没有残余活性， 而组合突变体在 99 C 处理 15min 后仍保持 60% 以上的活力 （结果见说明书附图） 。 0044 实施例 6 组合突变型阿魏酸酯酶 A 的表征以及应用实例分析 0045 组合突变型阿魏酸酯酶 A 是在母本阿魏酸酯酶 A 的基础上由 12 个氨基酸替换产 生的， 其氨基酸序列及蛋白质结构未发生重大变化。对母本及组合突变型的阿魏酸酯酶 A 的底物分析表明它们具有相同的底物谱。根据阿魏酸酯酶 A 的分类原则 (V.F.Crepi。
28、n， et al.Functional classification of the microbial feruloyl esterases.Appl. Microbiol.Biotechnol.63(2004)647-652.), 组合突变型阿魏酸酯酶 A 仍属于阿魏酸酯酶 A。 0046 用 来 源 嗜 热 脂 肪 土 芽 孢 杆 菌 的 木 聚 糖 酶 突 变 体 （Zhang Zhi-gang， et al.Improving the thermostability of Geobacillus stearothermophilus xylanase XT6 by directed e。
29、volution and site-directed mutagenesis.Bioresource Technology 101(2010)92729278） 分别与母本阿魏酸酯酶 A 和组合突变型阿魏酸酯酶 A 于 55 C 条 件下水解玉米秸秆 1 小时， 木聚糖酶突变体和组合型阿魏酸酯酶 A 的反应体系比木聚糖酶 突变体与母本阿魏酸酯酶A的反应体系中的阿魏酸的释放量要高10倍以上， 其反应体系为 0.1mg 木聚糖酶突变体粗酶和 0.1mg 母本阿魏酸酯酶 A 或组合突变型阿魏酸酯酶 A 和含有 2g 处理后的玉米秸秆混合与 50ml pH6.4 的 100mM 磷酸钠缓冲液。这可能是。
30、由于母本阿魏 酸酯酶 A 在 60 C 条件下很快失活有关。此结果也说明组合突变型阿魏酸酯酶 A 的热稳定 性提高有利于其在相关领域的应用。 0047 SEQ ID NO.1（野生型阿魏酸酯酶 A 的编码序列） ： 0048 GCCTCCACGCAAGGCATCTCCGAGGACCTCTACAATCGCTTAGTAGAGATGGCCACTATCTCTCAAGCC GCCTACGCCGACCTATGCAATATTCCATCGACTACTATCAAAGGAGAGAAAATTTACAACGCTCAAACTGATATCAA CGGATGGATCCTCCGCGACGACACCAGCAAAGAAATTAT。
31、CACCGTCTTCCGTGGCACTGGCAGTGACACAAACCTAC AGCTCGATACTAACTACACGCTCACGCCATTCGAAACTCTACCTCAATGCAGCGGTTGCGAGGTACACGGTGGATAC TATATTGGATGGATCTCAATCCAAGACCAAGTCGAGTCGCTTGTCAAACAACAGGCTAGCCAGTATCCGGACTATGC GCTTACCATGACAGGCCATAGTCTGGGAGCGTCGATGGCAGCACTCACTGCCGCCCAGCTGTCCGCGACATACGACA ACGTCCGCCTGTACACTTTCGGCGAAC。
32、CGCGCAGCGGCAACCAGGCCTTCGCGTCGTACATGAACGATGCGTTCCAG GTCTCGAGCCCGGAGACGACCCAGTACTTCCGGGTCACTCATTCCAACGACGGCATCCCAAACTTGCCCCCGGCGGA GCAGGGTTACGCCCATGGCGGTGTAGAGTACTGGAGCGTTGATCCTTACAGCGCCCAGAACACGTTTGTCTGTACTG GGGATGAAGTACAGTGCTGTGAGGCACAGGGCGGACAGGGTGCGAATGATGCGCATACTACTTATTTTGGGATGACG AGCGGAGCTTGTACT。
33、TGGTAA 说 明 书 CN 102220299 B 7 6/7 页 8 0049 SEQ ID NO.2（母本阿魏酸酯酶 A 氨基酸序列） 0050 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSA。
34、QN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGANDAHTTYFGMTSGACTW 0051 SEQ ID NO.3 ： (Z1) 0052 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFKTLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFHVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVC。
35、TGDEVQCSEAQGGQGANDAHTTYFGMTSGACTW 0053 SEQ ID NO.4 ： (Z2) 0054 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIIIVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQC。
36、CEAQGGQGANDAHTTYFGMTSGACTW 0055 SEQ ID NO.5 ： (Z3) 0056 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTS SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMATLTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQ。
37、GANDAHTTYFGMTSGACTW 0057 SEQ ID NO.6 ： (Z4) 0058 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCSEAQGGQGANDAHT。
38、TYFGMTSGACTW 0059 SEQ ID NO.7 ： (Z5) 0060 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDISKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGANDAHTTYFGMTS。
39、GACTW. 0061 SEQ ID NO.8 ： (Z6) 0062 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQASSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGANDAHTTYFGMTSGACTW 。
40、0063 SEQ ID NO.9 ： (Z7) 0064 ASTQGISEDLYNRFVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN 说 明 书 CN 102220299 B 8 7/7 页 9 TFVCTGDEVQCCEA。
41、QGGQGANDAHTTYFGMTSGACTW 0065 SEQ ID NO.10 ： (Z8) 0066 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRTGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGA。
42、NDAHTTYFGMTSGACTW 0067 SEQ ID NO.11 ： (Z9) 0068 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIIGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGANDAHTT。
43、YFGMTSGACTW 0069 SEQ ID NO.12 ： (Z10) 0070 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASHYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGANDAHTTYFGMT。
44、SGACTW 0071 SEQ ID NO.13 ： (Z11) 0072 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTTIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTRYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGANDAHTTYFGMTSGACT。
45、W 0073 SEQ ID NO.14 ： (Z12) 0074 ASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTIIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASQYPDYALTMTGHSLGASMAALTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCCEAQGGQGANDAHTTYFGMTSGACTW 007。
46、5 SEQ ID NO.15（组合突变体阿魏酸酯酶 A 氨基酸序列） 0076 ASTQGISEDLYNRFVEMATISQAAYADLCNIPSTIIIGEKIYNAQTDINGWILRDDISKEIIIVFRGTG SDTNLQLDTNYTLTPFETLPQCSGCEVHGGYYIGWISIQDQVESLVKQQASHYPDYALTMTGHSLGASMATLTAAQL SATYDNVRLYTFGEPRTGNQAFASYMNDAFHASSPETTRYFRVTHSNDGIPNLPPAEQGYAHGGVEYWSVDPYSAQN TFVCTGDEVQCSEAQGGQGANDAHTTYFGMTSGA。
47、CTW 说 明 书 CN 102220299 B 9 1/20 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102220299 B 10 2/20 页 11 0003 序 列 表 CN 102220299 B 11 3/20 页 12 0004 序 列 表 CN 102220299 B 12 4/20 页 13 0005 序 列 表 CN 102220299 B 13 5/20 页 14 0006 序 列 表 CN 102220299 B 14 6/20 页 15 0007 序 列 表 CN 102220299 B 15 7/20 页 16 0008 序 列 表 CN 102220299 。
48、B 16 8/20 页 17 0009 序 列 表 CN 102220299 B 17 9/20 页 18 0010 序 列 表 CN 102220299 B 18 10/20 页 19 0011 序 列 表 CN 102220299 B 19 11/20 页 20 0012 序 列 表 CN 102220299 B 20 12/20 页 21 0013 序 列 表 CN 102220299 B 21 13/20 页 22 0014 序 列 表 CN 102220299 B 22 14/20 页 23 0015 序 列 表 CN 102220299 B 23 15/20 页 24 0016 序 列 表 CN 102220299 B 24 16/20 页 25 0017 序 列 表 CN 102220299 B 25 17/20 页 26 0018 序 列 表 CN 102220299 B 26 18/20 页 27 0019 序 列 表 CN 102220299 B 27 19/20 页 28 0020 序 列 表 CN 102220299 B 28 20/20 页 29 序 列 表 CN 102220299 B 29 1/1 页 30 图 1 说 明 书 附 图 CN 102220299 B 30 。