一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的荧光定量PCR方法.pdf

《一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的荧光定量PCR方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的荧光定量PCR方法.pdf（12页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 102229978 B (45)授权公告日 2013.02.13 CN 102229978 B *CN102229978B* (21)申请号 201110123067.0 (22)申请日 2011.05.13 C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (73)专利权人 山东省农业科学院畜牧兽医研究 所 地址 250100 山东省济南市历城区桑园路 8 号 (72)发明人 颜世敢 朱丽萍 陆承平 陈正涛 崔道石 张秀美 胡北侠 许传田 杨少华 张琳 聂小想等 .猪链球菌的鉴定及其主要毒力 基因的多重 PCR 检测 .中国兽医学报 .20。

2、09, 第 29 卷 ( 第 2 期 ), 第 146 149 页 . 杨婷婷等 .人感染 II 型猪链球菌快速 多重 PCR 检测方法的建立 .中国卫生检验杂 志 .2006, 第 16 卷 ( 第 9 期 ), 第 1029 1032 页 . 赵永刚等 . 猪链球菌 2 型四川分离株毒力基 因的检测及其序列分析 . 中国动物检疫 .2009, 第 26 卷 ( 第 3 期 ), 第 25 28 页 . 王花茹等. 致病性猪链球菌主要毒力因子基 因多重 PCR 检测 .中华流行病学杂志 .2005, 第 26 卷 ( 第 9 期 ), 第 640 644 页 . (54) 发明名称 一种同时。

3、检测猪链球菌 2 型胞外蛋白因子和 溶血素基因的荧光定量 PCR 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种基于 SYBR Green 染料溶解 曲线分析法同时检测猪链球菌 2 型胞外蛋白因子 EF 和溶血素基因 SLY 的荧光定量 PCR 方法。根据 GenBank 公开的猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因保守 序列， 设计、 合成 2 对特异引物， 优化 PCR 反应体 系和反应条件， 通过分析扩增曲线和溶解曲线， 建 立了同时检测猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的 SYBR GreenI 染料法荧光定量 PCR 方法。在此基础上， 优化 EF、 SLY 引物的摩尔比， 调整 2 对引。

4、物的扩增 效率， 使溶解曲线中2个产物峰大小接近。 利用建 立的 SYBR Green 染料溶解曲线分析法能够方便 的同时检测出猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张硕颖 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一 种 同 时 检 测 猪 链 球 菌 2 型 胞 外 蛋 白 因 子 EF 基 因 和 溶 血 素 SLY 基 因 的 荧 光 定 量 PCR 引 物， 其 特。

5、 征 在 于 荧 光 定 量 PCR 扩 增 EF 基 因 的 上 游 引 物 为 5 -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3， 下游引物为 5 -ACATTCTGACCACTCGCATC-3， 荧光 定量 PCR 扩增 SLY 基因的上游引物为 5 -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3， 下游引物为 5 -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3。 2. 根据权利要求 1 所述的一种同时检测猪链球菌 2 型胞外蛋白因子 EF 基因和溶血素 SLY 基因的荧光定量 PCR 引物， 其特征在于荧光定量 PCR 的反应体系为 20ul 体系， 冰上操 作， 按顺序加入以下试剂。

6、 ： 盖盖， 低速离心 1500g2min 其中， Master Mix 为 SYBR Green I 染料、 聚合酶、 dNTP、 Mg2+、 PCR 缓冲液的混合液。 3. 根据权利要求 1 所述的一种同时检测猪链球菌 2 型胞外蛋白因子 EF 基因和溶血素 SLY 基因的荧光定量 PCR 引物， 其特征在于荧光定量 PCR 的反应条件为 ： 预变性 ： 95， 5min 荧光 PCR 扩增 40-45 个循环 ： 变性 95， 10s ； 退火， 55， 20s ； 延伸， 72， 30s 溶解曲线 ： 95， 5s ； 65， 1min ； 97， continuous ； 于 65时。

7、采集荧光信号 冷却 ： 40， 10s。 权 利 要 求 书 CN 102229978 B 2 1/6 页 3 一种同时检测猪链球菌 2 型胞外蛋白因子和溶血素基因的 荧光定量 PCR 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种 SYBR Green 染料溶解曲线分析法检测猪链球菌 2 型胞外蛋白因 子和溶血素基因的多重荧光定量 PCR 方法， 属于核酸检测领域。 0002 技术背景 0003 猪链球菌 (Streptococcus suis， SS) 是呈世界性分布的重要的人兽共患病病原， 是多年来一直困扰养猪业的主要传染病之一。猪急性感染常表现为出血性败血症和脑膜 炎， 慢性感染表现为关节炎。

8、、 心内膜炎、 淋巴结化脓。 人感染链球菌患中毒性休克和脑膜炎。 猪链球菌不仅严重阻碍养猪业的健康发展， 还威胁人类的生命安全， 因此有必要严密监控 猪链球菌的流行病学变化。 0004 猪链球菌血清型众多， 抗原结构复杂。根据链球菌群特异性抗原的不同， 用兰氏 (Lancefield) 血清学分类， 可将链球菌分成 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 K、 L、 M、 N、 O、 P、 Q、 R、 S、 T、 U 等 19 个血清型。其中 C、 D、 E、 L、 R、 S 等群链球菌可引起猪链球菌病， 如 C 群的兽疫链球菌 (S.zooepidemicus) 和类马链球菌 (S.。

9、epuisimilis)、 D 群的猪链球菌 (S.suis)、 R 群的猪 2 型链球菌 (S.suis subtype 2， SS2)。20 世纪 80 年代我国流行的猪链球菌病临床上多表现 为关节炎和脑膜炎， 90 年代由于 C 群链球菌疫苗免疫使病情有所缓解。1990 年在我国广东 省首次发现猪群有类似 2 型链球菌病， 但未见人感染发病。1998 1999 年， 江苏省和浙江 省部分县、 市先后两次爆发猪 2 型链球菌病， 上万头猪发病， 同时还传染从业人员几十人， 发生脑膜炎、 关节炎及中毒性出血性休克征， 病人出现多脏器功能损害， 从病人和病猪中分 离出猪链球菌 2 型菌株， 人。

10、源 SS2 分离株与猪源 SS2 分离株为同源株。2005 年 6 月下旬， 四 川省资阳、 内江等地近 80 例患者 SS2感染急性发病， 出现中毒性休克、 脑膜炎， 有 12 例重症 患者死亡。目前我国流行的猪链球菌病以 SS2 为主。1968 年国际上首次报道 SS2 引起人类 严重感染病例。至 1989 年国外共报告了 108 例 SS2 所致人类感染的病例， 1994、 1997、 1999 年国外又相继有该菌引致人类严重感染及死亡病例的报道。 0005 SS2 存在复杂的致病机制。SS2 菌株的致病性强弱与是否具有毒力因子密切相关。 已经发现 SS2 产生多种毒力因子， 如溶菌酶释。

11、放蛋白 (MRP)、 胞外蛋白因子 (EF)、 溶血素 (SLY)、 荚膜多糖(CPS)、 纤连蛋白结合蛋白(FBPS)、 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、 IgG结合 蛋白 (IBP)、 精氨酸脱亚氨酶 (AD)、 二肽肽酶 IV(DPP IV) 等等。其中 MRP、 EF、 SLY 为三个最 重要的毒力因子。我国两次爆发的 SS2 均为 MRP+EF+SLY+表型。而 EF、 SLY 两种毒力因子为 分泌到胞外的毒力因子， 可随宿主的血液扩散到宿主全身， 可能对 SS2 自身的扩散、 对宿主 全身性损伤、 与其它病原微生物间的相互作用方面起到一定作用， 有必要针对这两个毒力 因子的分子流。

12、行病学和遗传变异情况加强监测。 0006 报道的检测 SS2 毒力因子的主要方法为常规 PCR 和多重 PCR 方法。Smith 等利用 CPS 基因序列建立了针对 1、 2、 9 型猪链球菌的型特异性 PCR 鉴定方法。马清霞等建立了能 同时检测 SS2 的 CPS、 MRP、 EF 的多重 PCR 方法， 可直接从临床病料中检测出 SS2 并能鉴定其 毒力因子表型。何孔旺等用 PCR 方法检测 SS2 的 MRP 和 EF， 敏感度可达 100 个细菌。 说 明 书 CN 102229978 B 3 2/6 页 4 0007 与常规 PCR 相比， 荧光定量 PCR 方法具有诸多优点 ： 。

13、(1) 封闭反应， 无需 PCR 后处 理， 避免了常规 PCR 电泳鉴定时 EB 的危害 ； (2) 特异性更强， 灵敏度更高， 荧光 PCR 的灵敏 度比常规 PCR 高 100 倍以上 ； (3) 采用对数期分析， 摒弃终点数据， 定量准确 ； (4) 定量可达 10个数量级 ； (5)仪器在线实时检测， 结果直观， 避免人为判断 ； (6)可实现一个反应同时检 测多个参数 ； (7) 缩短时间 ( 整个反应只需要 0.5-2 小时 )， 提高效率。目前荧光定量 PCR 已得到广泛应用。 0008 荧光定量 PCR 分为 SYBR 荧光染料法和 Taqman 探针法。Taqman 探针法。

14、特异性强， 需要针对不同的模板设计特定的荧光探针， 价格昂贵。而 SYBR Green I 染料是一种能与双 链DNA结合发光的荧光染料， 其与双链DNA结合后荧光信号显著增强。 SYBR Green I的荧光 信号强度与双链 DNA 的数量相关， 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。 对不同模板不需特别设计不同的特异性探针， 通用性较好， 并且价格相对较低， 国内外在科 研、 检测中使用比较普遍。由于 SYBR Green I 没有特异性， 不能识别特定的双链， 只要是双 链就会结合发光， 对 PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光， 在临床上使 用可。

15、能会有假阳性发生， 因此还需要结合溶解曲线分析判定是否为阳性结果。 SYBRGreen I 染料法荧光定量PCR可用于多重检测， 在一个荧光定量PCR反应管中加入多对引物， 通过优 化引物的比例， 经过 PCR 扩增和溶解曲线分析可同时判定多个检测结果。基于 Taqman 探针 法检测 SS2 的荧光 PCR 方法有吴绍强等 (2009) 建立的检测 EF 基因、 吴绍强等 (2009) 建立 的检测 MRP 基因及林祥梅等 (2009) 建立的检测 MRP、 EF 基因的荧光 PCR 方法， 这些方法都 具有快速、 敏感、 特异、 安全等优点。 0009 本发明根据公开的 SS2 的 EF 。

16、和 SLY 基因序列设计引物， 建立基于 SYBR Green I 染料溶解曲线分析的多重荧光定量PCR方法， 通过一个荧光定量PCR反应可以同时检测SS2 的 EF 和 SLY 基因。 发明内容 0010 本发明提供了一种基于 SYBR Green I 染料溶解曲线同时检测猪链球菌 2 型胞外 蛋白因子和溶血素基因的多重荧光定量 PCR 方法， 用于猪链球菌 2 型胞外蛋白因子和溶血 素基因的快 速、 鉴别检测。 0011 通过对Genbank中公开的SS2的EF和SLY基因序列比对， 选取SS2的EF和SLY基 因序列中的保守序列， 用Premier Primers 5.0软件和Oligo。

17、 6.0软件设计引物， EF上游引 物为 ： 5 -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3； EF 下游引物为 ： 5 -ACATTCTGACCACTCGCATC-3； 扩 增 的 SS2 的 EF 片 段 大 小 为 158bp，产 物 的 Tm 值 为 84 ； SLY 上 游 引 物 为 ： 5 -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3； SLY 下游引物为 ： 5 -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3； 扩增 的 SLY 片段大小为 338bp， 产物的 Tm 值为 80。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 0012 本发明的荧光定量 PCR 反应体系为 20u。

18、l 体系， 按顺序加入以下试剂 ： 0013 说 明 书 CN 102229978 B 4 3/6 页 5 0014 其中， Master Mix 为 SYBR Green I 染料、 聚合酶、 dNTP、 Mg2+、 PCR 缓冲液的混合 液。以上操作均在冰上进行， 所有试剂加完后， 盖盖， 低速离心 (1500g2min)， 置荧光 PCR 仪上进行荧光定量 PCR 反应。 0015 本发明的荧光定量 PCR 反应条件为 ： 95预变性 5min ； 95变性 10s， 55退火 20s， 72延伸 30s， 扩增 40-45 个循环。溶解曲线分析 ： 95变性 5s， 65退火 1min。

19、， 升温 速率 2.2 /s， 于 65时开始连续采集荧光信号， 直至 97， 40冷却 PCR 仪 10s。 0016 本发明的步骤包括 ： 0017 (1) 冰上操作， 按顺序加入一定量的 H2O、 引物、 Master Mix、 待测样品基因组模板， 盖盖， 低速离心。 0018 (2)将上述20ul的反应体系放到荧光PCR仪上， 设定荧光PCR反应程序， 进行荧光 PCR 扩增， 记录各样品荧光 PCR 反应的 Ct 值和 Tm 值。 0019 (3) 根据 Ct 值和 Tm 值， 判定猪链球菌 2 型胞外蛋白因子和溶血素基因的检测结 果。 0020 (4)扩增曲线判定标准为 ： 反应。

20、曲线呈对数增长时， 如果Ct值30， 同时溶解曲线 满足 (5) 中的标准则判定为阳性 ； 如果 30 Ct 值 40， 判定为可疑， 需加大模板量重复扩 增， 若得到相同的实验结果， 同时溶解曲线满足 (5) 中的标准则判定为阳性， 否则为阴性 ； 反应曲线为一条直线， 则判定为阴性。 0021 (5) 溶解曲线判定标准 ： 如果反应体系出现 84、 80两个峰则判定为 EF 和 SLY 基因 均为阳性 ； 如果只出现 84峰， 则判定为 EF 阳性 ； 如果只出现 80峰， 则判定为 SLY 阳性 ； 如果没有出现峰， 则判定为阴性。 0022 本发明具有灵敏度高、 不需电泳检测、 避免污。

21、染和散毒、 检测时间短等优点， 而且 SYBRGreen 染料法检测成本低， 试剂通用性强， 不需针对不同模板设计特定的荧光探针， 结 合溶解曲线分析可用于多重荧光定量 PCR 检测。 附图说明 0023 附图 1 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的多重荧光定量 PCR 溶解曲线分析结果。猪链 球菌 2 型 EF、 SLY 基因的荧光定量 PCR 检测溶解曲线分析的 Tm 值分别为 84、 80。 0024 附图2猪链球菌2型EF、 SLY基因的多重荧光定量PCR的引物比例优化结果。 SLY、 EF 引物摩尔比为 2 1 时， 荧光定量 PCR 溶解曲线分析显示 2 个产物峰的大小接近。。

22、 0025 附图 3 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的荧光定量 PCR 标准曲线。上图为 EF 基因的荧 光定量 PCR 标准曲线， 下图为 SLY 基因的荧光定量 PCR 标准曲线。 0026 附图 4 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的荧光定量 PCR 灵敏度检测。猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的荧光定量 PCR 检测灵敏度可达 0.002ng/ul。 说 明 书 CN 102229978 B 5 4/6 页 6 0027 附图 5 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的多重荧光定量 PCR 的特异性检测。 0028 附图 6 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因。

23、的多重荧光定量 PCR 的重复性检测 具体实施方式 ： 0029 实施例 1 引物的设计与合成 0030 根据 GenBank 中公开的猪链球菌 2 型的 EF、 SLY 基因序列， 通过基因序列比 对， 选取保守序列， 选取的 EF、 SLY 的公开序列的 GeneBank 登录号分别为 DQ417121.1、 DQ443530.1。使用 Primer PremierS 5.0 和 Oligo 6 软件自行设计 EF、 SLY 引物， 引物由上 海生工生物技术公司合成。 0031 EF 上 游 引 物 为 ： 5 -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3 ； EF 下 游 引 物 为 。

24、： 5 -ACATTCTGACCACTCGCATC-3。扩增的 EF 片段大小为 158bp， 产物的 Tm 值为 84。 0032 SLY 上 游 引 物 为 ： 5 -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3 ； SLY 下 游 引 物 为 ： 5 -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3。扩增的 SLY 片段大小为 338bp， 产物的 Tm 值为 80。 0033 实施例 2 细菌 DNA 的提取 0034 以猪链球菌 2 型 HA9801 株单菌落接种灭菌 Todd-Hewitt 肉汤培养基， 37过夜 培养， 取 细菌液 1mL， 12000rpm 离心 2min， 沉淀。

25、用 567L 的 TE 缓冲液 (pH8.0) 重悬， 加 入 30L 的 10 SDS 和 3L 的 20mg/mL 的蛋白酶 K， 充分混匀， 37水浴 1h， 加入 100L 5mol/L 的 NaCl， 充分混匀再加入 80LCTAB/NaCl 溶液， 混匀， 65水浴 10min， 加入等体积 的酚氯仿异戊醇 (25 24 1) 混匀， 12000rpm 离心 10min， 吸取上清加入等体积的 氯仿异戊醇 (24 1) 混匀， 12000rpm 离心 10min， 吸取上清， 加入 0.6 体积的异丙醇， 放 入 -20 20min， 使 DNA 充分沉淀， 12000rpm 离心。

26、 10min， 沉淀用 70的乙醇洗涤 2 次， 然后 在室温下干燥， 使乙醇挥发， 沉淀用 20L pH8.0 的 TE( 不含 DNA 酶的胰 RNA 酶 20g/mL) 溶解。 0035 测定提取DNA溶液的浓度和纯度。 荧光PCR反应时调整DNA的浓度， 吸取适量DNA， 使 20ul 的 PCR 反应体系中模板含量为 50-100ng。 0036 实施例 3 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的多重荧光定量 PCR 的建立 0037 荧光 PCR 反应体系 ： 0038 本发明的荧光定量 PCR 反应体系为 20ul 体系， 冰上操作， 按顺序加入以下试剂 ： 0039 0040。

27、 其中， Master Mix 为 SYBR Green I 染料、 聚合酶、 dNTP、 Mg2+、 PCR 缓冲液的混合 液。荧光 PCR 反应条件 ： 0041 预变性 ： 95， 5min 说 明 书 CN 102229978 B 6 5/6 页 7 0042 荧光 PCR 扩增 40-45 个循环 ： 变性 95， 10s ； 退火， 55， 20s ； 延伸， 72， 30s 0043 溶解曲线反应程序 ： 95， 5s ； 65， 1min ； 97， continuous ； 升温速率 2.2 /s， 于 65时开始连续采集荧光信号， 直至 97。 0044 冷却 ： 40， 。

28、10s 0045 荧光 PCR 反应判定标准 ： 0046 根据 Ct 值和 Tm 值， 判定猪链球菌 2 型胞外蛋白因子和溶血素基因的检测结果。 0047 扩增曲线判定标准为 ： 反应曲线呈对数增长时， 如果 Ct 值 30， 同时溶解曲线满 足阳性标准则判定为阳性 ； 如果 30 Ct 值 40， 判定为可疑， 加大模板量重复扩增， 得到 相同的实验结果， 同时溶解曲线满足阳性标准则判定为阳性， 否则为阴性 ； 反应曲线为一条 直线， 则判 定为阴性。 0048 溶解曲线分析判定标准 ： Tm 值相差 2以上时判定为二种不同的产物峰， 而对 Tm 值相差 2内的扩增在溶解曲线上只表现为一个。

29、峰值。如果反应体系出现 84、 80两个 峰则判定为 EF 和 SLY 基因均为阳性 ； 如果只出现 84峰， 则判定为 EF 阳性 ； 如果只出现 80峰， 则判定为 SLY 阳性 ； 如果没有出现峰， 则判定为阴性。引物二聚体的产生会干扰溶 解曲线图， 但通常有引物二聚体的熔解曲线在 70-75间会有小波峰出现。结果见附图 1。 0049 实施例 4 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的多重荧光定量 PCR 的引物比例优化 0050 多重荧光定量 PCR 反应中使用相等质量的引物， 扩增效率并非相同， 表现在溶解 曲线中产物峰大小不同， 有的悬殊较大。解决这一问题， 要求改变反应中各种。

30、引物的比例， 要增加 “弱” 基因的引物量， 而要减少 “强” 基因的引物量。即使在优化了循环条件后， 某些 基因的扩增产物仍不明显。 0051 在荧光定量 PCR 反应体系中只改变 EF、 SLY 两对引物的添加比例， 使 SLY 与 EF 引 物的摩尔浓度比分别为 1 1、 2 1、 5 1、 8 1、 10 1， 两对引物的总摩尔浓度为 1uM， 保持其它试剂的量不变， 考察引物比例对溶解曲线中两个产物峰的影响。 0052 结果表明， 以优化的引物比进行荧光定量 PCR 同时扩增 SS2 的 EF、 SLY 基因， 在 SLY EF 引物摩尔比为 2 1 时， 扩增曲线呈典型的 S 型曲。

31、线， 溶解曲线分析显示有 SLY、 EF 的峰值大小接近， Tm 值分别为 84、 80， 没有出现杂峰， 表明本发明的特异性好。SYBR Green 荧光染料可与任何双链 DNA 结合， 在荧光 PCR 扩增后添加溶解曲线分析， 此时温度大 于扩增产物的 Tm 值， 使扩增产物处于解链状态， 不能结合荧光染料， 荧光信号应消失， 以消 除非特异性扩增。结果见附图 2。 0053 实施例 3 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的荧光定量 PCR 标准曲线建立 0054 取猪链球菌 2 型 HA9801 菌株的 37 24 小时培养的菌液 1ml， 提取 DNA， 用紫外分 光光度计测定 D。

32、NA 的纯度和浓度， 以 10 倍倍比稀释成标准品， 取每个稀释度的 DNA 作模板 进行荧光定量 PCR 扩增。荧光定量 PCR 反应体系中只加入一对引物， 分别进行猪链球菌 2 型 EF 和 SLY 基因的荧光定量 PCR 扩增。荧光定量 PCR 扩增结束后以起始模板浓度的对数 为 X 轴， Ct 值为 Y 轴绘制回归曲线， 分别建立 EF、 SLY 检测的标准曲线。 0055 结果表明， 以稀释成10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7的DNA模板进行荧光PCR检 测， 扩增曲线呈典型 S 型， 以起始模板浓度的对数为 X 轴， Ct 值为 Y 轴。

33、绘制回归曲线。猪链 球菌 2 型的 EF 基因荧光定量 PCR 检测的标准曲线为 ： y -3.47x+9.637， 斜率为 -3.47， R2 0.9981， 扩增效率为 1.942。猪链球菌 2 型的 SLY 基因荧光定量 PCR 检测的标准曲线为 ： 说 明 书 CN 102229978 B 7 6/6 页 8 y -3.874x+9.14， 斜率为 -3.874， R2 0.9957， 扩增效率为 1.812。结果见附图 3。实施 例 4 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的荧光定量 PCR 灵敏度检测 0056 取猪链球菌 2 型 HA9801 菌株的菌液 1mL， 离心， 取沉。

34、淀， 提取细菌 DNA， 用紫外分光 光度计测定 DNA 的纯度和浓度， 以 10 倍倍比稀释成 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8、 10-9、 10-10， 取每个稀释度的 DNA 作模板进行荧光定量 PCR 扩增和溶解曲线分析。以灭菌蒸 馏水为阴性对照。荧光定量 PCR 反应体系中只加入一对引物， 分别进行猪链球菌 2 型 EF 和 SLY 基因的荧光定量 PCR 扩增。扩增后， 分析扩增曲线和溶解曲线， 以 Ct 值 35 为检测底 限， 确定本方法能检测出的最低模板浓度作为 EF 基因或 SLY 基因荧光定量 PCR 检测的灵。

35、敏 度。 0057 结果表明， 提取的 DNA 的浓度为 2000ng/ul， 纯度适合进行荧光定量 PCR 检测。在 单独进行的猪链球菌 2 型 EF 或 SLY 基因的荧光定量 PCR 检测时， 模板浓度大于 0.002ng/ ul 时都能顺利检测出 EF 或 SLY 基因， 扩增曲线呈典型 S 型， 溶解曲线为单峰， EF 基因的荧 光定量 PCR 溶解曲线分析时 Tm 值为 84， SLY 基因的荧光定量 PCR 溶解曲线分析时 80， 没有出现杂峰。模板浓度小于 0.002ng/ul 时扩增曲线的循环数大于 38 个循环， EF 或 SLY 基因的荧光定量 PCR 扩增中未检测到荧光。

36、信号。阴性对照未检测到荧光信号。结果见附图 4。实施例 5 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的多重荧光定量 PCR 的特异性检测 0058 分别挑取大肠杆菌、 沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌、 马链球菌兽疫亚种、 鸭疫里默氏 杆菌等菌株单菌落， 在 LB 液体培养基中振荡培养 24h， 分别取 1ml 菌液， 离心取菌体， 提取 DNA。 用本发明建立的荧光定量PCR方法扩增上述菌株的DNA， 以验证本发明检测的特异性。 以 HA9801 株的 DNA 为阳性对照， 以灭菌蒸馏水为阴性对照。 0059 结果表明本发明的特异性强。本发明分别荧光定量 PCR 扩增大肠杆菌、 沙门氏菌、 金黄色葡。

37、萄球菌、 马链球菌兽疫亚种、 鸭疫里默氏杆菌 DNA 及灭菌蒸馏水， 均未检测到荧光 信号， 无S型扩增曲线出现 ； 而阳性对照在扩增时出现S型曲线， 溶解曲线显示2个峰， 分别 对应 84、 80。结果见附图 5。 0060 实施例 6 猪链球菌 2 型 EF、 SLY 基因的多重荧光定量 PCR 的重复性试验 0061 取三个不同培养批次的猪链球菌 2 型 HA9801 株 37 20 小时培养的菌液 1ml， 提 取DNA， 每个批次的样品重复检测三次， 验证本方法的重复性。 以HA9801株的DNA为阳性对 照， 以 灭菌蒸馏水为阴性对照。 0062 检测结果表明， 三个批次的样品、 。

38、每个样品重复检测 3 次的结果一致， 都检测出 EF、 SLY 基因， 批间检测的变异系数 (CV ) 为 1.4， 每个样品重复检测 3 次的变异系数 (CV ) 为 1.02， 表明本发明具有良好的重复性， 从而保证了检测数据的可比性。结果见 附图 6。 0063 实施例 7SS2 分离株的 EF、 SLY 基因检测 0064 挑取 2008-2020 年间本单位自行分离的 19 株 SS2 分离菌单菌落， T-H 肉汤 37静 置培养 24 小时， 提取 DNA， 用本发明建立的荧光定量 PCR 方法检测分离株的 EF、 SLY 基因。 以 HA9801 株的 DNA 为阳性对照， 以灭。

39、菌蒸馏水为阴性对照。 0065 荧光定量 PCR 检测结果表明， 19 株分离株及阳性对照的 DNA 模板的荧光 PCR 扩增 曲线均呈典型的 S 形曲线， Ct 值在 15-40 之间， 溶解曲线显示均出现 84、 80两个峰， 而阴 性对照未检测到荧光信号， 表明检测方法成立， 分离菌的 EF、 SLY 阳性率均为 100。 说 明 书 CN 102229978 B 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 102229978 B 9 1/3 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102229978 B 10 2/3 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102229978 B 11 3/3 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102229978 B 12 。