适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102220313 A (43)申请公布日 2011.10.19 CN 102220313 A *CN102220313A* (21)申请号 201110144544.1 (22)申请日 2011.05.31 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 广西作物遗传改良生物技术重点开 放实验室 地址 530007 广西壮族自治区南宁市西乡塘 区大学东路 172 号 申请人 农业部甘蔗品质监督检验测试中心 （南宁） (72)发明人 梁俊 李杨瑞 陈忠良 莫磊兴 吴凯朝 范业赓 王天顺 牙禹 廖洁 魏源文 邓智年 莫璋红 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权。

2、代理有限 公司 11002 代理人 王加岭 张庆敏 (54) 发明名称 适用于作物 SSR 分子标记分析的基因组 DNA 提取方法 (57) 摘要 本发明提供了一种适用于作物 SSR 分子标记 分析的基因组DNA提取方法， 包括步骤 ： 1)向叶片 中加入 DNA 提取缓冲液， 蛋白酶 K 和核糖核酸酶， 振荡混匀 ； 2) 将上述混合体系置于 37， 30min ； 68， 20min ； 37， 30min ； 然后于 4保存 ； 3) 将 步骤 2) 中得到的混合体系冰浴 5-10min ； 4) 将步 骤 3) 中得到的混合体系于 4离心， 得到的上清 液即可用于 SSR 分子标记分析。

3、。本发明提供的多 种作物基因组 DNA 提取方法， 可在短时间内完成 大量样品的基因组DNA提取， 提取的基因组DNA能 满足 SSR 分子标记技术的要求， 具有操作简便、 快 速、 高通量、 成本低和无污染等优点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 4 页 附图 2 页 CN 102220322 A1/1 页 2 1.一种适用于作物SSR分子标记分析的基因组DNA提取方法， 其特征在于， 包括以下步 骤 ： 1) 向叶片中加入 DNA 提取缓冲液， 蛋白酶 K 和核糖核酸酶， 振荡混匀 ； 2) 将。

4、上述混合体系置于 37， 30min ； 68， 20min ； 37， 30min ； 然后于 4保存 ； 3) 将步骤 2) 中得到的混合体系冰浴 5-10min ； 4) 将步骤 3) 中得到的混合体系离心， 得上清。 2. 根据权利要求 1 所述的基因组 DNA 提取方法， 其特征在于， 步骤 1) 具体为 ： 向 0.02 0.04cm2的叶片中加入 50 100L DNA 提取缓冲液， 0.2 0.4L 的 100mg/mL 蛋 白酶 K 和 1 2L 的 10mg/mL 核糖核酸酶， 振荡混匀 10 20sec ； 其中， DNA 提取缓冲液的成份为 10mmol/L Tris-。

5、HCl， 1mmol/LEDTA， 0.1 SDS， pH 值 8.0。 3. 根据权利要求 2 所述的基因组 DNA 提取方法， 其特征在于， 步骤 1) 具体为 ： 向 0.020.04cm2的叶片中加入50L DNA提取缓冲液， 0.2L的100mg/mL蛋白酶K和1L 的 10mg/mL 核糖核酸酶， 振荡混匀 10sec。 4. 根据权利要求 1 所述的基因组 DNA 提取方法， 其特征在于， 步骤 2) 为混合体系置于 PCR 扩增仪中进行反应。 5. 根据权利要求 1 所述的基因组 DNA 提取方法， 其特征在于， 步骤 4) 为 4下 3000 5000rpm 离心 10 15。

6、min。 6.根据权利要求5所述的基因组DNA提取方法， 其特征在于， 步骤4)为4下3000rpm 离心 10min。 7. 根据权利要求 1-6 任一项所述的基因组 DNA 提取方法， 其特征在于， 所述作物为甘 蔗、 水稻、 玉米、 大豆或花生。 权 利 要 求 书 CN 102220313 A CN 102220322 A1/4 页 3 适用于作物 SSR 分子标记分析的基因组 DNA 提取方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 具体地说， 涉及一种适用于作物 SSR 分子标记分析的 基因组 DNA 提取方法。 背景技术 0002 传统的常规育种方法工作量大、 育种周期长、。

7、 效率低， 消耗大量人力物力， 难以满 足对选育优良品种的要求。 目前， 利用分子标记技术进行辅助育种已成为一种趋势。 许多分 子标记表现为共显性， 可以鉴别出纯合基因型和杂合基因型， 可提供较为完整的遗传信息。 分子标记技术直接以遗传物质 DNA 形式表现， 不受物种的组织类别、 发育阶段等影响， 不受 季节、 环境等限制。分子标记辅助育种促使育种工作更便利， 效率更高， 结果更准确可靠。 0003 植物基因组 DNA 提取是分子标记技术操作的关键步骤之一。目前， 常用的植物基 因组DNA提取方法主要有CTAB法、 SDS法和高盐法及其改良方法 ； 这些方法一般步骤为 ： 使 用液氮或机械研。

8、磨材料， 加入DNA提取缓冲液于65裂解细胞、 释放DNA， 后经酚、 氯仿和异 戊醇等抽提多糖类、 蛋白质等杂质来纯化 DNA， 之后使用无水乙醇或异丙醇沉淀 DNA， 最后 晾干 DNA 和溶解 DNA。操作过程较为繁琐， 耗时多， 生产效率低， 成本高。 0004 因此， 寻找一种简便、 快速、 能够满足 SSR 分子标记技术要求的作物基因组 DNA 提 取方法成为亟待解决的问题。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种简便、 快速、 高通量、 成本低的适用于作物 SSR 分子标记 分析的基因组 DNA 提取方法。 0006 为了实现本发明目的， 本发明的一种适用于作物 SSR 分子。

9、标记分析的基因组 DNA 提取方法， 包括步骤 ： 0007 1) 向叶片中加入 DNA 提取缓冲液， 蛋白酶 K 和核糖核酸酶， 振荡混匀 ； 0008 2) 将上述混合体系置于 37， 30min ； 68， 20min ； 37， 30min ； 然后于 4保存 ； 0009 3) 将步骤 2) 中得到的混合体系快速转置于冰上冰浴 5-10min ； 0010 4) 将步骤 3) 中得到的混合体系离心， 得上清。 0011 前述的基因组 DNA 提取方法， 步骤 1) 具体为 ： 向 0.02 0.04cm2的叶片中加入 50 100LDNA 提取缓冲液， 0.2 0.4L 的 100m。

10、g/mL 蛋白酶 K 和 1 2L 的 10mg/mL 核糖核酸酶， 振荡混匀 10 20sec ； 0012 其中， DNA 提取缓冲液的成份为 10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA， 0.1 SDS， pH 值 8.0。 0013 优选地， 步骤 1) 为 ： 向 0.02 0.04cm2的叶片中加入 50L DNA 提取缓冲液， 0.2L 的 100mg/mL 蛋白酶 K 和 1L 的 10mg/mL 核糖核酸酶， 振荡混匀 10sec。 0014 前述的基因组 DNA 提取方法， 步骤 2) 为混合体系置于 PCR 扩增仪中进行反应。 0015 前述的基因组 D。

11、NA 提取方法， 步骤 4) 为 4下 3000 5000rpm 离心 10 15min， 说 明 书 CN 102220313 A CN 102220322 A2/4 页 4 优选地， 4下 3000rpm 离心 10min。 0016 前述的基因组 DNA 提取方法， 所述作物为甘蔗、 水稻、 玉米、 大豆或花生等。 0017 本发明至少具有下列优点及有益效果 ： 0018 ( 一 ) 本发明所述的基因组 DNA 提取方法不需要研磨样品， 无需抽提蛋白质、 沉淀 DNA、 洗涤 DNA 和溶解 DNA， 所用的试剂少， 提取成本低。 0019 ( 二 ) 本发明所述的 DNA 提取方法可使。

12、用 96 孔 PCR 板装载反应物， 具备高通量特 性， 可在短时间内完成大批量样品 DNA 的提取。 0020 ( 三 ) 本发明所述的 DNA 提取方法仅有 4 个操作步骤， 简单易行。 0021 ( 四 ) 本发明所述的 DNA 提取方法为 “单管制备 DNA 模板” ， 提取过程中不需要转 换存放基因组 DNA 的器皿， 避免交叉污染， 做到 DNA 模板质量无污染。 0022 ( 五 ) 本发明所述的 DNA 提取方法适用范围较广， 提取甘蔗、 水稻、 玉米、 大豆和花 生等作物的基因组 DNA 的质量较好， 可以满足 SSR 分子标记分析。 附图说明 0023 图 1 为采用本发明。

13、方法提取甘蔗、 水稻、 玉米、 大豆和花生基因组 DNA 的 0.8琼 脂糖凝胶电泳检测结果， 1 2 为甘蔗品种湛江 25 号、 ROC20， 3 4 为水稻品种博优 168、 金优桂 99， 5 6 为玉米品种正大 619、 桂糯 518， 7 8 为大豆品种桂春豆 1 号、 桂早 2 号， 9 10 为花生品种桂花 26、 桂花 30。 0024 图 2A- 图 2E 为对 10 份样品材料的基因组 DNA 进行 SSR-PCR 扩增后经 7.5非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图谱， 图 2A 的 1 为 DNAMarker DL2000， 2 5 依次为用引物 SMC119CG 和 mS。

14、SCIR47 分别对甘蔗 ROC20、 湛江 25 号基因组 DNA 的扩增结果 ； 图 2B 的 1 4 依次为用引物 RM585 和 RM171 分别对水稻金优桂 99、 博优 168 基因组 DNA 的扩增结果， 5 为 DNA Marker DL2000 ； 图 2C 的 1 为 DNA Marker DL2000， 2 5 依次为用引物 bnlg125 和 bnlg1792 分别对玉米桂糯 518、 正大 619 基因组 DNA 的扩增结果 ； 图 2D 的 1 4 依次为 用引物 satt491、 satt178 对大豆桂早 2 号和桂春豆 1 号基因组 DNA 的扩增结果， 5 。

15、为 DNA Marker DL2000 ； 图 2-5 的 1 为 DNA Marker DL2000， 2E 依次为用引物 PM35、 PM3 对花生桂花 30 和桂花 26 基因组 DNA 的扩增结果。 具体实施方式 0025 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0026 以下实施例中使用的甘蔗品系湛江 25 和 ROC20， 两个水稻品系博优 168 和金优桂 99， 两个玉米品系正大619和桂糯518， 两个大豆品系桂春豆1号和桂早2号， 两个花生品系 桂花 26 和桂花 30 均为市售商品。实施例用于 SSR 分子标记分析的甘蔗、 水稻、 玉米和花生 基因组 DN。

16、A 的提取 0027 1 材料与方法 0028 1.1 材料 0029 选用两个甘蔗品系 ： 湛江 25、 ROC20 ； 两个水稻品系 ： 博优 168、 金优桂 99 ； 两个玉 米品系 ： 正大619、 桂糯518 ； 两个大豆品系 ： 桂春豆1号、 桂早2号 ； 两个花生品系 ： 桂花26、 桂花 30。采集植株上部较嫩的叶片， 分装入保鲜袋洒入少许水密封后置于 4条件下保藏 说 明 书 CN 102220313 A CN 102220322 A3/4 页 5 备用。 0030 每种作物各筛选 2 个 SSR 标记， 引物序列 ( 表 1) 由上海捷瑞生物工程有限公司合 成。 0031。

17、 表 1SSR 标记的引物序列 0032 0033 1.2DNA 提取方法 ： 0034 1) 把材料叶片洗净， 室温晾干。 0035 2) 用 75的酒精擦洗过的剪刀剪取 0.2 0.3cm2( 每个小片约为 0.02cm2) 的叶 片装入 96 孔 PCR 板的孔中， 加入 100L DNA 提取缓冲液， 加入 0.2L 的 100mg/mL 蛋白酶 K 和的 1L 的 10mg/mL 核糖核酸酶， 用 PCR 板硅胶盖封盖好后于漩涡振荡仪上混匀 10sec。 0036 3) 在 Biometra PCR 仪中设置以下反应程序并保存 ： 37， 30min ； 68， 20min ； 37。

18、， 30min ； 4， 。 0037 4) 将 96 孔 PCR 板放入 PCR 仪中进行反应。 0038 5) 将装有反应物的 PCR 板置于冰上冰浴 10min。 0039 6) 将 PCR 板放入 Thermo 冷冻离心机中， 于 4， 进行 3103rpm 离心 10min， 得到 的上清液经 Eppenndorf 浓度电度测定仪在 260nm 处测定 DNA 浓度后， 将 DNA 溶液稀释到 25ng/l 便可直接用于 SSR-PCR 分析。 0040 1.3 基因组 DNA 电泳分析 0041 取 10L 总 DNA 原液 +2L 6loading buffer 混匀， 用 0.。

19、8琼脂糖凝胶电泳。 经 1g/ml 溴化乙锭 (EB) 染色 15min， 后用清水冲洗， 于 Pharmacia 凝胶成像系统仪上检 测、 拍照并保存。 0042 1.4SSR-PCR 扩增分析 0043 SSR-PCR 扩增的具体方法 ： 0044 在冰浴中建立 20L PCR 反应体系 ( 表 2)， 然后置于 PCR 仪上进行反应。 0045 表 2SSR-PCR 体系 (20L) 说 明 书 CN 102220313 A CN 102220322 A4/4 页 6 0046 0047 在 Biometra PCR 仪上先 94预变性 5min， 然后 94变性 40sec， Tm 退。

20、火 1min， 72延伸 50sec， 32 个循环， 72终延伸 3min。 0048 PCR 扩增产物使用 7.5的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离， 经银染和显影 后使用 Bio RAD GS-800 激光扫描仪摄相、 编辑并保存图像。 0049 2 结果 0050 2.1 基因组 DNA 的提取 0051 如图1所示， 提取的DNA样品电泳主谱带为一条较为明亮、 清晰、 完整的带， 没有明 显拖尾， 说明 DNA 降解不明显， 纯度较高 ； 点样孔下端干净不发亮， 说明蛋白质等杂质的去 除比较彻底。从而可推测， 提取到的 DNA 质量较高。 0052 图 1 中， 泳道 1 2 为甘蔗。

21、品种湛江 25 号、 ROC20， 3 4 为水稻品种博优 168、 金 优桂99， 56为玉米品种正大619、 桂糯518， 78为大豆品种桂春豆1号、 桂早2号， 9 10 为花生品种桂花 26、 桂花 30。 0053 2.2SSR-PCR 扩增结果 0054 利用本发明方法提取的 5 种作物基因组 DNA 应用于 SSR 标记分析， PCR 扩增结果 见图 2A- 图 2E， 所得条带较为清晰。其中， 图 2A 的 1 为 DNA Marker DL2000， 2 5 依次 为用引物 SMC119CG 和 mSSCIR47 分别对甘蔗 ROC20、 湛江 25 号基因组 DNA 的扩增。

22、结果 ； 图 2B 的 1 4 依次为用引物 RM585 和 RM171 分别对水稻金优桂 99、 博优 168 基因组 DNA 的 扩增结果， 5 为 DNA Marker DL2000 ； 图 2C 的 1 为 DNA MarkerDL2000， 2 5 依次为用引物 bnlg125 和 bnlg1792 分别对玉米桂糯 518、 正大 619 基因组 DNA 的扩增结果 ； 图 2D 的 1 4 依次为用引物 satt491、 satt178 对大豆桂早 2 号和桂春豆 1 号基因组 DNA 的扩增结果， 5 为 DNAMarker DL2000 ； 图 2-5 的 1 为 DNA Ma。

23、rker DL2000， 2E 依次为用引物 PM35、 PM3 对花 生桂花 30 和桂花 26 基因组 DNA 的扩增结果。 0055 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102220313 A CN 102220322 A1/4 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102220313 A CN 102220322 A2/4 页 8 0003 序 列 表 CN 102220313 A CN 102220322 A3/4 页 9 0004 序 列 表 CN 102220313 A CN 102220322 A4/4 页 10 序 列 表 CN 102220313 A CN 102220322 A1/2 页 11 图 1 图 2A 图 2B 图 2C 说 明 书 附 图 CN 102220313 A CN 102220322 A2/2 页 12 图 2D 图 2E 说 明 书 附 图 CN 102220313 A 。