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一种CYP2D6基因多位点突变检测方法.pdf

  • 上传人：v****
  • 文档编号：9109322
  • 上传时间：2021-02-07
  • 格式：PDF
  • 页数：19
  • 大小：1.94MB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201410460895.7

    		 申请日：

    20140911
    公开号：

    CN104263820B

    		 公开日：

    20160824
    当前法律状态：

    		有效性：

    有效
    法律详情：

    IPC分类号：

    C12Q1/68

    		 主分类号：

    C12Q1/68
    申请人：

    广州基迪奥生物科技有限公司
    发明人：

    钟诗龙
    地址：

    510006 广东省广州市番禺区小谷围街外环东路280号广东药学院系一号楼318室
    优先权：

    CN201410460895A
    专利代理机构：

    广州粤高专利商标代理有限公司

    		 代理人：

    罗晓林
    PDF完整版下载： PDF下载
    内容摘要

    本发明公开了一种CYP2D6基因多位点突变检测方法。本发明所述检测方法是基于Taqman的等位基因差异分析法，提供CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变、基因缺失和重复突变4种类型的8个功能性单体型变异的检测。使用本发明所述CYP2D6基因多位点突变检测方法，可以覆盖CYP2D6基因的98％功能性位点，且全部操作过程仅需4h，人工操作时间少于2h，省时省力。本发明所述检测方法的检测灵敏度高，样品阳性符合率及阴性符合率均99％以上，适合推广应用。

    权利要求书

    1.一种用于检测CYP2D6基因多位点突变的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于CYP2D6基因多位点突变的检测；其中，所述试剂盒包含特异性引物和探针如下：CYP2D6*2的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQIDNO:3~4所示；CYP2D6*3的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5~6所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸系列如SEQIDNO:7~8所示；CYP2D6*4的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:9~10所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQIDNO:11~12所示；CYP2D6*5在基因缺失时的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:13~14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:15；CYP2D6在基因重复时的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:13~14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:15所示；参比基因ALB的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:16~17所示；相应的探针核苷酸序列如SEQIDNO:18所示；CYP2D6*9的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:19~20所示；相应的探针分别为5’端HEX标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQIDNO:21~22所示；CYP2D6*10的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:23~24所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQIDNO:25~26所示；CYP2D6*14的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:27~28所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQIDNO:29~30所示；CYP2D6*41的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:31~32所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQIDNO:33~34所示。

    说明书

    技术领域

    本发明涉及基因突变检测领域，具体涉及CYP2D6基因多位点的检测方法，该方法可以快速高效准确的检测CYP2D6基因的8个功能性单体型变异。

    背景技术

    据世界卫生组织(WHO)公布，世界各国住院患者发生药物不良反应的比例为10％-20％，其中5％的患者死于严重药物不良反应。我国发生药物不良反应的患者占住院患者的10％-30％，每年因药物不良反应入院的患者达500万人次，每年约有19万人死于药物不良反应。因此药物基因组学研究已经成为当前全球热点，个体化用药、个体化治疗更是各种医药生物国际学术会议的讨论重点。

    CYP2D6是CYP酶家族重要的成员之一，占肝脏酶总量的2％～9％，但是参与20％～30％药物的代谢，包括β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药(如销售额最大的阿立哌唑)、镇痛药等。CYP2D6基因存在多态性，目前发现CYP2D6超过100个突变位点，但影响中国人CYP2D6功能的常见突变有8个，包括酶活性正常型等位基因*1、*2，快代谢型基因变异为基因重复变异，慢代谢型基因变异*3、*4、*5，中代谢型基因变异*9、*10、*14、*41。这些基因基因突变可引起酶活性和数量的差异，从而影响药物的疗效个体差异，导致疗效不足或毒副作用的产生。

    目前国内外的检测CYP2D6基因突变的产品，如Amersham Bioscience(GEhealthcare)的CodeLink P450，Roche的AmpliChip CYP450 Test等，主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。另外，这些方法所需的检测时间较长，耗费人力，从核酸提取到结果获取超过8小时，超过1天正常工作时间。而其它以PCR为基础的检测基因突变的技术，如直接测序法，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。与上述液相芯片法和基因芯片法相比，荧光PCR法没有PCR后处理，大大节省时间与人力。从DNA提取到荧光PCR，到结果获取仅需4小时，手头操作时间小于2小时。但传统的荧光PCR技术及产品往往只是针对单一位点设计，不能同时获得多个位点信息。

    发明内容

    本发明的目的在于根据目前检测CYP2D6的方法中存在的上述缺陷，提供一种基于Taqman的等位基因差异分析法，提供CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变、基因缺失和重复突变4种类型的8个功能性单体型变异的检测方法，具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99％以上等优点。

    本发明另一目的在于提供上述检测方法的结果判定方法。

    本发明还有一个目的在于提供一种使用上述检测方法检测的试剂盒。

    本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

    一种CYP2D6基因多位点突变检测方法，包括如下步骤：

    (1)提取CYP2D6基因组DNA作为模板；

    (2)设计特异性引物和探针：

    CYP2D6*2的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；

    CYP2D6*3的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸系列如SEQ ID NO:7～8所示；

    CYP2D6*4的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；

    CYP2D6*5在基因缺失时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15；

    CYP2D6在基因重复时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

    参比基因ALB的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

    CYP2D6*9的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示；相应的探针分别为5’端HEX标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示；

    CYP2D6*10的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示；

    CYP2D6*14的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示；

    CYP2D6*41的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:33～34所示；

    (3)荧光定量PCR反应：

    所述荧光定量PCR反应的反应体系为：

    浓度为100ng/25μL、体积为1～5μL的步骤(1)所述模板；

    浓度为0.5μM、体积为1.25μL的步骤(2)所述引物；

    浓度为0.25μM、体积为0.625μL的步骤(2)所述探针；

    12.5μL的2×qPCR Master Mix；

    补加ddH2O至反应体系的总体积为25μL；

    所述荧光定量PCR反应的反应程序为：

    (i)95℃，10min；

    (ii)95℃，10s；

    (iii)58℃，45s；

    (iv)37℃，10s；

    其中，(ii)和(iii)进行40个循环；

    (4)检测结果判定。

    作为一种优选方案，步骤(1)中，所述基因组DNA的提取是使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒，提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，即10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)1mmol/L EDTA(PH8.0)，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板。

    作为一种优选方案，步骤(3)中所述PCR反应可以在ViiATM实时荧光定量PCR系统上进行，并使用Universal PCR Master Mix。

    本发明所述检测方案的检测结果判定方法如下：

    本发明针对每个位点分别设计了阳性对照，阴性对照和空白对照。对于CYP2D6基因置换突变和缺失突变，野生型应只检测出野生序列探针的扩增曲线(Ct<35)；纯合突变型应只检测出突变序列探针的扩增曲线(Ct<35)；杂合型应检测出野生序列探针的扩增曲线(Ct<35)和突变序列探针的扩增曲线(Ct<35)，同时野生型、纯合突变型和杂合型三种质控的扩增曲线(Ct<35)，而无模板阴性对照无平滑扩增曲线(Ct>38)。针对基因缺失或重复，采用标准曲线法和相对CT法测定CYP2D6拷贝数。用相同DNA标品(基因型为CYP2D6*1/*1)作系列稀释制备标准曲线(1:2、1:8、1:16、1:265和1:2560)，得到标准曲线的相关系数达0.99以上，斜率在3.10～3.55范围内。假设样本ALB基因有正常的双拷贝数，可以根据标准曲线计算样本的基因拷贝数。标准化单体型CYP2D6基因拷贝数定义为N＝CYP2D6拷贝数/ALB(白蛋白)拷贝数。N＝0.8～1.2为正常双单体型样本，N＝0.35～0.6为单体型样本(基因缺失)，而N＝1.4～2.4为1个基因重复。

    本发明上述检测方法可以用于制备成包含该方法的检测试剂盒。

    与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

    (1)本发明采用TaqMan荧光PCR法检测技术技术同时检测CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变、基因缺失和重复突变4种类型的8个功能性单体型变异。我们通过引物和探针精密设计使反应条件在理论上相近，通过调节PCR反应液配方和引物探针浓度配方使各PCR反应体系条件归一化。以标准阳性和阴性样本为测试样本，在保证试剂盒性能(如灵敏度、特异性和精密度)前提下进行引物、探针优化，PCR反应液配方优化，PCR反应条件(如退火温度)优化。根据重复3次的测试结果，确定本试剂盒的配方、参数和条件。使用优质、性能可靠的热启动酶、优质的dNTP、Mg离子、UNG/dUTP的预先混合PCR试剂，最大程度的降低了反应变量，提高了实验的可重复性和可靠性。并应用8行×12列的96孔板设计实现准确、快速和经济的同时检测CYP2D6基因的8个常见功能性单体型变异，覆盖度达98％；

    (2)本发明采用8行×12列的96孔板设计，可以实现荧光PCR法检测多位点CYP2D6基因突变。每一列8小孔检测一个样品，每一个小孔检测一个突变位点，其中第8个小孔检测CYP2D6拷贝数。在第8列到11列装有相应NTC、野生型、杂合型、突变型质控模板，在12列装有6个不同比例的拷贝数的标准液。与液相芯片法和基因芯片法相比，荧光PCR法没有PCR后处理，大大节省时间与人力。从DNA提取到荧光PCR，到结果获取仅需4小时，手头操作时间小于2小时。

    (3)本发明所述检测方法适用于Bio-rad，ABI，eppendorf，Stratagene，Roche等各种机型，无需开发新的仪器设备；

    (4)本发明所述检测方法可以用于以下多种药物的个性化用药辅助诊断：β受体阻滞剂、抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药等，包括：阿立哌唑、阿托西汀、文拉法辛、利哌利酮、塞托溴胺吸入、他莫昔芬、噻吗洛尔、氟西汀、奥氮平、西维美林、托特罗定、特比萘芬、曲马多、氯氮平、美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛、普罗帕酮、硫利达嗪、普罗替林、可待因、匹莫齐特、丁苯那嗪、伊潘立酮等。

    附图说明

    图1是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*2突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合野生型；

    图2是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*2突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合突变型；

    图3是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*3突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合野生型；

    图4是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*3突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合突变型；

    图5是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*4突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在VIC通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合野生型；

    图6是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*4突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合突变型；

    图7是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*9突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在HEX通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合野生型；

    图8是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*9突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合突变型；

    图9是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*10突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在HEX通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合突变型；

    图10是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*10突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合野生型；

    图11是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*14突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在HEX通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合突变型；

    图12是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*14突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合野生型；

    图13是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*41突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在HEX通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合突变型；

    图14是实时荧光定量PCR检测CYP2D6*41突变位点的扩增曲线，其中，反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，且无模板阴性对照无平滑扩增曲线，为检测成功；仅在FAM通道中检出典型荧光扩增曲线(Ct<35)为纯合野生型。

    具体实施方式

    以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

    实施例1

    采用8行×12列的96孔板设计，或几个8连管组合设计。每一列8小孔检测一个样品，每一个小孔检测一个突变位点，其中第8个小孔检测CYP2D6拷贝数。在第8列到11列装有相应NTC、野生型、杂合型、突变型质控模板，在12列装有6个不同比例的拷贝数的标准液。

    (1)血液基因组DNA提取：使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为模板。提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，即10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)1mmol/L EDTA(PH8.0)，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板。

    (2)设计特异性引物和荧光探针，序列如SEQ ID NO:1～34所示。

    (3)荧光定量PCR反应体系：(25μL)(上海辉睿)

    在ViiATM 7实时荧光定量PCR系统上进行，使用Universal PCR MasterMix。

    成分 浓度 体积 模板(样品) 100ng/25μL 1-5μL 引物 0.5μM 1.25μL 探针 0.25μM 0.625μL 2×qPCR Master Mix 12.5μL ddH2O 补至25μL

    反应程序为：

    (i)95℃，10min；

    (ii)95℃，10s；

    (iii)58℃，45s；

    (iv)37℃，10s；

    其中，(ii)和(iii)进行40个循环。

    (4)检测结果判定：

    (1)CYP2D6基因置换突变和缺失突变：当PCR结束后，如反应孔及阳性对照出现平滑扩增曲线且拐点清楚，无模板阴性对照无平滑扩增曲线(Ct大于38)，则为检测成功；如仅在VIC通道中检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合野生型；如仅在FAM通道检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合突变型；如同时在FAM和VIC通道里检测出典型荧光曲线(Ct小于35)为杂合型(图1～6)；

    如仅在HEX通道中检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合野生型；如仅在FAM通道检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合突变型,如同时在FAM和HEX通道里检测出典型荧光曲线(Ct小于35)为杂合型(图7～8)；

    如仅在FAM通道中检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合野生型；如仅在HEX通道检测出典型荧光扩增曲线(Ct小于35)为纯合突变型；如同时在FAM和HEX通道里检测出典型荧光曲线(Ct小于35)为杂合型(图9～14)

    (2)CYP2D6基因缺失和基因重复：采用标准曲线法和相对CT法测定CYP2D6拷贝数，用基因型为CYP2D6*1的DNA标品作系列稀释制备标准曲线，得到标准曲线的相关系数达0.99以上，斜率在3.1～3.55内，假设样本ALB基因有正常的双拷贝数，根据标准曲线计算样本的基因拷贝数，标准化单体型CYP2D6基因拷贝数定义为N＝CYP2D6拷贝数/ALB拷贝数，当N＝0.8～1.2时为正常双单体型样本，N＝0.35～0.6时为基因缺失的单体型样本，当N＝1.4～2.4时为1个基因重复。

    实施例2

    目前市面上在售的CYP2D6基因多态性检测试剂盒与本发明实施例1检测方法的比较(表2)。

    表2

    实施例3

    由于冠心病患者常使用β受体阻滞剂，所以入选148例冠心病患者，用本发明实施例1所述方法检测这些患者的CYP2D6基因的8个突变。并用Sanger测序的方法进行验证，计算阳性符合率(临床灵敏度)和阴性符合率(临床特异性)(表3)。

    表3

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    一种 CYP2D6 基因 多位点 突变 检测 方法
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