Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用.pdf

《Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用.pdf（26页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510630939.0 (22)申请日 2015.09.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105132460 A (43)申请公布日 2015.12.09 (73)专利权人 西南大学 地址 400715 重庆市北碚区天生路2号 (72)发明人 潘敏慧鲁成董战旗胡楠 陈婷婷陈鹏 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 王贵君 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.0。

2、1) A01K 67/04(2006.01) (56)对比文件 CN 101914537 A,2010.12.15, CN 103642807 A,2014.03.19, CN 103589745 A,2014.02.19, 何倩.家蚕核型多角体病毒 （BmNPV） 增殖复 制关键基因的筛选与鉴定. 中国优秀硕士学位 论文全文数据库 农业科技辑 .2015, (第09期), 第D051-17页. Y. Liu等.Highly efficient multiplex targeted mutagenesis and genomic structure variation in Bombyx mo。

3、ri cells using CRISPR/Cas9. Insect Biochemistry and Molecular Biology .2014,第49卷第35-42 页. 审查员 润顺琪 (54)发明名称 Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用 (57)摘要 本发明公开了Cas9介导的家蚕基因编辑载 体， 包括组成型基因编辑载体和诱导型基因编辑 载体， 其中组成型基因编辑载体包括U6启动子调 控sgRNA表达的表达框U6-sgRNA和IE-1启动子调 控Cas9表达的表达框， 诱导型基因编辑载体Cas9 由Hr3-39k诱导型启动子调控表达， 本发明的 Cas9介导的基因编辑载体能够稳定。

4、、 高效编辑目 的基因， 为制备昆虫抗病毒转基因素材和具有高 效抗病毒的品种提供了有力的工具。 权利要求书1页 说明书7页 序列表9页 附图8页 CN 105132460 B 2019.01.04 CN 105132460 B 1.Cas9介导的家蚕基因编辑载体， 其特征在于： 包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框 U6-sgRNA， 和IE-1启动子或Hr3-39k诱导型启动子调控Cas9表达的表达框； 所述Cas9的核苷 酸序列如SEQ ID NO.1所示， 所述表达框U6-sgRNA含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列， 所述IE-1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

5、所示； 所述Hr3-39k诱导型启动子的核苷酸序 列如SEQ ID NO.18所示； 所述sgRNA为egfp基因的sgRNA或ie-1基因的sgRNA； 所述egfp基因 的sgRNA的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8或 SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示互补序列； 所述ie-1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16所 示的互补序列。 2.根据权利要。

6、求1所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体， 其特征在于： 还包括荧光标记系 统。 3.根据权利要求2所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体， 其特征在于： 所述荧光标记系统 为Mcherry红色荧蛋白。 4.根据权利要求3所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体， 其特征在于： 所述Mcherry红色 荧蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。 5.含有权利要求14任一项所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体的转化体。 6.权利要求14任一项所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体在昆虫基因功能研究或家蚕 抗BmNPV品系基因工程育种中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105132460 B 2 。

7、Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 具体涉及Cas9介导的家蚕基因编辑载体， 还涉及该基 因编辑载体的应用。 背景技术 0002 CRISPR/Cas9基因编辑技术是细菌和古细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的 一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制之一。 是由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA， 指导 Cas9核酸内切酶切割识别的双链DNA， 诱发同源重组或非同源末端连接， 进而实现在目的 DNA上进行编辑。 因为这一新系统相比以前的基因编缉系统具有制备简单、 成本低、 作用高 效等优点， 开发后获得了快速发展等优点。 因此， 基于CRISPR。

8、/Cas9基因编辑技术在持续感 染的病毒或潜伏感染病毒疾病治疗中具有重大的潜在意义。 0003 CRISPR/Cas9系统工作的基本原理是当病毒或噬菌体感染宿主细胞时CRISPR被转 录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA， pre-crRNA)， 然后加工成一系列短的含有保守重复序列 和间隔区的成熟crRNA(CRISPR-derived RNA)， 最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列 上。 并引导Cas9核酸内切酶在靶位点剪切双链DNA， 随后， 细胞的非同源末端连接修复机制 (NHEJ)重新连接断裂处的基因组DNA， 并引入插入或缺失突变， 引起靶标基因错误的转录翻 译， 。

9、从而使基因丧失功能。 这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA (single-guided RNA)进行简化。 因此， 这一简化的CRISPR/Cas9基因编缉系统能够准确、 快 速、 直接清除入侵的外源DNA。 0004 家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫。 BmNPV是蚕业生产上最常见的且危 害最严重的一类病原， 对蚕业生产影响巨大。 利用当今发展迅速的基因工程技术， 从根本上 提高家蚕病毒抗性， 是蚕业领域重要的研究课题。 基因的敲除研究表明， 缺失某些增殖必需 基因， BmNPV将不能增殖。 因此， 抑制这些病毒增殖必需基因的表达将成为防治家蚕感染。

10、 BmNPV的一种有效策略。 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术， 以BmNPV增殖必需基因为靶基因而 构建基因编缉载体， 再将其导入家蚕细胞并持续表达能够导致BmNPV增殖必须基因发生插 入或缺失从而丧失功能， 是防治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系的有效手段。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供Cas9介导的家蚕基因编辑载体； 本发明的 目的之二在于提供含有Cas9介导的家蚕基因编辑载体的转化子， 本发明的目的之三在于提 供Cas9介导的家蚕基因编辑载体的应用。 0006 为实现上述发明目的， 本发明提供如下技术方案： 0007 Cas9介导的家蚕基因编辑载。

11、体， 包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框U6-sgRNA 和IE-1启动子调控Cas9表达的表达框。 0008 优选的， 还包括荧光标记系统。 0009 更优选的， 所述荧光标记系统为Mcherry红色荧蛋白。 说明书 1/7 页 3 CN 105132460 B 3 0010 优选的， 所述Cas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 表达框U6-sgRNA含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列， IE-1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 0011 更优选的， 所述Mcherry红色荧蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。 0012 优选的， 所述。

12、Cas9由SEQ ID NO.18所示的Hr3-39k诱导型启动子调控表达。 0013 优选的， 所述sgRNA为egfp基因的sgRNA或ie-1基因的sgRNA； 所述egfp基因的 sgRNA的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.510所示中的任意一条或两条； 所述ie-1基因的 sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1116所示中的任意一条或两条。 0014 2、 含有权利要求17任一项所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体的转化体。 0015 3、 所述Cas9介导的家蚕基因编辑载体在昆虫基因功能研究或家蚕抗BmNPV品系基 因工程育种中的应用。 0016 本发明的有益效果在于： 。

13、本发明提供了一种高效、 稳定的Cas9介导的家蚕基因编 辑载体， 可以为组成型基因编辑载体， 也可以为诱导型基因编辑载体， 诱导型基因编缉载体 在昆虫细胞中更具有稳定、 高效的表达， 从而更好的调控靶基因的表达。 能够用于制备昆虫 抗病毒转基因素材和具有高效抗病毒的品种， 用于昆虫基因功能研究和家蚕抗BmNPV品系 基因工程育种中的应用。 附图说明 0017 为了使本发明的目的、 技术方案和有益效果更加清楚， 本发明提供如下附图： 0018 图1为表达载体pSL1180-IE1-Cas9-SV40和sgRNA表达载体pIZ-U6-sgRNA示意图； 0019 图2为表达载体pSL1180-IE。

14、1-Cas9-SV40转染BmN-SWU1细胞后Cas9定位示意图； 0020 图3为针对外源蛋白EGFP设计的sgEGFP靶序列示意图； 0021 图4为不同靶序列sgEGFP基因编辑效果荧光图及蛋白表达图(A： 荧光图； B： 蛋白表 达图)； 0022 图5为靶序列为sgEGFP-339的基因编缉测序结果； 0023 图6为ie-1基因靶序列sgIE-1骨架结构示意图； 0024 图7为过表达Cas9和U6-sgRNA串联载体示意图； 0025 图8为过表达靶序列为sgIE-1的基因编缉载体后基因编缉效果示意图； 0026 图9为靶序列为sgIE-1的基因编缉测序结果； 0027 图10。

15、为过表达靶序列为sgIE-1后基因编缉对病毒DNA复制、 蛋白表达及病毒毒力 的影响结果比较图(A： 病毒DNA复制结果； B： 病毒毒力结果； C： 蛋白表达结果)； 0028 图11为稳定细胞系筛选后基因编缉载体表达示意图； 0029 图12为稳定细胞系抗病毒效果荧光效果和统计结果示意图(A： 抗病毒效果荧光效 果； B： 统计结果)； 0030 图13为靶序列为sgIE-1稳定细胞系基因编缉对病毒DNA复制、 蛋白表达及病毒毒 力的影响结果比较； 0031 图14为病毒诱导型基因编缉系统表达示意图； 0032 图15病毒诱导型基因编缉系统病毒感染后及不同毒力病毒诱导转录和表达条件 结果比。

16、较(A： 病毒感染后转录和表达结果； B： 不同毒力病毒诱导转录和表达结果)； 0033 图16病毒诱导型基因编缉系统稳定细胞系抗病毒效果荧光效果和统计示意图(A： 说明书 2/7 页 4 CN 105132460 B 4 荧光效果图； B： 统计结果图)； 0034 图17病毒诱导型基因编缉系统稳定细胞系对病毒DNA复制、 蛋白表达及病毒毒力 的影响结果比较。 具体实施方式 0035 下面将结合附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。 实施例中未注明具体 条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如分子克隆实验指南(第三版， J.萨姆布鲁克等著) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。

17、。 0036 实施例1、 基于Cas9和U6-sgRNA为骨架的基因编缉载体构建 0037 登陆addgene载体数据库(http:/www.addgene.org/)， 下载已有的昆虫Cas9基因 和U6序列， 根据家蚕密码子特征设计家蚕特异Cas9基因和U6-sgRNA序列， 其序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示， 然后送Gensript公司合成序列。 0038 将合成的Cas9基因序列通过Cla I和Xba I酶切位点酶切后连接到经过同样酶切 的pSL1180载体上， 连接产物转化大肠杆菌大肠杆菌DH5 感受态细胞， 然后用含有氨苄青霉 素(Amp)的LB平板筛。

18、选阳性克隆， 挑取阳性克隆单菌落， 酶切验证正确后使用； 然后在Xho I 和Cla I酶切位点处连接SEQ ID No.3所示的IE-1启动子， 在Xba I和EcoR I酶切位点处连 接SEQ ID No.4的SV40终止信号， 获得pSL1180-IE1-Cas9-SV40载体， 结构如图1所示， 经过 酶切验证和测序正确后使用。 将Xho I和Age I双酶切U6-sgRNA连接到经过同样双酶切的 pIZ-V5/His载体中， 得pIZ-U6-sgRNA载体； 然后经过同样的方法转化、 挑取阳性克隆及测序 验证。 0039 将构建的pSL1180-IE1-Cas9-SV40载体用脂质体。

19、转染试剂转染到BmN-SWU1细胞 中， 转染48小时后， 用1PBST轻洗细胞3次， 每次5min， 然后加入质量分数为4的多聚甲醛 溶液， 室温固定15min， 用1PBST轻洗细胞3次， 每次5min； 再用质量分数为0.1的Triton- 100通透细胞10min， 用1PBST轻洗细胞3次， 每次5min； 接着用封闭液(含10的羊血清和 3的牛血清的PBS配制)封闭1h， 用1PBST轻洗细胞3次， 每次5min； 鼠源 -Cas9抗体室温 孵育1h， 用1PBST轻洗细胞3次， 每次5min； 加入带有Alexa555标记的山羊抗小鼠IgG的二 抗和细胞核染料DAPI， 37避光。

20、处理1h， 用1PBST轻洗细胞3次， 每次5min。 最后取出盖玻 片在Olympus激光共聚焦扫描显微镜下观察拍照， 结果如图2所示。 结果显示Cas9蛋白能够 定位到细胞核内， 证明构建系统可以用于后续实验。 0040 利用外源EGFP蛋白作为sgRNA靶基因， 并根据CRISPRdirect在线分析工具 (http:/crispr.dbcls.jp/)预测egfp基因的sgRNA序列， 同时根据软件分析靶序列在家蚕 中的脱靶效率， 最后选择高效编缉的sgRNA序列， 其序列为： 0041 sgEGFP-339F： 5 -gaagttcgagggcgacaccc-3 (SEQ ID No。

21、.5)； 0042 sgEGFP-339R： 5 -gggtgtcgccctcgaacttc-3 (SEQ ID No.6)； 0043 sgEGFP-361F： 5 -gtgaaccgcatcgagctgaa-3 (SEQ ID No.7)； 0044 sgEGFP-361R： 5 -ttcagctcgatgcggttcac-3 (SEQ ID No.8)； 0045 sgEGFP-378F： 5 -gaagggcatcgacttcaagg-3 (SEQ ID No.9)； 0046 sgEGFP-378R： 5 -ccttgaagtcgatgcccttc-3 (SEQ ID No.10)；。

22、 0047 将选取的三个sgRNA 5 端和3 分别插入BbsI酶切位点(F:AAGT,R:AAAC)， 设计完 说明书 3/7 页 5 CN 105132460 B 5 成后送到华大基因合成引物， 合成后通过上下游引物退火形成双链， 连接到经过Bbs I酶切 的上述pIZ-U6-sgRNA表达载体中。 连接产物转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 用含有Zeocin 的LB平板筛选阳性克隆， 挑取阳性克隆单菌落， 经测序正确后的阳性克隆质粒命名为pIZ- sgEGFP-339， pIZ-sgEGFP-361， pIZ-sgEGFP-378， 结构如图3所示。 0048 分别将构建好的pIZ-IE。

23、1-Cas9-SV40载体、 pIZ-EGFP载体和pIZ-sgEGFP-339， pIZ- sgEGFP-361， pIZ-sgEGFP-378及pIZ-sgMock(pIZ-sgMock构建方法与pIZ-sgEGFP-339构建 方 法 相 同 ， 区 别 在 于 在 s g E G F P - 3 3 9 处 替 换 不 相 关 序 列 ， 其 序 列 为 ： 5- ggaggatgcattagcacaac-3 )用脂质体转染试剂共转到BmN-SWU1细胞中， 转染72小时后通过 荧光显微镜下观察。 因为sgRNA靶序列对egfp基因具有编缉作用， 可以通过绿色荧光蛋白 EGFP表达量的。

24、变化检测基因编辑效率， 结果如图4所示， 在靶序列为egfp时， EGFP荧光数量 及蛋白表达量都明显减少。 0049 为了进一步分析确实是由于egfp基因发生缺失或插入所导致的EGFP蛋白表达量 降低， 利用DNA提取试剂盒提取基因编辑后的DNA。 用egfp基因两段的序列设计引物， 以提取 的基因编缉效果较好转染了pIZ-sgEGFP-339的DNA模板进行扩增， 胶回收后连接到pMD19-T 载体上， 连接产物转化大肠杆菌大肠杆菌DH5 感受态细胞， 用含有Amp的LB平板筛选阳性克 隆， 挑取阳性克隆单菌落。 经测序后与正常基因序列比较， 结果如图5所示， 在egfp基因靶位 点附近确。

25、实出现了基因的缺失， 说明这一系统能够顺利的在家蚕细胞中编缉外源DNA。 0050 实施例2、 CRISPR/Cas9编缉病毒ie-1基因抑制BmNPV增殖效果检测 0051 由于实施例1构建的CRISPR/Cas9基因编缉系统能够在家蚕细胞中编缉外源DNA， 因此设想这个系统是否能够应用于家蚕抗病毒研究， 首先选择家蚕转录起始因子及复制关 键基因ie-1作为我们基因编缉的靶基因。 同理， 根据CRISPRdirect在线分析工具(http:/ crispr.dbcls.jp/)预测ie-1基因的sgRNA序列， 同时根据软件分析靶序列在家蚕中的脱靶 效率， 最后选择高效编缉的sgRNA序列，。

26、 其序列如SEQ ID No.11-16所示， 简称为sgIE-1。 按 照实施例1的方法将ie-1基因的sgRNA序列连接到经过BbsI酶切的pIZ-U6-sgRNA表达载体 中， 然后转化， 挑取阳性克隆， 经测序正确后的阳性克隆质粒命名为pIZ-U6-sgIE1-330， pIZ-U6-sgIE1-352， pIZ-U6-sgIE1-427， 其靶序列骨架结构如图6所示， 同时简称为pIZ-U6- sgIE1。 0052 通过构建Cas9、 U6-sgIE1和Mcherry表达框串联载体， 进一步提高这一基因编缉系 统的编缉效率并且能够瞬时检测编缉效果。 首先， 我们通过Xho I/Ec。

27、oR I双酶切pSL1180- IE1-Cas9-SV40载体， 回收IE1-Cas9-SV40片段连接到经过同样双酶切的pIZ-V5/His载体 上， 得pIZ-Cas9， 经过转化， 挑取阳性克隆， 酶切验证。 然后通过Kan I/EcoR I双酶切构建的 pSL1180-IE1-Mcherry-SV40载体(pSL1180-IE1-Mcherry-SV40构建方法与pSL1180-IE1- Cas9-SV40构建方法相同， 区别在于Cas9基因由Mcherry序列代替， Mcherry序列如SEQ ID No.17所示)， 然后回收IE1-Mcherry-SV40片段， 连接于pIZ-C。

28、as9中， 得pIZ-Cas9-Mcherry。 然后将PIZ-U6-sgIE1经过Xho I/Age I双酶切连接到同样经过双酶切的pIZ-Cas9-Mcherry 载体中， 同样经过转化， 挑取阳性克隆， 酶切验证后测序。 最终获得Cas9、 U6-sgIE1和 Mcherry表达框串联载体， 命名为pIZ-Cas9-Mcherry-U6-sgIE1， 结构如图7所示。 0053 分别将构建的基因编缉载体pIZ-Cas9-Mcherry-U6-sgIE1(简称： sgIE-1)和pIZ- Cas9-Mcherry-U6-sgMock(简称： sgMock， pIZ-Cas9-Mcherry。

29、-U6-sgIE1载体的sgIE-1处由 说明书 4/7 页 6 CN 105132460 B 6 不关序列替换， 其序列为： 5 -ggaggatgcattagcacaac-3 )用脂质体转染试剂瞬时转染到 BmN-SWU1细胞中， 转染48小时后荧光显微镜下观察转染效率。 因为荧光标记基因Mcherry与 Cas9、 U6通过同一个载体转染， 因此通过红色荧光观察就能标记基因编缉载体表达的细胞。 证明基因编缉载体顺利转染后加入带有绿色荧光蛋白EGFP标记的BmNPV病毒， 感染48小时 后， 通过荧光显微镜观察红色荧光和绿色荧光的分布， 结果如图8所示， 正常细胞和过表达 pIZ-Cas9。

30、-Mcherry-U6-sgMock载体的细胞， 绿色荧光明显较多， 并且红色荧光对绿色荧光 的分布没有影响， 但是过表达pIZ-Cas9-Mcherry-U6-sgIE1载体的细胞明显看到有红色荧 光的细胞明显抑制绿色荧光的表达， 这一结果说明靶基因为ie-1基因编缉系统能够明显抑 制病毒的增殖复制。 0054 为了进一步确认由于ie-1基因发生缺失或插入所导致的病毒无法侵染， 利用DNA 提取试剂盒提取其中一个转染了pIZ-sgIE1-330(以下简称sgIE1)基因编辑后的DNA。 用ie- 1基因两段的序列设计引物， 以提取的DNA模板进行扩增， 胶回收后连接到pMD19-T载体上， 。

31、连接产物转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆， 挑取阳性克隆 单菌落。 经测序后与正常基因序列比较， 结果如图9所示， 在ie-1基因靶位点附近确实出现 了基因的缺失， 说明这一系统能够顺利的在家蚕细胞中编缉病毒基因组从而达到抗病毒效 果。 0055 为了进一步从病毒增殖复制各个水平上检测基因编缉对病毒增殖复制的影响， 我 们分别检测了基因编缉后病毒DNA复制水平， 病毒早期、 晚期和极晚期蛋白表达水平及病毒 感染力TCID50等。 首先， 利用基因编辑后提取的病毒DNA为模板， 采用实时绝对定量PCR分析 基因编辑后对病毒DNA复制的影响。 定量引物根据先前公。

32、布的病毒gp41引物(请补充公布的 文献)。 根据病毒感染后DNA模板浓度设100、 10-1、 10-2、 10-3、 10-4和10-5计算样品标准曲线， 当 R20.99方可使用。 荧光定量试剂应用BIO-RAD公司提供仪器配套的试剂。 反应程序为： 95 变性10s， 60退火10s， 72延伸10s扩展40个循环。 然后根据每个样品的绝对值计算DNA复 制的量， 结果如图10中A所示， 靶基因为ie-1的样品DNA复制明显受到抑制作用。 0056 同时我们通过Western blotting分析病毒蛋白表达变化， 结果如图10中B所示， sgIE-1敲出的细胞相对sgMock处理后，。

33、 早期蛋白IE-1直到24h p.i.才能检测到微弱的条 带， 晚期蛋白VP39到48h p.i.才能够检测到明显的蛋白条带， 同样极晚期蛋白Poly直到48h p.i.都没有检测到蛋白表达。 总体蛋白表达相对sgMock处理的细胞延迟24h以上， 这一结果 充分说明了Cas9的敲出效率是非常明显的。 最后， 对sgIE-1敲出的细胞的病毒感染力TCID50 进行了分析， 结果如图10中C所示， 发现sgIE-1敲出的细胞相对sgMock病毒毒力下降3-4个 数量级。 0057 实施例3、 稳定表达CRISPR/Cas9系统抑制BmNPV增殖效果检测 0058 Invitrogen公司开发的昆。

34、虫细胞表达载体pIZ-V5/His含有Zeocin抗性基因， 通过 长时间抗生素筛选可以获得稳定表达外源蛋白的细胞系。 为了提高抗基因编缉载体的抗病 毒效果， 将基因编缉载体pIZ-Cas9-Mcherry-U6-sgMock和pIZ-Cas9-Mcherry-U6-sgIE1转 染到BmN-SWU1细胞中， 转染48小时稳定后用含400 g/mL浓度的Zeocin抗生素的培养基筛选 阳性细胞一周左右， 大量细胞死亡后逐步降低抗生素浓度， 最后稳定培养。 结果如图11所 示， 大概筛选两个月左右基本95以上的细胞都含有目的蛋白的表达， 证明这个细胞能够 稳定表达目的蛋白， 可以用于抗病毒研究。。

35、 说明书 5/7 页 7 CN 105132460 B 7 0059 用稳定表达基因编缉载体的细胞感染BmNPV， 72小时后荧光观察pIZ-Cas9- Mcherry-U6-sgMock和pIZ-Cas9-Mcherry-U6-sgIE1稳定细胞系的病毒复制情况， 结果如图 12所示， 稳定表达sgMock的细胞病毒感染基本不受影响， 而sgIE-1稳定细胞系基本检测不 绿色荧光， 通过荧光统计分析发现稳定表达sgMock感染率达100， sgIE-1稳定细胞系只达 到5左右， 表明sgIE-1系统具有非常明显的抗病毒效果。 0060 为了充分证明含有基因编缉系统地稳定细胞系能够充分抑制病毒。

36、增殖， 对感染病 毒的sgMock和sgIE-1稳定细胞系的病毒感染力TCID50进行了分析， 结果如图13所示， 发现 sgIE-1基因编缉的细胞相对sgMock病毒毒力下降6-7个数量级， sgIE-1基因编缉的细胞基 本没有再次感染能力。 0061 实施列4、 病毒诱导型CRISPR/Cas9系统构建及分析 0062 目前， CRISPR/Cas9基因编缉技术已经迅速应用于人类疾病基因治疗及基因工程 研究， 但是Cas9的脱靶现象仍然困扰着大多数基因编缉研究学者， 虽然有很多策略能够降 低之中脱靶效率， 但是并没有一种方法能够彻底避免脱靶。 因此， 进一步利用构建的病毒诱 导型39K启动。

37、子来启动这一基因编缉载体， 利用先前同样的方法把Hr3-39K启动子经过Xho I/Cla I酶切连接到相应的载体上， 转化、 挑取阳性克隆、 酶切验证。 其中Hr3-39K启动子序 列为SEQ ID No.18。 载体命名pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6为这一系统在病毒感染后能够启 动子迅速被病毒激活， 然后表达Cas9蛋白， 从而编辑病毒基因， 病毒诱导型基因编缉原理如 图14所示。 0063 为了更精确的验证病毒诱导型基因编缉系统地编辑的效率， 首先转染pHr3-39K- Cas9-Mcherry-U6载体48小时后， 在不同时间点加入病毒， 通过mRNA水平和蛋白水平检。

38、测 Cas9被诱导转录和翻译的时间。 结果如图15中A所示， 病毒感染后， 6小时就能检测Cas9基因 开始转录， 一直持续增加到24小时， Cas9蛋白24小时就能检测到大量的表达， 说明这个基因 编缉系统在病毒感染后能够迅速转录翻译， 从而编缉病毒基因， 从而达到抗病毒效果。 0064 同理为了检测这个基因编缉系统对病毒的敏感性， 分别用MOI为100、 50、 20和5的 病毒滴度来感染过表达pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6载体的细胞。 感染48小时后， 分别提取 RNA和蛋白检测Cas9转录和表达水平， 结果如图15中B所示， 不同浓度的病毒滴度对Cas9转 录和蛋白表。

39、达并没有显著的差异， 结果说明我们构建的病毒诱导型基因编缉载体能够在极 微量的病毒感染后就能够被激活， 能够快速反映， 抑制病毒大规模扩增。 0065 实施列5、 病毒诱导型CRISPR/Cas9系统抗病毒分析 0066 为了提高抗基因编缉载体的抗病毒效果， 将基因编缉载体pHr3-39K-Cas9- Mcherry-U6-sgMock(pIZ-Cas9-Mcherry-U6-sgMock载体的启动子由Hr3-39K替换)和pHr3- 39K-Cas9-Mcherry-U6-sgIE-1转染到BmN-SWU1细胞中， 转染48小时稳定后用含400ug/mL浓 度的Zeocin抗生素的培养基筛选。

40、阳性细胞一周左右， 大量细胞死亡后逐步降低抗生素浓 度， 最后稳定培养。 大概筛选两个月左右基本95以上的细胞都含有目的蛋白的表达， 证明 这个细胞能够稳定表达目的蛋白， 可以用于抗病毒研究。 0067 用稳定表达基因编缉载体的细胞感染BmNPV， 72小时后荧光观察pHr3-39K-Cas9- Mcherry-U6-sgMock和pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6-sgIE-1稳定细胞系的病毒复制情况， 结 果如图16所示， 稳定表达sgMock的细胞病毒感染基本不受影响， 而sgIE-1稳定细胞系基本 检测不绿色荧光， 通过荧光统计分析发现稳定表达sgMock感染率达100，。

41、 sgIE-1稳定细胞 说明书 6/7 页 8 CN 105132460 B 8 系只达到5左右， 这一系统具有非常明显的抗病毒效果。 0068 为了说明含有病毒诱导型基因编缉系统的稳定细胞系能够充分抑制病毒增殖， 对 感染病毒的sgMock和sgIE-1病毒诱导型稳定细胞系的病毒感染力TCID50进行了分析， 结果 如图17所示， sgIE-1基因编缉的细胞基本没有再次感染能力， 这一结果充分证明了构建的 病毒诱导型基因编缉系统能够快速敏感的抑制病毒增殖复制。 0069 最后说明的是， 以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，。

42、 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说明书 7/7 页 9 CN 105132460 B 9 0001 序列表 1/9 页 10 CN 105132460 B 10 0002 序列表 2/9 页 11 CN 105132460 B 11 0003 序列表 3/9 页 12 CN 105132460 B 12 0004 序列表 4/9 页 13 CN 105132460 B 13 0005 序列表 5/9 页 14 CN 105132460 B 14 0006 序列表 6/9 页 15 CN 105132460 B。

43、 15 0007 序列表 7/9 页 16 CN 105132460 B 16 0008 序列表 8/9 页 17 CN 105132460 B 17 0009 序列表 9/9 页 18 CN 105132460 B 18 图1 图2 图3 说明书附图 1/8 页 19 CN 105132460 B 19 图4 图5 说明书附图 2/8 页 20 CN 105132460 B 20 图6 图7 图8 说明书附图 3/8 页 21 CN 105132460 B 21 图9 图10 说明书附图 4/8 页 22 CN 105132460 B 22 图11 图12 说明书附图 5/8 页 23 CN 105132460 B 23 图13 图14 说明书附图 6/8 页 24 CN 105132460 B 24 图15 图16 说明书附图 7/8 页 25 CN 105132460 B 25 图17 说明书附图 8/8 页 26 CN 105132460 B 26 。