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1、(10)授权公告号 CN 102459621 B (45)授权公告日 2015.01.28 CN 102459621 B (21)申请号 201080024741.3 (22)申请日 2010.05.10 09162079.9 2009.06.05 EP C12P 7/50(2006.01) (73)专利权人 赢创德固赛有限公司 地址 德国埃森 (72)发明人 A卡劳 N莫兰 R格斯特迈尔 (74)专利代理机构 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人 王磊 JP 52/108086 A,1977.09.10, 摘要 . JP 55-42550 A,1980.03.25, 摘要 . WO 。
2、2006082252 A2,2006.08.10, 权利要求 书， 第 13 页 . EP 1767616 A2,2007.03.28,权利要求书， 第 14、 161-166 段， 实施例 4. R. P. Wagner etal.THE ACCUMULATION OF KETO ACIDS AND ACETALDEHYDE BY A STRAIN OF NEUROSPORA INHIBITED BY THREONINE. Journal of biological chemistry .1955, 第 251 卷第 251-252 页 . (54) 发明名称 制备 2- 酮羧酸的方法 (5。
3、7) 摘要 本发明涉及一种制备 2- 酮羧酸或其盐的方 法， 所述 2- 酮羧酸具有通式 R1-CO-COOH， 其中 R1 为具有 3-7 个碳原子的支链烷基， 所述方法包括 发酵步骤， 其中使微生物在培养基中生长以提供 包含 2- 酮羧酸或其盐的培养液。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2011.12.02 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2010/056345 2010.05.10 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2010/139527 EN 2010.12.09 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王晶晶 权利要求书 3 页 。
4、说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书3页 说明书7页 (10)授权公告号 CN 102459621 B CN 102459621 B 1/3 页 2 1. 一种制备 2- 酮羧酸或其盐的方法， 所述 2- 酮羧酸具有通式 (I)R1-CO-COOH， 其中 R1 为具有 3-7 个碳原子的支链烷基， 所述方法包括以下步骤 ： a) 发酵步骤， 其中使微生物在培养基中生长以提供包含 2- 酮羧酸或其盐的培养液 ； b) 将步骤 a) 中获得的发酵培养液进行选自离子交换、 提取过程和蒸馏过程的一个或 多个步骤 ； c) 将步骤 b) 中获得的产物进行进。
5、一步浓缩、 沉淀或结晶或者它们的组合并获得 2- 酮 羧酸或其盐， 并且其中所述 2- 酮羧酸或其盐的纯度为 60 重量 % 或更高， 其中所述用于发酵步骤的微生物为棒杆菌 (Corynebacterium)， 以及 其中所述棒杆菌菌株在选自以下组中的任何一种或多种或者所有蛋白中是缺陷或 下调的 ： 转氨酶 B(E.C.2.6.1.42， 由 ilvE- 基因编码 )、 缬氨酸 - 丙酮酸转氨酶 AvtA(E. C.2.6.1.66， 由 avtA- 基因编码 )、 丙氨酸转氨酶 AlaT(E.C.2.6.1.2， 由 alaT- 基因编 码 )、 丙酮酸脱氢酶的 E1 亚基 (E.C.1.2。
6、.4.1， 由 aceE 基因编码 )、 丙酮酸醌氧化还原酶 (E.C.1.2.2.2， 由 pqo 基因编码 ) 和葡糖磷酸异构酶 (E.C.5.3.1.9， 由 pgi 基因编码 )， 并 且 在所述棒杆菌菌株中， 一种或多种选自以下组的基因是过表达的 ： 乙酰羟酸合酶， E.C.4.1.3.18)、 ilvC(编码乙酰羟酸还原异构酶的基因， E.C.1.1.1.86)和ilvD(编码二羟 基酸脱水酶的基因， E.C.4.2.1.9)2- 酮异戊酸， 并产生 2- 酮异戊酸 ； 或者 其中所述棒杆菌菌株在选自以下组中的任何一种或多种或者所有蛋白中是缺陷或 下调的 ： 转氨酶 B(E.C.2。
7、.6.1.42， 由 ilvE- 基因编码 )、 缬氨酸 - 丙酮酸转氨酶 AvtA(E. C.2.6.1.66， 由 avtA- 基因编码 )、 丙氨酸转氨酶 AlaT(E.C.2.6.1.2， 由 alaT- 基因编 码 )、 丙酮酸脱氢酶的 E1 亚基 (E.C.1.2.4.1， 由 aceE 基因编码 )、 丙酮酸醌氧化还原酶 (E.C.1.2.2.2， 由 pqo 基因编码 ) 和葡糖磷酸异构酶 (E.C.5.3.1.9， 由 pgi 基因编码 )， 并 且 在所述棒杆菌菌株中， 一种或多种选自以下组的基因是过表达的 ： ilvA( 编码苏氨酸 脱水酶的基因， E.C.4.2.1.1。
8、6)、 hom( 编码高丝氨酸脱氢酶的基因， E.C.1.1.1.3)、 thrB( 编 码高丝氨酸激酶的基因， E.C.2.7.1.39)、 thrC( 编码苏氨酸合酶的基因， E.C.4.2.3.1)、 lysC( 编码天冬氨酸激酶的基因， E.C.2.7.2.4)、 天冬氨酸转氨酶 (aat， E.C.2.6.1.1)、 天 冬氨酸半醛脱氢酶 (asd， E.C.1.2.1.11) 和丙酮酸羧化酶 (pyc， E.C.6.4.1.1)， 并产生酮甲 基戊酸盐 ； 或者 其中所述棒杆菌菌株在选自以下组中的任何一种或多种或者所有蛋白中是缺陷或 下调的 ： 转氨酶 B(E.C.2.6.1.42。
9、， 由 ilvE- 基因编码 )、 缬氨酸 - 丙酮酸转氨酶 AvtA(E. C.2.6.1.66， 由 avtA- 基因编码 )、 丙氨酸转氨酶 AlaT(E.C.2.6.1.2， 由 alaT- 基因编 码 )、 丙酮酸脱氢酶的 E1 亚基 (E.C.1.2.4.1， 由 aceE 基因编码 )、 丙酮酸醌氧化还原酶 (E.C.1.2.2.2， 由 pqo 基因编码 ) 和葡糖磷酸异构酶 (E.C.5.3.1.9， 由 pgi 基因编码 )， 并 且 在所述棒杆菌菌株中， 一种或多种选自包括以下基因的组的基因是过表达的 ： leuA( 编码 2- 异丙基苹果酸合酶的基因 (E.C.2.3.。
10、3.13)、 leuB(3- 异丙基苹果酸脱氢酶， E.C.1.1.1.85) 和 leuCD(3- 异丙基苹果酸脱水酶， E.C.4.2.1.33)， 并产生酮异已酸盐。 权 利 要 求 书 CN 102459621 B 2 2/3 页 3 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其中所述用于发酵步骤的微生物为谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的方法， 所述方法包括以下步骤 ： a) 发酵步骤， 其中使微生物在培养基中生长以提供包含 2- 酮羧酸或其盐的培养液 ； b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行蒸馏过程， 其伴有所述。
11、发酵培养液的pH值变化。 4. 如权利要求 1 或 2 所述的方法， 所述方法包括以下步骤 ： a) 发酵步骤， 其中使微生物在培养基中生长以提供包含 2- 酮羧酸或其盐的培养液 ； b) 将步骤 a) 中获得的发酵培养液进行离子交换。 5. 如权利要求 1、 2 或 4 所述的方法， 其中将步骤 b) 中获得的流出物进行选自离子交 换、 提取或蒸馏的一个或多个进一步纯化步骤。 6. 如权利要求 1、 2、 4 或 5 所述的方法， 所述方法包括以下步骤 ： a) 发酵步骤， 其中使微生物在培养基中生长以提供包含 2- 酮羧酸或其盐的培养液 ； b) 将步骤 a) 中获得的发酵培养液进行离子交。
12、换 ； 和 c) 将步骤 b) 中获得的流出物进行选自离子交换、 提取或蒸馏的一个或多个进一步纯 化步骤 ； 以及 d) 将步骤 c) 中获得的产物进行进一步浓缩、 沉淀或结晶步骤或者它们的组合并获得 2- 酮羧酸或其盐。 7.如权利要求1-6中任一项所述的方法， 其中R1为具有3、 4或5个碳原子的支链烷基。 8.如权利要求7所述的方法， 其中R1选自异丙基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 2-甲基-丁 基、 3- 甲基丁基。 9. 如权利要求 8 所述的方法， 其中 R1选自异丙基、 异丁基、 仲丁基。 10. 如权利要求 1-9 中任一项所述的方法， 其中所述 2- 酮羧酸为 2- 酮异。
13、戊酸、 2- 酮 -4- 甲基戊酸或 2- 酮 -3- 甲基戊酸。 11.如权利要求10所述的方法， 其中所述2-酮羧酸或其盐的纯度为80重量%或更高。 12.如权利要求11所述的方法， 其中所述2-酮羧酸或其盐的纯度为90重量%或更高。 13. 如权利要求 1-12 中任一项所述的方法， 其中在步骤 a) 中获得的培养液包含至少 10g/l 的 2- 酮羧酸或其盐。 14.如权利要求13所述的方法， 其中在步骤a)中获得的培养液包含至少15g/l的2-酮 羧酸或其盐。 15.如权利要求14所述的方法， 其中在步骤a)中获得的培养液包含至少20g/l的2-酮 羧酸或其盐。 16.如权利要求15。
14、所述的方法， 其中在步骤a)中获得的培养液包含至少40g/l的2-酮 羧酸或其盐。 17. 如权利要求 1-16 中任一项所述的方法， 其中所述用于发酵步骤的微生物具有提高 的产生通式 (I) 的化合物的能力。 18. 如权利要求 17 所述的方法， 其中所述通式 (I) 的化合物选自 2- 酮异戊酸、 2- 酮 -4- 甲基戊酸和 2- 酮 -3- 甲基戊酸的化合物或它们的混合物。 19. 如权利要求 1-2 和 4-18 中任一项所述的方法， 其中在将所述培养液进行离子交换 步骤 (b) 之前， 进行从所述培养液除去细胞和 / 或细胞碎片的额外步骤。 权 利 要 求 书 CN 102459。
15、621 B 3 3/3 页 4 20. 如权利要求 19 所述的方法， 其中所述除去步骤通过过滤、 离心或沉降、 或者所述方 法的组合来进行。 21.如权利要求19或20所述的方法， 其中在从所述培养液除去细胞和/或细胞碎片之 后和在步骤 b) 之前， 使用离子交换树脂或活性炭进行预纯化。 22. 如权利要求 1-2 和 4-21 中任一项所述的方法， 其中在步骤 b) 中， 使用阳离子树脂 进行离子交换。 23. 如权利要求 1-2 和 4-22 所述的方法， 其中在步骤 c) 中， 将阴离子树脂用于离子交 换。 24. 如权利要求 1-2 和 4-22 中任一项所述的方法， 其中步骤 c)。
16、 的蒸馏为蒸汽蒸馏。 25. 如权利要求 23 所述的方法， 其中在 10-100的温度下进行所述蒸馏。 26. 如权利要求 25 所述的方法， 其中在 20-75的温度下进行所述蒸馏。 27. 如权利要求 26 所述的方法， 其中在 25-70的温度下进行所述蒸馏。 28. 如权利要求 27 所述的方法， 其中在 35-65的温度下进行所述蒸馏。 29. 如权利要求 24-28 中任一项所述的方法， 其中在 10-100mbar 的压力下进行所述蒸 馏。 30. 如权利要求 29 所述的方法， 其中在 20-80mbar 的压力下进行所述蒸馏。 31. 如权利要求 30 所述的方法， 其中在。
17、 20-65mbar 的压力下进行所述蒸馏。 32. 如权利要求 31 所述的方法， 其中在 20-25mbar 的压力下进行所述蒸馏。 33. 如权利要求 1-2 和 6-28 中任一项所述的方法， 其中在步骤 d) 的沉淀和结晶步骤 中， 以选自 Ca2+、 Mg2+、 Na+、 K+的盐的形式或者与氨基酸的盐的形式获得所述 2- 酮羧酸。 34. 通过权利要求 1 至 33 中任一项所述的方法获得的 2- 酮羧酸或其盐。 权 利 要 求 书 CN 102459621 B 4 1/7 页 5 制备 2- 酮羧酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用发酵步骤来制备2-酮羧酸， 特别是。
18、2-酮异戊酸、 2-酮-4-甲 基戊酸和 / 或 2- 酮 -3- 甲基戊酸的方法。 背景技术 0002 2-酮羧酸是用于制药的化合物， 并且用于合成除草剂和杀真菌剂。 已知2-酮羧酸 降低血浆中的LDL胆固醇、 甘油三酯和自由基水平。 特别地， 2-酮异戊酸用作肾衰竭患者的 食物补充剂。 0003 本领域中已知通过化学合成来制备 2- 酮羧酸， 例如 2- 酮异戊酸 ( 盐 )。例如， 在 以下两步骤中通过化学合成制备 2- 酮异戊酸盐 ： 使用 CrO3将各自的 2- 羟基异戊酸乙酯氧 化， 随后将该酯皂化以获得 2- 酮异戊酸盐。该方法存在使用高温、 有毒的 CrO3和各种对环 境有危险。
19、的溶剂的缺点。 0004 在生物合成中， 2- 酮羧酸是用于各自的氨基酸的直接前体 ： 例如 2- 酮异戊酸是 氨基酸缬氨酸的直接前体。在微生物中， 2- 酮异戊酸盐在细胞中产生并分泌至培养基中。 在现有技术中描述了 2- 酮酸用作前体通过发酵来制备各自的氨基酸 (GB 2,161,159 ； GB 2,147,579)。 0005 尽管文献中已知微生物产生2-酮羧酸如2-酮异戊酸(盐)， 但目前没有描述通过 利用发酵以高纯度制备和分离 2- 酮羧酸的方法， 而仅提及 2- 酮羧酸作为制备氨基酸的中 间产物或离析物。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种制备 2- 酮羧酸， 特别是 2-。
20、 酮异戊酸 ( 盐 )、 2- 酮 -4- 甲 基戊酸和 / 或 2- 酮 -3- 甲基戊酸的方法， 所述方法避免了化学合成的缺点。 0007 这一问题通过制备 2- 酮羧酸或其盐的方法得到了解决， 所述 2- 酮羧酸具有通式 (I)R1-CO-COOH， 其中 R1为具有 3-7 个碳原子的支链烷基， 所述方法包括以下步骤 ： 0008 a) 发酵步骤， 其中使微生物在培养基中生长以提供包含 2- 酮羧酸或其盐的培养 液 (culture broth) ； 0009 b) 将步骤 a) 中获得的发酵培养液进行选自离子交换、 提取过程和蒸馏过程的一 个或多个步骤。 0010 在本发明的优选实施。
21、方案中， 所述方法包括以下步骤 ： 0011 a) 发酵步骤， 其中使微生物在培养基中生长以提供包含 2- 酮羧酸或其盐的培养 液 ； 0012 b) 将步骤 a) 中获得的发酵培养液进行离子交换 ； 0013 c) 优选地将步骤 b) 中获得的流出物进行选自离子交换、 提取或蒸馏的一个或多 个进一步的纯化步骤 ； 0014 d) 优选地将步骤 c) 中获得的产物进行进一步浓缩、 沉淀或结晶步骤或者它们的 说 明 书 CN 102459621 B 5 2/7 页 6 组合并获得 2- 酮羧酸或其盐。 0015 在本发明的优选实施方案中， 所述方法包括以下步骤 ： 0016 a) 发酵步骤， 其。
22、中使微生物在培养基中生长以提供包含 2- 酮羧酸或其盐的培养 液 ； 0017 b) 发酵培养液的初始 pH 变化 ( 酸化至 pH 值为 1) 后， 将步骤 a) 中获得的发酵培 养液仅进行蒸馏过程 ( 加入水进行蒸汽蒸馏直至蒸馏池完全蒸干 (impoverishment)。 0018 该实施方案避免使用离子交换处理。令人惊讶地发现， 利用这一步骤可以从发酵 培养液中完全选择性地除去酮酸， 而其它有机酸则保留在蒸馏池中。 0019 在优选的方法中， 2- 酮羧酸是具有通式 R1-CO-COOH 的化合物或其盐， 其中 R1是具 有 3、 4 或 5 个碳原子的支链烷基。 0020 进一步优选。
23、地， R1选自异丙基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 2- 甲基 - 丁基、 3- 甲基丁 基。甚至更优选地， R1选自异丙基、 异丁基、 仲丁基。 0021 在特别优选的方法中， 2- 酮羧酸为 2- 酮异戊酸或其盐。 0022 在本发明另一优选实施方案中， 步骤 a) 中获得的培养液包含至少 10g/l、 优选至 少 15g/l、 和更优选至少 20g/l、 并且最优选至少 40g/l 的 2- 酮羧酸或其盐， 所述 2- 酮羧酸 优选 2- 酮异戊酸。 0023 进一步优选地， 用于发酵步骤的微生物具有提高的产生通式 (I) 的化合物的能 力， 所述通式 (I) 的化合物优选为选自 2-。
24、 酮异戊酸、 2- 酮 -4- 甲基戊酸和 2- 酮 -3- 甲基戊 酸的化合物或它们的混合物。 0024 优选地， 用于发酵步骤的微生物为棒杆菌 (Corynebacterium)， 其具有提高的产 生 2- 酮异戊酸、 2- 酮 -4- 甲基戊酸和 / 或 2- 酮 -3- 甲基戊酸的能力， 所述棒杆菌特别 优选为谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)。使用一种或多种蛋白下调或缺 陷的棒杆菌菌株是特别有用的， 所述蛋白例如转氨酶 B(E.C.2.6.1.42， 由 ilvE- 基因编 码 )、 缬氨酸 - 丙酮酸转氨酶 AvtA(E.C.2.6.1.66， 。
25、由 avtA- 基因编码 ) 或丙氨酸转氨酶 (E.C.2.6.1.2， 由 alaT- 基因编码 )。此外， 使用一种或多种蛋白下调或缺陷的棒杆菌菌株 是有用的， 所述蛋白例如丙酮酸脱氢酶的 E1 亚基 (E.C.1.2.4.1， 由 aceE 基因编码 )、 丙酮 酸醌氧化还原酶 (E.C.1.2.2.2， 由 pqo 基因编码 )、 葡糖磷酸异构酶 (E.C.5.3.1.9， 由 pgi 基因编码 )。为了获得良好的产率， 棒杆菌菌株在所提及的基因产物中的一些、 所有或者所 述基因产物的组合中是下调或缺陷的。aceE 的基因产物催化丙酮酸向乙酰辅酶 A 的反应。 ilvE的基因产物催化2。
26、-酮异戊酸转氨成氨基酸缬氨酸(每个转氨反应， 其将1摩尔的谷氨 酸转化成-酮戊二酸)。 avtA的基因产物催化2-酮异戊酸转氨成氨基酸缬氨酸(每个转 氨反应， 其将1摩尔的丙氨酸转化成丙酮酸)。 alaT基因的基因产物催化从丙酮酸向丙氨酸 的反应。pqo 的基因产物催化从丙酮酸向乙酸的反应。pgi 的基因产物催化从葡糖 -6- 磷 酸向果糖 -6- 磷酸的反应。 0025 此外， 棒杆菌菌株可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因 ： ilvBN( 编码乙酰羟酸合酶的基因， E.C.4.1.3.18)、 ilvC( 编码乙酰羟酸还原异构酶的基 因， E.C.1.1.1.86) 和 il。
27、vD( 编码二羟基酸脱水酶的基因， E.C.4.2.1.9)。ilvBN、 ilvC 和 ilvD 基因编码代表从丙酮酸向 2- 酮异戊酸的代谢途径的酶。对于酮甲基戊酸盐的产生， 棒杆菌菌株还可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因 ： ilvA( 编码苏氨酸 说 明 书 CN 102459621 B 6 3/7 页 7 脱水酶的基因， E.C.4.2.1.16)、 hom( 编码高丝氨酸脱氢酶的基因， E.C.1.1.1.3)、 thrB( 编 码高丝氨酸激酶的基因， E.C.2.7.1.39)、 thrC( 编码苏氨酸合酶的基因， E.C.4.2.3.1)、 lysC( 编码天冬氨。
28、酸激酶的基因， E.C.2.7.2.4)、 天冬氨酸转氨酶 (aat， E.C.2.6.1.1)、 天冬氨酸半醛脱氢酶 (aspartate semialdehyse dehydrogenase)(asd， E.C.1.2.1.11)、 丙酮酸羧化酶 (pyc， E.C.6.4.1.1)。对于酮异己酸盐的产生， 棒杆菌菌株还可以过表达 任意一种或多种或者所有下述优选内源基因 ： leuA( 编码 2- 异丙基苹果酸合酶的基因 (E.C.2.3.3.13)、 leuB(3- 异丙基苹果酸脱氢酶， E.C.1.1.1.85)、 leuCD(3- 异丙基苹果酸 脱水酶， E.C.4.2.1.33)。。
29、 0026 在特别优选的实施方案中， 棒杆菌菌株的基因型为 -aceE、 -ilvE， 并过表达基 因 ilvBN、 ilvC 和 ilvD， 并且用于制备 2- 酮异戊酸。 0027 除棒杆菌之外， 其它细菌菌株、 酵母和真菌微生物能够用于本发明的发酵过 程， 所述微生物例如大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)、 芽孢杆菌 (Bacillus)、 短杆菌 (Brevibacterium)、 假单胞菌 (Pseudomonas)、 链霉菌 (Streptomyces)。 0028 在进一步优选的实施方案中， 在将培养液进行离子交换步骤 (b) 之前， 进行从所 述培养液除去细胞和。
30、 / 或细胞碎片的额外步骤， 其中所述除去步骤优选通过过滤、 离心或 沉降、 或者所述方法的组合来进行。 0029 重组技术是本领域技术人员已知的。下表包含所用基因的登录号。 0030 基因名称 基因 ID 登录号 (NCBI) aceE 3344029 NC_006958.1 ilvE 3344782 NC_006958.1 alaT 3342681 NC_006958.1 avtA 3344823 NC_006958.1 pqo( 同义 poxB) 3344335 NC_006958.1 ilvB 3345149 NC_006958.1 ilvN( 同义 ilvH) 3343142 NC_。
31、006958.1 ilvC 3343961 NC_006958.1 ilvD 3344114 NC_006958.1 ilvA 3342699 NC_006958.1 thrB 3345034 NC_006958.1 thrC 3342939 NC_006958.1 说 明 书 CN 102459621 B 7 4/7 页 8 hom 3343957 NC_006958.1 lysC 3345161 NC_006958.1 aat( 同义 aspB) 3343262 NC_006958.1 asd 3345564 NC_006958.1 Pyc 3344537 NC_006958.1 leuA。
32、 3344881 NC_006958.1 leuC 3345229 NC_006958.1 leuD 3345257 NC_006958.1 leuB 3345533 NC_006958.1 0031 表 ： 基因登录号 0032 此外， 在从培养液除去细胞和 / 或细胞碎片之后和在步骤 b) 之前， 可以使用离子 交换树脂或活性炭进行预纯化。 0033 在本发明方法的优选实施方案中， 在步骤 b) 中， 将阳离子树脂用于离子交换步 骤。该步骤用于除去氨基酸和阳离子。优选地， 阳离子树脂包含具有磺酸官能性的强酸性 交换树脂， 即包含磺酸基团的树脂。 0034 在进一步优选的实施方案中， 在步骤。
33、 c) 中， 将阴离子树脂用于离子交换。该步骤 用于除去除了 2- 酮羧酸 (2- 氧代羧酸 ) 以外的酸。优选地， 阴离子树脂包含具有胺官能性 的弱碱性交换树脂。优选地， 采用优选盐酸的强酸将期望的产物从阴离子树脂洗脱。进一 步优选地， 用于从阴离子树脂洗脱的所述酸的体积摩尔浓度为0.1N至4N， 甚至更优选1N至 3N， 并且最优选 2.5N 至 3N。 0035 在替代性实施方案中， 在步骤 c) 中进行蒸馏， 优选蒸汽蒸馏。进一步优选地， 在 10-85、 更优选 20-75、 甚至更优选 25-70、 并且特别优选 35-65的温度下进行蒸馏。 0036 在进一步优选的实施方案中， 。
34、进行蒸馏的初始溶液的 pH 值为 1-10， 优选 1-2。 0037 优选地， 在10-100mbar(毫巴)、 更优选20-80mbar、 甚至更优选20-65mbar、 并且特 别优选 20-25mbar 的压力下进行蒸馏。 0038 在本发明进一步优选的方法中， 在步骤d)的沉淀和结晶步骤中， 以选自Ca2+、 Mg2+、 Na+、 K+的盐的形式或者与氨基酸的盐的形式获得 2- 酮羧酸。特别优选通过添加 CaCO3将溶 液的 pH 值设置为 5.0-6.0， 优选 5.5-6.0。然后， 将溶液减压浓缩。 0039 优选地， 通过本发明的方法获得的2-酮羧酸或其盐的纯度为60重量或更。
35、高， 更 优选 80 重量或更高， 最优选 90 重量或更高。 0040 进一步优选地， 2-酮羧酸， 优选2-酮异戊酸(盐)所实现的总收率达到至少50重 量。 0041 在进一步优选的实施方案中， 用于发酵的培养基包含可更新的原材料作为碳源， 说 明 书 CN 102459621 B 8 5/7 页 9 所述原材料优选自以下组 ： 葡萄糖、 蔗糖。 0042 本发明还提供具有通式 (I)R1-CO-COOH 的 2- 酮羧酸或其盐 ( 其中 R1为具有 3-7 个碳原子的支链烷基 )， 优选提供 2- 酮异戊酸或其盐， 其通过如上文所述本发明的方法所 获得的纯度大于 60 重量， 优选大于 。
36、80 重量， 特别优选大于 90 重量。 实施例 0043 实施例 1 ： 2- 酮异戊酸盐的制备 (i) 离子交换、 (ii) 蒸馏 ) 0044 将谷氨酸棒杆菌菌株在装有 LB 培养基的摇瓶中培养直至达到稳定期， 所述谷氨 酸棒杆菌菌株的基因型为 -aceE、 -ilvE， 并且过表达基因 ilvBN、 ilvC 和 ilvD。培养基 含有碳源和氮源。将培养液离心以除去细胞和细胞碎片。培养液上清的 pH 值为 6.7 并且 包含 5g/l 的 2- 酮异戊酸盐。 0045 随后， 将上清在强阳离子树脂(Amberlite FPC 22Na)上渗滤以除去氨基酸和阳离 子 ( 主要是 Na+)。
37、。对于该步骤， 每 1000ml 培养液 ( 上清 ) 使用 350ml 树脂体积。然后将树 脂用 1 体积 H2O 洗涤， 并收集流出物部分直至白利糖度 (Brix)( 通过折光计测量每一百份 水溶液中所溶解的固体作为糖的浓度的量度 ) 低于 0.1。 0046 在 60的温度和 20-25mbar 的压力下， 在 Bchi 蒸发仪上将白利糖度为 7 的流出 物浓缩。收集所得产物 (receipt) 直至没有进一步的蒸馏发生并获得油状残留物。将 H2O 加入油状残留物中并继续浓缩直至不再有蒸馏发生。 将该步骤重复多次直至相关的蒸馏产 物的总白利糖度低于 0.1。 0047 随后， 将所有来自。
38、蒸馏的产物混合 (pool)， 并加入 CaCO3直至 pH 值达到 5.5-6.0。 利用每重量 2- 酮异戊酸盐 2wt.-的活性炭将溶液脱色 1-5 小时。然后将溶液通过 0.45m 的膜过滤以除去活性炭。 0048 在40-45的温度和20-25mbar的压力下， 在Bchi蒸发仪上将滤液浓缩直至获得 晶体的悬浮液。将悬浮液缓慢冷却至 20， 并在 20下保持至少 1 小时后， 将晶体在玻璃 漏斗上过滤并用 H2O 洗涤。 0049 于40-45的温度下， 将湿饼真空干燥直至重量不变， 随后以2-酮异戊酸的Ca2+盐 进行分析。HPLC 分析显示所述 2- 酮异戊酸盐的纯度大于 90 。
39、重量 ( 参见表 1)。 0050 表 1 ： 根据实施例 1 所获得的 2- 酮异戊酸盐的纯度 0051 化合物 量 按面积的 2- 酮异戊酸盐 (KIV) 91.65 - 酮 - 甲基 - 正戊酸盐 (KMV) 6.91 2- 酮异己酸盐 (KIC) 0.86 0052 实施例 2 ： 2- 酮异戊酸盐的制备 (i) 阳离子离子交换、 (ii) 阴离子离子交换 ) 0053 将谷氨酸棒杆菌菌株在装有 LB 培养基的摇瓶中培养直至达到稳定期， 所述谷氨 酸棒杆菌菌株的基因型为 -aceE、 -ilvE， 并且过表达基因 ilvBN、 ilvC 和 ilvD。培养基 含有碳源和氮源。将培养液离。
40、心以除去细胞和细胞碎片。培养液上清的 pH 值为 6.7 并且 说 明 书 CN 102459621 B 9 6/7 页 10 包含 5g/l 的 2- 酮异戊酸盐。 0054 随后， 将上清在强阳离子树脂(Amberlite FPC 22Na)上渗滤以除去氨基酸和阳离 子 ( 主要是 Na+)。对于该步骤， 每 1000ml 培养液 ( 上清 ) 使用 350ml 树脂体积。然后将树 脂用 1 体积 H2O 洗涤， 并收集流出物部分直至白利糖度低于 0.1。 0055 将白利糖度为 7 的流出物在弱阴离子树脂 (Amberlite IRA-67) 上渗滤以除去碱 性杂质。对于该步骤， 每 1。
41、000ml 培养液 ( 上清 ) 使用 750ml 树脂体积。然后用 2.7N 的 HCl 将树脂洗脱， 并收集流出物部分直至分析表明出现氯化物。 0056 随后， 将不含氯化物的部分混合， 并加入 CaCO3直至 pH 值达到 5.5-6.0。利用每重 量 2- 酮异戊酸盐 2wt.-的活性炭将溶液脱色 1-5 小时。然后将溶液通过 0.45m 的膜过 滤以除去活性炭。 0057 在40-45的温度和20-25mbar的压力下， 在Bchi蒸发仪上将滤液浓缩直至获得 晶体的悬浮液。将悬浮液缓慢冷却至 20， 并在 20下保持至少 1 小时后， 将晶体在玻璃 漏斗上过滤并用 H2O 洗涤。 0。
42、058 于40-45的温度下， 将湿饼真空干燥直至重量不变， 随后以2-酮异戊酸的Ca2+盐 进行分析。HPLC 分析显示所述 2- 酮异戊酸盐的纯度按面积计大于 85 ( 参见表 2)。 0059 表 2 ： 根据实施例 2 所获得的 2- 酮异戊酸盐的纯度 0060 化合物 量 按面积的 2- 酮异戊酸盐 (KIV) 85.07 - 酮 - 甲基 - 正戊酸盐 (KMV) 0.70 2- 酮异己酸盐 (KIC) 0.65 0061 实施例 3 不进行离子交换处理的 2- 酮异戊酸盐的制备 (DSP 部分 ) 0062 根据实施例 1 和 2， 使谷氨酸棒杆菌菌株发酵。完成发酵过程后， 用 。
43、8.2kg 的 50 NaOH 将培养液上清 (270L， pH 2.6， 包含 40g/l 的 2- 酮异戊酸盐 ) 调节至 pH 值为 7.5， 并 将其浓缩 ( 双套管反应器， 在 70， 40-50mbar 下 ) 至白利糖度 40(105g/l 的 2- 酮异戊酸 盐 ) ； 然后用 29.7kg 的 30 H2SO4将其酸化至 pH 1.0。 0063 在 70的温度和 40-50mbar 的压力下， 在双套管反应器上将酸化的溶液浓缩。收 集所得产物直至没有进一步的蒸馏发生， 并获得油状残留物。将 10L H2O 加入油状残留物 中并继续浓缩直至不再有蒸馏发生。 将该步骤重复多次直。
44、至相关的蒸馏产物的总白利糖度 低于 0.5。 0064 随后， 将所有来自蒸馏的产物 (230L) 混合， 并加入 3.5kg 的 CaCO3直至 pH 值达到 4.5。利用每重量 2- 酮异戊酸盐 2wt.-的活性炭将溶液脱色 1-5 小时。然后将溶液通过 压滤机过滤以除去活性炭。 0065 在 35-45的产物温度和 40-50mbar 的压力下， 在双套管反应器上将滤液浓缩直 至获得晶体的悬浮液。将悬浮液缓慢冷却至 20， 并在 20下保持至少 1 小时后， 将晶体 离心并用 H2O 洗涤。 0066 于40-45的温度下， 将湿饼真空干燥直至重量不变(5.1kg)， 随后以2-酮异戊酸 说 明 书 CN 102459621 B 10 7/7 页 11 的 Ca2+盐进行分析。HPLC 分析显示所述 2- 酮异戊酸盐的纯度按面积计大于 99 ( 参见表 1)。 0067 表 1 ： 根据该实施例所获得的 2- 酮异戊酸盐的纯度 0068 化合物 量 按面积的 2- 酮异戊酸盐 (KIV) 99.7 - 酮 - 甲基 - 正戊酸盐 (KMV) 0.2 2- 酮异己酸盐 (KIC) 0.1 说 明 书 CN 102459621 B 11 。