香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101205558 B (45)授权公告日 2010.11.17 CN 101205558 B *CN101205558B* (21)申请号 200610135361.2 (22)申请日 2006.12.22 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 福建省农业科学院植物保护研究 所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店镇埔 党村 (72)发明人 陈庆河 翁启勇 赵健 李本金 兰成忠 邱荣洲 吕新 (74)专利代理机构 福州智理专利代理有限公司 35208 代理人 王义星。

2、 CN 1693464 A,2005.11.09, 全文 . CN 1768577 A,2006.05.10, 全文 . WO 0127332 A1,2001.04.19, 全文 . (54) 发明名称 香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种香蕉枯萎病菌分子检测基 因及其检测方法， 专用于香蕉枯萎病高灵敏度快 速分子检测。检测基因为香蕉枯萎病菌特异的 404bp 序列， 在 Genbank 数据库未发现同源序列。 设计了一对引物 FOC-F/FOC-R， 其在香蕉枯萎病 菌纯 DNA、 带菌的发病组织及土壤上特异性地扩 增出 364bp 的特异扩增产物。所发明的。

3、检测基因 及引物可被用于生产实践中香蕉发病组织和土壤 中香蕉枯萎病菌的快速、 灵敏、 特异的检测， 同时 可用于田间香蕉枯萎病的早期诊断和病菌的监测 和鉴定。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘玉玲 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 1 页 CN 101205558 B1/1 页 2 1. 一种香蕉枯萎病菌分子检测基因， 其特征在于具有如下所述的基因序列的香蕉枯萎 病菌的特异检测基因， 10 20 30 40 50 | | | | | 1 TGCCGAGCTG AGTATAAAGA CTTTACTGAT GTA。

4、CATATGA ATGACTCGTG 51 GCACGGTACT TGCTGTGCGG GGATCATCCA GGGGATGTAT GAGGAGGCTA 101 GGGTATACAT CGCAAGGGTC TTTGAACGGG ACCACGCGGA TGAGATTGAA 151 GGACCTCTTC GAATGGCAAG AGTCTGTTTC CGATACCTGT GAAGTCGCAG 201 TTTATAGTGA ATGTTGAATT AGGCTATTCA CTGGGCTATT GAGCCACCGC 251 GCTCCGTCGA CATCATCAGC ATCTCCGCTG GCTTCCGAA。

5、A CTACTCCAAG 301 GAACTAGACG ACGCTGTCAC AAGAGCGAAA GCTTCTGGTG TTGTTGTCAT 351 AGCTGCAGCG TCAAACTGGC AGAACAAAAA TACCGTCGCA TTCCCAGCTC 401 GGCA。 2. 权利要求 1 所述的香蕉枯萎病菌分子检测基因的 PCR 引物， 其特征在于 PCR 引物序 列为 ： FOC-F ： 5 -ATA TGA ATG ACT CGT GGC ACG-3 ； FOC-R ： 5 -GCT GGG AAT GCG ACG GTA T-3 。 3. 一种香蕉枯萎病菌分子检测基因的检测方。

6、法， 包括 ： 1) 从被香蕉枯萎病菌感染的香蕉植株组织中或存在香蕉枯萎病菌的土壤样品中分离 香蕉枯萎病菌 DNA ； 2) 以该 DNA 为模板用一对引物 FOC-F ： 5 -ATA TGA ATG ACT CGT GGC ACG-3 ； FOC-R ： 5 -GCT GGG AAT GCG ACG GTA T-3 ， 通过聚合酶链式反应扩增出香蕉枯萎病菌的特异基因 产物 ； 3) 然后取适量步骤 2) 的聚合酶链式反应扩增产物用琼脂糖电泳分离， 经溴化乙锭染 色后于紫外灯下观察， 根据扩增产物的大小判定结果， 如果能特异性地扩增出 364bp 的产 物， 即可判断所述的香蕉植株组织或土壤。

7、样品中存在了香蕉枯萎病菌。 4. 根据权利要求 3 所述的香蕉枯萎病菌分子检测基因的检测方法， 其特征在于还包括 对香蕉枯萎病菌 DNA 进行灵敏性检测， 灵敏性检测巢式 PCR 的引物序列为 ： FOC-NF ： 5 -GAT GAG ATT GAA GGA CCT CTT CG-3 ； FOC-NR ： 5 -TCT AGT TCC TTG GAG TAG TTT CGG-3 。 权 利 要 求 书 CN 101205558 B1/12 页 3 香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法 0001 技术领域 ： 0001 本发明涉及一种香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法， 专用于香蕉枯萎病菌 。

8、高灵敏度快速分子检测， 同时可用于田间香蕉枯萎病的早期诊断和病菌的监测和鉴定， 属 于农作物病害防治和植物检疫技术的领域。 0002 背景技术 ： 0003 香蕉枯萎病由尖镰孢菌古巴专化型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 引起， 是我国的三类检疫性病害。1904 年在美国夏威夷首次报道发现该病害， 1910 年在巴拿马 因该病造成重大损失。目前该病害广泛分布世界产香蕉国家 (Stover， R.H.1962.Fusarial Wilt(PanamaDisease)of Bananas and Other Musa Species.CMI， Kew， Surr。

9、ey， UK ； Koening et al.Fusariumoxysporum f.sp.Cubense consists of a small number of divergent and globally distributed clonallineage.Phytopathology， 1997， 87 ： 915-923)。我国 大陆于 1960 年在广西的西贡蕉上首先发现该病， 为我国进口检疫对象 ( 高乔婉 . 香蕉枯萎 病 . 中国农业百科全书植物病理学卷 . 北京 ： 中国农业出版社， 1996， p.482-483)。该病初 侵染源来自病株及带菌土壤， 病原菌的孢子在土壤。

10、中可存活 8-10 年。该病远距离传播主要 通过种苗、 带菌的土壤和流水。据报道该病菌 1 号小种和 4 号小种对生产造成严重危害。 1 号小种只发现为害粉蕉， 在我国分布较广 ； 4 号小种能为害香蕉和粉蕉， 分布于台湾和广 东。香蕉枯萎病是香蕉的一种毁灭性病害， 具有很强的传染性， 一旦扩散蔓延则难以控制。 据报道台湾香蕉因 4 号小种危害， 不到 10 年时间几乎摧毁了台湾的香蕉产业 (Su HJ et al.Fusarial wilt of Cavendish bananas in Taiwan.PlantDisease， 1986， 70 ： 814-818)， 虽经多年研究和治理，。

11、 至今每年因枯萎病造成香蕉产量严重损失。 广州市番禺地区、 中山市 也发生香蕉枯萎病， 据统计发病面积 5000 多亩， 该病菌与台湾香蕉研究所报道的是一致， 鉴定 12 个菌株均属生理小种 4 号， 近来在福建也发现香蕉枯萎病 ( 林时迟等。福建省香蕉 枯萎病鉴定。福建农业大学学报， 2000， 29(4) ： 465 469)。目前， 香蕉枯萎病仍为害我国 香蕉生产， 并且有继续扩展蔓延的态势， 香蕉枯萎病对我国香蕉产业已构成重大威胁。 0004 目前， 防治香蕉枯萎病的方法主要是综合治理 ： 加强检疫， 严防带病种苗进入无疫 区 ； 推广种植无病组培苗 ； 定期检查蕉园， 发现零星病株应。

12、及时清除销毁， 并撒施石灰或尿 素处理土壤 ； 种植抗病和耐病的香蕉品种 ； 重病区则应轮作其它作物如水稻、 花生、 甘蔗等 经济作物。 该病害的检疫检测技术是以往研究中的薄弱环节， 因此， 国内外目前仍无十分有 效的办法控制香蕉枯萎病扩散蔓延为害， 同时， 无病种苗生产基地的建设对于无疫区农作 物， 尤其是果树等多年生作物香蕉枯萎病的防治至关重要， 植物检疫措施不仅可及时堵截 国外病原菌的传入， 而且也是确保国内经济作物安全出口的必要手段。 0005 香蕉枯萎病是一种毁灭性病害， 一旦进入无发病的地区则无法根除， 而其抗病 育种又极其困难， 所以为了防止香蕉枯萎病从疫区传入非疫区， 建立一套。

13、稳定、 可靠、 简便、 快速、 灵敏的分子检测方法对香蕉苗及种植地区土壤进行检疫、 监测是非常必要 的。在以往的有害病菌检测方面， 我国科研人员主要采取传统的植物病原检测技术， 传 统的检测方法是依据症状、 形态， 在培养基上直接分离培养， 然后在室内通过形态学和生 说 明 书 CN 101205558 B2/12 页 4 理学性状特征鉴定， 再结合致病性测定 (Sun E J et al.Identification of Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4 from soil orhost tissue by cultural characters。

14、. Phytopathology.1978， 68 ： 1672-1673)， 这种检测方法耗时较长， 且必须拥有病原菌详细的 分类资料， 鉴定时还受到其他因子的干扰， 如种内不同菌株间生物学性状变异较大， 而且不 能直接从植物组织中检测出病原菌， 满足不了病害控制中快速、 灵敏、 稳定的检测要求。现 在部分病原菌免疫血清学鉴定方法已经建立， 但是特异性较差， 常常受到相似种的干扰， 也 受到抗血清质量的影响， 血清学检测结果的准确性取决于抗血清的质量。单克隆抗体的专 化性太强， 主要用于流行学中检测菌系， 通常将多种单克隆抗体混合使用， 以消除过度专化 的问题 (Linfield.A rap。

15、id serological test for detecting Fusarium oxysporumf. sp.narcissi in Narcissus.Annals of Applied Biology.1993， 123， 685-93)。目前认为 在检测应用方面， 多克隆抗体要优于单抗， 而多克隆抗体又易与亲缘关系相近的细菌发生 交叉反应。因此， 常规的血清学方法的应用受到了一定的限制。另一种检测方法是种内特 异性寡核苷酸探针检测法， 尽管一些非放射性探针可取代放射性探针， 但是杂交检测法耗 时较长且比较昂贵。 0006 近年来国内外在植物病原菌快速分子检测方面进行了较为深入的研究。

16、， 取得了 一定的进展， 尤其是多聚酶链式反应 (PCR) 技术， 在植物病原检测中的应用日臻完善， 专 化性引物 PCR 技术甚至不需要纯培养， 可直接从样品浸提液中对靶标病原物进行特异性 扩增 (Zhang ZGet al.Molecular detection of Fusarium oxysporum f.sp.niveum and Mycospherella melonis in infectedplant tissues and soil.FEMS Microbiology Letters.2005， 249 ： 39-47 ； Henson， JM.and French R.Th。

17、epolymerase chain reaction and plant disease diagnose.1993， Ann.Rev.Phytopathol.31 ： 81-109.)。植物病原生物的分 子检测技术 ( 以 PCR 技术为平台 ) 是当前该领域的发展方向， 许多重要病原生物都已经建 立了分子检测技术， 越来越多的分子检测试剂盒已经或正在被研制。我国虽然在植物病原 生物分子检测技术方面起步较晚， 但目前也研制出了许多用于植物病原生物检测的技术， 尤其是一些拥有自主知识产权的检测方法， 并将之投入到商业生产和应用中。但在香蕉枯 萎病菌检测方面我国至今还未见有分子检测技术的系统研究。

18、， 更没有相关检测试剂盒的研 制和推广。 0007 鉴于以上原因， 我们通过大量分析香蕉枯萎病菌及其它镰刀菌的指纹图谱多态 性， 针对香蕉枯萎病菌的特异基因设计出了一对特异性引物， 可用于带香蕉枯萎病菌的植 物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测， 对于确保我国香蕉无病种苗生产基地的建设、 安 全出口， 同时及时堵截国外危险性带枯萎病香蕉传入我国具有十分重要的意义。 发明内容 ： 0008 本发明的目的是针对现有技术中香蕉枯萎病菌的生物学检测方法所需周期长、 特 异性差， 灵敏度低的问题， 提供一种香蕉枯萎病菌的特异分子检测基因以及结果可靠、 易于 操作、 灵敏度高的香蕉枯萎病菌的快速检测诊断的方。

19、法。该方法可以试剂盒的形式直接应 用于生产实践， 可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测， 对于确保我国香 蕉无病种苗生产基地的建设、 安全出口， 同时及时堵截国外危险性带枯萎病香蕉传入我国 具有十分重要的意义。 说 明 书 CN 101205558 B3/12 页 5 0009 本发明的目的是这样实现的， (1) 本发明所述的香蕉枯萎病菌的检测基因， 其特征 在于在 Genbank 数据库中未发现同源序列， 为香蕉枯萎病菌的特异基因， 序列如下 ： 0010 10 20 30 40 50 0011 | | | | | 0012 1 TGCCGAGCTG AGTATAAAGA CTT。

20、TACTGAT GTACATATGA ATGACTCGTG 0013 51 GCACGGTACT TGCTGTGCGG GGATCATCCA GGGGATGTAT GAGGAGGCTA 0014 101 GGCTATACAT CGCAAGGGTC TTTGAACGGG ACCACGCGGA TGAGATTGAA 0015 151 GGACCTCTTC GAATGGCAAG AGTCTGTTTC CGATACCTGT GAAGTCGCAG 0016 201 TTTATACTGA ATGTTCAATT AGGCTATTCA CTGGGCTATT GAGCCACCGC 0017 251 GCTCCG。

21、TCGA CATCATCAGC ATCTCCGCTG GCTTCCGAAA CTACTCCAAG 0018 301 GAACTAGACG ACGCTGTCAC AAGAGCCAAA GCTTCTGGTG TTCTTGTCAT 0019 351 AGCTGCAGCG TCAAACTGGC AGAACAAAAA TACCGTCGCA TTCCCAGCTC 0020 401 GGCA 0021 (2) 本发明所述的香蕉枯萎病菌的检测基因， 又叫高效特异扩增序列， 其序列特异 扩增区域的 PCR 引物， 即分子检测引物的序列为 ： 0022 FOC-F ： 5 -ATA TGA ATG ACTCGT 。

22、GGC ACG-3 0023 FOC-R ： 5 -GCT GGG AAT GCG ACG GTA T-3 0024 (3) 本发明所述的香蕉枯萎病菌的检测方法， 包括如下 ： 0025 1) 从被所述香蕉枯萎病菌感染的香蕉植株组织中或存在香蕉枯萎病菌的土壤样 品中分离 DNA ； 0026 2)以该DNA为模板用上述(2)中所述的一对引物FOC-F/FOC-R通过聚合酶链式反 应 (PCR) 扩增出上述 (1) 所述的香蕉枯萎病菌的特异基因产物 ； 0027 3)然后取适量步骤2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离， 经溴化乙锭染色后于紫 外灯下观察， 根据扩增产物的大小判定结果， 如果能特异。

23、性地扩增出 364bp 产物时， 即可判 断所述的香蕉植株组织或土壤样品中存在香蕉枯萎病菌 ； 否则所述的香蕉植株组织或土壤 样品中未存在香蕉枯萎病菌。 0028 当用于检测香蕉植株组织中存在香蕉枯萎病菌时， 采用 CTAB 法提取香蕉枯萎 病菌的 DNA， 按如下的 PCR 反应体系和反应条件用所设计的引物 FOC-F/FOC-R 进行 PCR 扩 增， PCR 反应体系具体可用如下 ： 0029 PCR反应体系25l， 包括1倍PCR反应缓冲液， 1.5mM MgCl2， 0.2mM dNTPs， 1.5UTaq DNA 聚合酶， 引物 FOC-F/FOC-R 各 50pmol 和 10n。

24、g 模板 DNA， d.d.H2O 补足 25l。PCR 反应 条件为 ： 94预变性 3min ； 94变性 30sec， 64退火 30sec， 72延伸 30sec 共 30 个循环 ； 72延伸 10min。 0030 然后将 8l PCR 产物用 1.5琼脂糖电泳分离， 经溴化乙锭染色后于紫外灯下根 据扩增产物的大小判定结果。 0031 当在土壤样品中存在香蕉枯萎病菌条件下， 采用土壤 DNA 提取法 ( 步骤见具体 实施例 3) 提取土壤中香蕉枯萎病菌的 DNA， 按如下的 PCR 反应体系和反应条件用所设计的 引物进行 PCR 扩增， 0032 PCR反应体系25l， 包括1倍P。

25、CR反应缓冲液， 1.5mM MgCl2， 0.2mM dNTPs， 1.5UTaq 说 明 书 CN 101205558 B4/12 页 6 DNA 聚合酶， 引物 FOC-F/FOC-R 各 50pmol 和 10ng 模板 DNA， d.d.H2O 补足 25l。PCR 反应 条件为 ： 94预变性 3min ； 94变性 30sec， 64退火 30sec， 72延伸 30sec 共 30 个循环 ； 72延伸 10min。 0033 然后将 8l PCR 产物用 1.5琼脂糖电泳分离， 经溴化乙锭染色后于紫外灯下根 据扩增产物的大小判定结果。 0034 (4) 本发明的香蕉枯萎病菌分。

26、子检测基因的制备方法， 包括 ： 1) 采用 CTAB 法提取 供试菌株基因组 DNA ； 2)CTAB 法提取各种供试菌株基因组 DNA 后， 应用随机引物进行 RAPD 分析筛选， 筛选得到一条 RAPD 随机引物， 序列为 ： 5 -TGCCGAGCTG-3 ， 使用筛选出的随机引 物 5 -TGCCGAGCTG-3 再次对供试菌株基因 DNA 进行 RAPD 分析， 得到 1 条香蕉枯萎病菌特 异的 RAPD 片段 ； 3) 使用切胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收香蕉枯萎病菌特异的 RAPD 片 段， 连接到载体上， 通过适宜温度热击后， 转化到感受态细胞中， 待细菌恢复正常生长状态， 。

27、并表达质粒编码的抗生素抗性基因后， 在加有含有氨苄青霉素 Amp、 异丙基硫代 -D- 半 乳糖苷和 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -D- 半乳糖苷的 LB 平板上筛选阳性白斑 ； 4) 挑取转化子白 斑的阳性克隆， 采用质粒抽提试剂盒提取质粒DNA， 用内切酶EcoR I和HindIII双酶切检测 证实所克隆片段确实为香蕉枯萎病菌特异性的 DNA 片段 ； 5) 进行 DNA 的测序， 得到香蕉枯 萎病菌特异基因序列。 0035 本发明的香蕉枯萎病菌分子检测基因的制备方法具体如下 ： 0036 本发明的关键性技术是香蕉枯萎病菌的高效特异扩增的序列(检测基因)及其序 列特异扩增区域(se。

28、quence characterized amplified region， SCAR)的PCR引物。 为了发 现香蕉枯萎病菌的特异基因和设计这些 SCAR 引物， 本发明以我国 3 省 ( 福建、 广东和海南， 此 3 省为我国香蕉枯萎病分布区 )14 株香蕉枯萎病菌和多种尖孢镰刀菌不同专化型、 多种 不同的镰刀菌种以及香蕉植株上常见的几种病原真菌为供试材料 ( 具体菌株见表 1)， 采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA， 具体方法如下 ： 取 50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于 1.5ml 离 心管中， 所述的菌丝粉选自表 1 中的任一种菌株制成的菌丝粉， 加入 900l2 CTAB(。

29、 十六 烷基三甲基溴化铵)提取液(提取液的配方为 ： 2CTAB ； 100m mol/L Tris-HCl(三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐 )， PH8.0 ； 20mmol/L EDTA( 乙二胺四乙酸二钠 )， pH8.0 ； 1.4mol/L NaCl) 和 90l10 SDS( 十二烷基苯磺酸钠 ) 后混匀， 于 55 60水浴 1.5h， 每 10min 振荡混匀 一次， 水浴 1.5h 后离心 (12,000rpm)15min， 取上清液加入与上清液等体积的酚 / 氯仿 / 异 戊醇 ( 酚、 氯仿和异戊醇的体积比为 25:24:1)， 离心 (12,000rpm)5min， 取上清液。

30、 ( 水相 )， 加入与上清液等体积的氯仿抽提一次 (12,000rpm) 离心 5min， 吸上清 (350l)， 加 0.1 体 积 (35l) 的 3mol/L NaAC 溶液和 2 体积 (700l) 的冰无水乙醇， -20下沉淀 30min 后 12,000rpm 离心 5min， 轻轻地倒去上清液， 加入 700l 冰 70乙醇进行洗涤 ( 稍离心， 倾 掉上清 )， 在超净工作台上自然晾干无酒精味后用 1TE(10mmol/L Tris-HCL， 0.1mmol/ L EDTA， pH8.0) 溶液进行溶解， 得到 DNA 溶液， 用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至 50。

31、ng/l 待用。经上述方法提取表 1 中各种供试菌株基因组 DNA 后， 应用随机引物进行 RAPD 分析筛选， 筛选得到一条 RAPD 随机引物 ( 序列为 ： 5 -TGCCGAGCTG-3 )， 使用筛选出的 随机引物 5 -TGCCGAGCTG-3 再次对供试菌株基因 DNA 进行 RAPD 分析， 得到 1 条香蕉枯萎 病菌特异的RAPD片段， 使用UNIQ-10柱式切胶回收试剂盒(上海Sangon公司出品)从琼脂 糖凝胶中回收香蕉枯萎病菌特异的 RAPD 片段 ( 具体切胶回收方法参照 UNIQ-10 柱式切胶 说 明 书 CN 101205558 B5/12 页 7 回收试剂盒说。

32、明书 )， 连接到 pMD18-T vector 载体 ( 日本 KAKARA 公司， 具体连接方法参照 pMD18-T vector 载体说明书 ) 上， 通过 42热击 90Sec， 转化到 E.coli DH5a( 大肠杆菌 ) 的感受态细胞中(感受态细胞购于日本TAKARA公司)， 待细菌恢复正常生长状态， 并表达质 粒编码的抗生素抗性基因 (Amp+) 后， 在加有 Amp/IPTG/X-gal(Amp: 氨苄青霉素 ； IPTG ： 异 丙基硫代-D-半乳糖苷 ； X-Gal ： 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的LB(LB培养基的 配方 ： 酵母膏 5.0g ； 蛋白胨 。

33、10.0g ； 氯化钠 10.0g ； 蒸馏水 1000ml ； 琼脂 20.0g ； pH7.0) 平板 上筛选阳性白班， 挑取转化子白斑的阳性克隆， 采用 H1-1-3 质粒抽提试剂盒 ( 上海 Sangon 公司出品)提取质粒DNA， 用内切酶EcoRI和HindIII双酶切检测证实所克隆片段确实为香 蕉枯萎病菌特异性的 DNA 片段， 并委托 TaKaRa 公司进行 DNA 的测序， 得到香蕉枯萎病菌特 异基因序列。在香蕉枯萎病菌特异 DNA 片段序列的基础上应用 Primer premier5.0 软件设 计 SCAR 引物， 经对供试菌株和福建、 海南、 广东等 3 个中国发生香蕉。

34、枯萎病地区 50 株香蕉 枯萎病菌的特异性进行 PCR 验证 ( 具体的反应体系是 PCR 反应体系 25l， 包括 1 倍 PCR 反 应缓冲液， 1.5mMMgCl2， 0.2mM dNTPs， 1.5U Taq DNA聚合酶， 引物FOC-F/FOC-R各50pmol和 10ng 模板 DNA， d.d.H2O 补足 25l。PCR 反应条件为 ： 94预变性 3min ； 94变性 30sec， 64退火 30sec， 72延伸 30sec 共 30 个循环 ； 72延伸 10min)， 最后确定了 1 对高效扩增 的序列特异扩增区域 SCAR 引物， 此序列特异扩增区域引物在香蕉枯萎。

35、病菌上特异性地扩 增出 364bp 的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植物组织和土样中香蕉枯萎病 菌快速可靠的检测和鉴定。 0037 表 1 供试菌株 0038 Table 1 Tested strains 0039 0040 说 明 书 CN 101205558 B6/12 页 8 0041 注 ： 序号 1-14 为香蕉枯萎病病原菌 ； CGMCC 为中国普通微生物菌种保藏中心 (China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)。 0042 本发明有益效果 ： 本发明方法适用于土样和植物组织中香蕉枯萎病菌的快速可靠 的检。

36、测和鉴定 ( 具体检测结果见表 2)， 对于农业生产和植物检疫领域中香蕉枯萎病的防治 和检疫措施的有效实施具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比， 具有以下的技术优 势和积极效果 ： 0043 1) 结果可靠 ： 本发明方法已经对源于中国发生香蕉枯萎病的福建、 海南、 广东等 地的香蕉枯萎病菌和带香蕉枯萎病菌的土样、 植物组织进行了测试验证， 因此结果可靠性 具有充分的保证 ； 0044 2) 实用性好 ： 本发明所设计出的一对特异性引物， 可用于带香蕉枯萎病菌的植物 组织和土壤的高灵敏度快速分子检测， 同时也可用于我国香蕉无病种苗生产基地的建设、 安全出口， 还可用于海关检疫口岸对香蕉枯萎。

37、病菌的检测， 及时堵截国外危险性带枯萎病 菌香蕉传入我国 ； 说 明 书 CN 101205558 B7/12 页 9 0045 3) 操作简便快速 ： 应用本发明方法， 对带香蕉枯萎病菌的土样和植物组织进行病 菌 DNA 提取、 PCR 扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果， 无需对扩增产物进行限制性内 切酶酶切。一般整个检测过程可在 12 小时内完成 ； 0046 4)检测灵敏度高 ： 应用本发明所设计的SCAR引物的扩增灵敏度达到10fg， 因此本 方法的实用性强， 可满足对带菌土壤和发病植物组织中存在的香蕉枯萎病菌进行快速可靠 的检测和鉴定的需要。 0047 表 2 验证引物对香蕉枯萎。

38、病菌特异性所用菌株、 样本及 PCR 检测结果 0048 Table2 Specificity of primers in detecting Fusarium oxysporum f.sp. cubense from 0049 different strains and samples by PCR 0050 说 明 书 CN 101205558 B8/12 页 10 0051 说 明 书 CN 101205558 B9/12 页 11 0052 注 ： 序号 1-14 为香蕉枯萎病病原菌 ； CGMCC 为中国普通微生物菌种保藏中心 (China GeneralMicrobiologica。

39、l Culture Collection Center) ； + 表示能特异性地扩增 出序列为 364bp 的 DNA 片段 ； - 表示未能特异性地扩增出序列为 364bp 的 DNA 片段 ； S 表示 具有特异性 ； NS 表示无特异性。 附图说明 ： 0053 图 1 为本发明所要检测的香蕉枯萎病菌的特异 PCR 扩增图。 0054 图中 ： M为100bp ladder分子量marker， 1泳道为阴性对照， 2-10泳道为尖镰孢古 巴专化型 ( 香蕉枯萎病菌 )， 11 泳道为尖镰孢黄瓜专化型， 12 泳道为尖镰孢茄专化型， 13 泳 道为豌豆腐皮镰孢， 14 泳道为稻瘟病菌， 1。

40、5 泳道为致病疫霉菌。 说 明 书 CN 101205558 B10/12 页 12 0055 图 2 为本发明香蕉枯萎病菌的灵敏性检测及巢式 PCR 扩增结果图。 0056 图中 ： M 为 100bp ladder 分子量 marker， 1 泳道为 1g， 2 泳道为 500ng， 3 泳道为 100ng， 4 泳道为 10ng， 5 泳道为 1ng， 6 泳道为 100pg， 7 泳道为 10pg， 8 泳道为 1pg， 9 泳道为 100fg， 10 泳道为 10fg， 11 泳道为阴性对照。 0057 图 3 为本发明香蕉发病组织和带菌土壤的检测结果图。 0058 图中 ： M 为。

41、 100bp ladder 分子量 marker， 1 泳道为阳性对照， 2 泳道为阴性对照， 3 泳道为发病的香蕉组织， 4 泳道为发病土壤， 5 泳道为健康香蕉组织， 6 泳道为健康香蕉组织 用真核通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增。 具体实施方式 ： 0059 本发明的技术内容包括香蕉枯萎病菌的特异检测基因和特异检测引物， 所设计的 引物及其序列为 ： FOC-F ： 5 -ATA TGAATG ACT CGT GGC ACG-3 ， FOC-R ： 5 -GCT GGGAAT GCG ACG GTA T-3 。利用该引物可从香蕉枯萎菌株上特异扩增出 364bp 的产物。 0060 。

42、实施例 1 0061 香蕉枯萎病菌的特异引物 FOC-F/FOC-R 的 PCR 扩增。 0062 香蕉枯萎病菌检测基因的检测试剂盒， 包括以下成分 ： 0063 其特异引物及其序列为 ： 0064 FOC-F ： 5 -ATA TGA ATG ACT CGT GGC ACG-3 0065 FOC-R ： 5 -GCT GGG AAT GCG ACG GTA T-3 0066 其 试 剂 盒 PCR 反 应 体 系 25l， 包 括 1 倍 PCR 反 应 缓 冲 液， 1.5mM MgCl2， 0.2mMdNTPs， 1.5UTaq DNA 聚合酶， 引物 FOC-F/FOC-R 各 50p。

43、mol 和 10ng 模板 DNA， d.d.H2O 补足 25l。PCR 反应条件为 ： 94预变性 3min ； 94变性 30sec， 64退火 30sec， 72延 伸 30sec 共 30 个循环 ； 72延伸 10min。 0067 检测的特异性 ： 除了来自我国枯萎病发生地海南、 广东和福建等省份的香蕉枯萎 菌株可特异地扩增出 364bp 的产物外， 检测了 Fusarium oxysporum 的非古巴专化型、 其它 镰刀菌 Fusarium spp 及其它的真菌和细菌等菌株， 均未能扩增出任何产物。 0068 检测的灵敏性 ： 用不同浓度的香蕉枯萎病菌 DNA 进行灵敏性检测。

44、， 最低的检测率 为 10fg 的纯 DNA。灵敏性检测巢式 PCR， 其特征在于引物及其序列为 ： 0069 FOC-NF ： 5 -GAT GAG ATT GAA GGA CCT CTT CG-3 0070 FOC-NR ： 5 -TCT AGT TCC TTG GAG TAG TTT CGG-3 0071 其 试 剂 盒 PCR 反 应 体 系 25l， 包 括 1 倍 PCR 反 应 缓 冲 液， 1.5mM MgCl2， 0.2mMdNTPs， 1.5UTaq DNA 聚合酶， 引物 FOC-F/FOC-R 各 50pmol 和 10ng 模板 DNA， d.d.H2O 补足 25l。

45、。PCR 反应条件为 ： 94预变性 3min ； 94变性 30sec， 64退火 30sec， 72延 伸 30sec 共 30 个循环 ； 72延伸 10min。 0072 实施例 2 0073 发病植物组织中香蕉枯萎病菌的检测。 0074 分别取香蕉枯萎病的发病组织和人工接种发病的香蕉组织采用 CTAB 法提取 DNA， 取 1l DNA 按上述试剂盒实施的方法进行 PCR 扩增， 其试剂盒 PCR 反应体系 25l， 包括 1 倍 PCR 反应缓冲液， 1.5mM MgCl2， 0.2mM dNTPs， 1.5UTaq DNA 聚合酶， 引物 FOC-F/FOC-R 各 说 明 书 。

46、CN 101205558 B11/12 页 13 50pmol 和 10ng 模板 DNA， d.d.H2O 补足 25l。PCR 反应条件为 ： 94预变性 3min ； 94变 性 30sec， 64退火 30sec， 72延伸 30sec 共 30 个循环 ； 72延伸 10min。电泳检测扩增 产物， 结果见图 3， 见到一条清晰的分子量为 364bp 的特异条带， 因而判断香蕉枯萎病的发 病组织和人工接种发病的香蕉组织均感染香蕉枯萎病菌。 0075 实施例 3 0076 发病土壤样品中香蕉枯萎病菌的检测。 0077 1) 从发病土壤样品中提取 DNA ： 0078 取过筛的土壤冷冻抽。

47、干 24-48h 后加少量石英砂， 倒入液氮充分研磨， 将研磨 后的土壤细粉分装至 1.5ml 离心管中， 每管加入 500l0.4脱脂奶粉溶液， 涡旋混匀。 12000rpm 离心 15min。取上清加入等体积蛋白酶 K 缓冲液， 加终浓度为 10g/ml 蛋白酶 K， 55水浴1-3h。 水浴结束后， 加入1/2体积的7.5M NH4AC溶液， 上下颠倒混匀。 12000rpm离 心15min。 吸上清加2倍体积无水乙醇-20沉淀(沉淀时间1.5h)。 沉淀结束后， 12000rpm 离心 15min。用 70乙醇洗涤沉淀后倾去， 室温晾干。每份样品所提 DNA 用 10l TE( 或 无。

48、菌超纯水 ) 溶解，20保存备用。 0079 2) 香蕉枯萎病菌的 PCR 检测 0080 取 1l DNA 按试剂盒实施的方法进行 PCR 扩增， 其试剂盒 PCR 反应体系 25l， 包括 1 倍 PCR 反应缓冲液， 1.5mM MgCl2， 0.2mM dNTPs， 1.5U Taq DNA 聚合酶， 引物 FOC-F/ FOC-R 各 50pmol 和 10ng 模板 DNA， d.d.H2O 补足 25l。PCR 反应条件为 ： 94预变性 3min ； 94变性 30sec， 64退火 30sec， 72延伸 30sec 共 30 个循环 ； 72延伸 10min。电泳检 测扩增。

49、产物， 结果见图 3， 见到一条清晰的分子量为 364bp 的特异条带， 判断发病土壤样品 侵染香蕉枯萎病菌。 0081 实施例 4 0082 本发明对无感染香蕉枯萎病菌的香蕉植物组织和土壤样品进行同实施例2和3的 实验， 未发现分子量为 364bp 的特异性扩增条带。 0083 从以上结果可知， 对所供试的香蕉植株组织或土壤样品进行总 DNA 提取， 使用香 蕉枯萎病菌的 DNA 序列特异扩增区域的 SCAR 引物 FOC-F/FOC-R 进行 PCR 扩增， 如果能特异 性地扩增出 364bp 的产物， 即可判断香蕉植株组织感染了香蕉枯萎病菌或土壤中存在了香 蕉枯萎病菌。 0084 序列表 0085 福建省农业科学院植物保护研究所 0086 香蕉枯萎病菌分子检测基因及其检测方法 0087 DNA 0088 1 0089 PatentIn version 3.1 0090 1 0091 404 0092 DNA 0093 香蕉枯萎病 (Fusarium oxysporum f.sp.) 0094 1 说 明 书 CN 101205558 B12/12 页 1。