技术领域
本发明涉及一种减少生物法丙烯酰胺生产中副产物丙烯酸的方 法。
背景技术
生物法丙烯酰胺生产过程中，生产菌会同时产生腈水合酶和腈水 解酶，因此生物催化剂在催化丙烯腈发生水合反应生成丙烯酰胺的同 时也会催化部分丙烯酰胺发生水解反应生成副产物丙烯酸。丙烯酸的 生成使反应生成液的电导率过高，杂质含量高，不仅增加离子交换树 脂精制系统的处理负荷，而且会增加原料丙烯腈的消耗。一般生产过 程中反应生成液的丙烯酸的含量在2000ppm左右，通过研究发现丙 烯酸的生成占反应液电导率的60％以上。通常减少生产中副产物丙烯 酸的方法是在生产菌种分离纯化过程中根据菌落的形态来选择低产 丙烯酸的菌种。该方法在实际应用中效果不明显，生产中丙烯酸的生 成量波动很大。
发明内容
本发明的目的是通过向生产菌种分离纯化的固态培养基中加入 适量的丙烯酰胺来对生产菌种进行定向选择，从而获得低产丙烯酸的 生产菌种，利用该菌种制备生物催化剂并用于催化丙烯腈水合反应， 从而达到减少催化反应中副产物丙烯酸生成量的目的。
丙烯酰胺是生理毒性物质，它能够使生物的某些蛋白质变性甚至 导致其死亡。利用富产丙烯酸的生产菌在代谢过程中产生的腈水解酶 相对较多，对丙烯酰胺的适应性相对较强的特点，采用在生产菌种分 离纯化的固态培养基中加入适量的丙烯酰胺，实现对低产丙烯酸菌种 和富产丙烯酸菌种的定向筛选，从而在生产菌种分离纯化过程中获得 低产丙烯酸的菌种，利用该菌种制备生物催化剂并用于催化丙烯腈水 合反应，进而达到减少催化反应中副产物丙烯酸的生成量，降低反应 生成液电导率的目的。
一种减少生物法丙烯酰胺生产中副产物丙烯酸的方法，首先利用 丙烯酰胺生产菌(节杆菌，拉丁文名称Arthrobacter sp.原始菌种可 在中国科学院微生物研究所购买，菌种编号：As 1.8)原有固态培养 基(主要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、琼 脂)对生产菌种进行初步筛选，将产酶能力在1200×104ugAAm/ml·h的菌种作为初选合格菌种，然后对初选合格的菌种利 用以原有固态培养基(主要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫酸镁、 磷酸氢二钾、琼脂)为基础加入占培养基总质量0.1～0.5％的丙烯酰 胺后形成的新的固态培养基进行再次筛选。在新的固态培养基上，初 选合格菌种会出现有的能生长，有的不能生长的情况，从初选合格菌 种中淘汰在新固态培养基上能生长的菌种，剩下的菌种就是低产丙烯 酸的生产菌种，利用该菌种制备生物催化剂并用于催化丙烯腈水合反 应，从而达到减少催化反应中副产物丙烯酸的生成量，降低反应生成 液电导率的目的。
低产丙烯酸生产菌种筛选培养基的制备方法，丙烯酰胺在高温条 件下灭菌会发生聚合，影响培养基中丙烯酰胺的含量和定量，因而采 用不同的灭菌方法对培养基组分分开灭菌，具体操作过程如下：首先 用紫外线对丙烯酰胺晶体进行单独灭菌10～30分钟，再将丙烯酰胺 生产菌原有固态培养基(主要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫酸 镁、磷酸氢二钾、琼脂)在121℃，0.12Mpa的条件下灭菌18～20分 钟，待其温度降至50～60℃时，最后在无菌条件下加入经紫外线灭 菌后的丙烯酰胺晶体，并用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，将其制备成筛选 生产菌种的固态平板培养基后备用。
本方法能够将催化反应生成液中的丙烯酸含量由2000ppm左右 降至500ppm以下，反应生成液的电导率由3000us/cm左右降至 300us/cm以下。由于利用含丙烯酰胺的固态培养基对生产菌种进行 了定向选择，获得了低产丙烯酸的生产菌种，使生产过程中副产物丙 烯酸的生成量显著减少，而且实际生产应用中效果稳定。
具体实施方式
实施例1
腈水合酶生产菌种分离纯化过程中，首先利用原固态培养基(主 要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、琼脂)对 保藏菌种进行初步的筛选，获得产酶能力在1200×104ugAAm/ml·h 的初选合格菌种15支，编号为A1～A15。制备含丙烯酰胺0.5％的固态 培养基，将占培养基总质量0.5％的丙烯酰胺放到无菌的三角瓶中， 在无菌操作间的超净工作台上用紫外线照射10～30分钟，将丙烯酰 胺生产菌原有固态培养基(主要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫 酸镁、磷酸氢二钾、琼脂)在121℃，0.12Mpa的条件下灭菌18～20 分钟，待其温度降至50～60℃时，再在无菌条件下加入经紫外线灭 菌后的丙烯酰胺，并用无菌的玻璃棒搅拌均匀，用配制好的培养基制 成筛选生产菌种的新固态平板培养基。初选合格的菌种在新固态培养 基中进行培养，15支初选合格的菌种中A4和A8不能在新固态培养基 上生长，其它均能在新固态培养基上生长，因此选择A4和A8菌种作 为最终生产菌种。利用生产菌种A4制备的生物催化剂催化丙烯腈水合 反应获得的反应生成液中丙烯酸含量和电导率与利用A10作为生产菌 种获得的反应生成液的情况对比如下表：
菌种编号 丙烯酸含量ppm 电导率us/cm A4 462 397 A10 1970 1642
实施例2
腈水合酶生产菌种分离纯化过程中，首先利用原固态培养基(主 要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、琼脂)对 保藏菌种进行初步的筛选，获得产酶能力在1200×104ugAAm/ml·h 的初选合格菌种13支，编号为B1～B13。制备含丙烯酰胺0.3％的固态 培养基，将占培养基总质量0.3％的丙烯酰胺放到无菌的三角瓶中， 在无菌操作间的超净工作台上用紫外线照射10～30分钟，将丙烯酰 胺生产菌原有固态培养基(主要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫 酸镁、磷酸氢二钾、琼脂)在121℃，0.12Mpa的条件下灭菌18～20 分钟，待其温度降至50～60℃时，再在无菌条件下加入经紫外线灭 菌后的丙烯酰胺，并用无菌的玻璃棒搅拌均匀，用配制好的培养基制 成筛选生产菌种的新固态平板培养基。初选合格的菌种在新固态培养 基中进行培养，13支初选合格的菌种中B6不能在新固态培养基上生 长，其它均能在新固态培养基上生长，因此选择B6菌种作为最终生产 菌种。利用生产菌种B6制备的生物催化剂催化丙烯腈水合反应获得的 反应生成液中丙烯酸含量和电导率与利用B15作为生产菌种获得的反 应生成液的情况对比如下表：
菌种编号 丙烯酸含量ppm 电导率us/cm B6 350 318 B15 1882 1555
实施例3
腈水合酶生产菌种分离纯化过程中，首先利用原固态培养基(主 要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、琼脂)对 保藏菌种进行初步的筛选，获得产酶能力在1200×104ugAAm/ml·h 的初选合格菌种18支，编号为C1～C18。制备含丙烯酰胺0.1％的固态 培养基，将占培养基总质量0.1％的丙烯酰胺放到无菌的三角瓶中， 在无菌间的超净工作台上用紫外线照射10～30分钟，将丙烯酰胺生 产菌原有固态培养基(主要成份：葡萄糖、酵母膏、氯化钠、硫酸镁、 磷酸氢二钾、琼脂)在121℃，0.12Mpa的条件下灭菌18～20分钟， 待其温度降至50～60℃时，再在无菌条件下加入经紫外线灭菌后的 丙烯酰胺，并用无菌的玻璃棒搅拌均匀，用配制好的培养基制成筛选 生产菌种的新固态平板培养基。初选合格的菌种在新固态培养基中进 行培养，18支初选合格的菌种中C2和C10不能在新固态培养基上生长， 其它均能在新固态培养基上生长，因此选择菌种C2和C10作为最终生 产菌种。利用生产菌种C10制备的生物催化剂催化丙烯腈水合反应获 得的反应生成液中丙烯酸含量和电导率与利用C1作为生产菌种获得 的反应生成液的情况对比如下表：
菌种编号 丙烯酸含量ppm 电导率us/cm C10 230 200 C1 1430 1153