一种提高天然产溶剂梭菌发酵产物中总溶剂转化率的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102533720 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102533720 A *CN102533720A* (21)申请号 201010600206.X (22)申请日 2010.12.22 CCTCC NO:M 2010355 2010.12.17 C12N 15/01(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 7/16(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (71)申请人 上海工业生物技术研发中心 地址 201201 上海市浦东新区龙东大道 6101 号 8 幢 。

2、2 层 202 室 (72)发明人 蒋宇 陈军 钱峰慧 杨晟 姜卫红 (74)专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限 公司 31204 代理人 缪利明 (54) 发明名称 一种提高天然产溶剂梭菌发酵产物中总溶剂 转化率的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种提高天然产溶剂梭菌发酵 产物中总溶剂的转化率的方法， 通过化学诱变并 抑制由丁酰辅酶 A 到丁酸的代谢途径来实现， 具 体的， 通过对丙酮丁醇梭菌重组菌株进行诱变筛 选并敲除丁酸激酶编码基因使该酶失活的方法减 少酸的积累， 从而有效提高发酵产物中总溶剂的 转化率。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 1。

3、0 页 序列表 20 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 20 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种提高天然产溶剂梭菌发酵产物中总溶剂转化率的方法， 其特征在于， 通过化学 诱变并抑制由丁酰辅酶 A 到丁酸的代谢途径构建天然产溶剂梭菌变体来实现。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述抑制由丁酰辅酶A到丁酸的代谢途径通 过抑制磷酸丁酰转移酶和 / 或丁酸激酶的活性来实现。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述抑制丁酸激酶活性通过中断丁酸激酶 编码基因来实现。 4.如权利要。

4、求3所述的方法， 其特征在于， 所述中断丁酸激酶编码基因通过Targetron 基因敲除技术实现。 5. 如 权 利 要 求 1-4 中 任 一 项 所 述 的 方 法，其 特 征 在 于，所 述 天 然 产 溶 剂梭菌为 C.acetobutilicum，C.beijerinckii，C.saccharobutylicum， C.saccharoperbutylacetonicum，C.aurantibutyricum，C.butyricum， C.casaveris，C.pasteurianum，C.puniceum，C.sporogenes，C.tetanomorphum， C.ther。

5、mosaccharolyticum， 或 C.felsineum。 6. 如 权 利 要 求 5 所 述 的 方 法，其 特 征 在 于，所 述 产 溶 剂 梭 菌 为 Clostridiumacetobutylicum ATCC 824。 7. 如 权 利 要 求 6 所 述 的 方 法， 其 特 征 在 于， 所 述 C.acetobutilicum 菌 株 为 Clostridiumacetobutylicum CCTCC M 94061。 8.一种Clostridium acetobutylicum的变体， 在Clostridium acetobutylicum CCTCC M9406。

6、1 中敲除了乙酰乙酸脱羧酶基因 adc， 并经过化学诱变， 保藏号为 ： CCTCC M 2010355。 9.一种Clostridium acetobutylicum的变体， 在Clostridium acetobutylicum CCTCC M2010355 的基础上敲除丁酸激酶基因 buk。 10. 如权利要求 1 7 任一项所述的方法构建的天然产溶剂梭菌变体在发酵生产正丁 醇中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102533720 A 2 1/10 页 3 一种提高天然产溶剂梭菌发酵产物中总溶剂转化率的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 具体地说， 是关于一种提高天。

7、然产溶剂梭菌发酵 产物中总溶剂的转化率的方法。 背景技术 0002 丁醇是具有多种用途的大宗基础原料， 在染料、 油漆、 塑料、 树脂、 橡胶等化学化 工领域中， 可用作多种有机化合物合成的前体 ； 是抗生素及合成药生产过程中所必不可 少的溶媒 ； 同时也是食品、 香料工业的食品级抽提剂。更重要的是， 丁醇还是一种辛烷值 (motoroctane number) 高于乙醇的优质燃料和燃料添加剂。研究表明， 丁醇的蒸汽压和蒸 发热分别为 0.63psi 和 141.3kcal kg-1， 低于乙醇的 2.25psi 和 204.1kcal kg-1； 其高沸点 (118 ) 和低蒸汽压有助于汽车。

8、的冷启动 ； 由于丁醇的疏水性比乙醇更强， 因此更易于与 汽、 柴油烃类燃料相混溶 ； 而丁醇的完全燃烧性， 可大大降低尾气的CO2排放， 且不发生残留 烃污染， 对净化空气十分有利。显然， 上述优点有可能使丁醇成为未来发动机新型绿色燃 料， 替代矿化燃料的可持续发展的再生能源之一。 0003 丁醇可通过化学法和生物法生产。 经微生物厌氧发酵生产丁醇等溶剂的方法可追 溯到上世纪初的第一次世界大战期间。由于丙酮丁醇梭菌在发酵过程中产生三种溶剂丙 酮、 丁醇和乙醇 (Acetone-Butanol-Ethanol， ABE)， 故产溶剂发酵亦称 “ABE 发酵” 。其中， 丁醇和丙酮是主要发酵产物。

9、， 其代谢网络如图 1 所示。 0004 由于丙酮丁醇梭菌生产的溶剂除了 60-70为丁醇外， 同时还会有 20-30的丙 酮和 10的乙醇这些低值副产物， 因此提高丁醇比例以及转化率是提高生物丁醇经济性的 有效手段。第一种思路是通过在本身不产丁醇的宿主菌中构建异源丁醇产生途径， 如表 1 所示。 0005 表 1、 正丁醇发酵基因工程菌 0006 0007 由表 1 可知， 前四种基因工程的丁醇代谢工程均是在宿主菌中构建从乙酰辅酶 A 到丁醇的异源代谢途径 ( 即乙酰辅酶 A 乙酰乙酰辅酶 A - 羟基丁酸辅酶 A 巴豆酰 辅酶 A 丁酰辅酶 A 丁醛丁醇六步生物催化反应 ) ； 而最后一种。

10、基因工程大肠杆菌通 说 明 书 CN 102533720 A 3 2/10 页 4 过构建以 L- 苏氨酸为起始底物的酮酸途径生产正丁醇。由于本身不产丁醇的菌株， 如表 1 中所列的宿主菌， 对丁醇毒性的耐受能力非常有限， 因此利用这些菌生产正丁醇的代谢工 程任重道远。 0008 另一种思路是对天然产丁醇的丙酮丁醇梭菌进行改造， 降低副产物丙酮比例以提 高丁醇比例， 已报道的方法主要有以下几种 ： 0009 (1) 抑制或中断从乙酰乙酰辅酶 A 到丙酮代谢途径的辅酶 A 转移酶 (Coenzyme Atransferase， CoAT) 或乙酰乙酸脱羧酶酶活 0010 Tummala 于 20。

11、03 年报道了利用反义 RNA 技术抑制丙酮丁醇梭菌中的乙酰乙酸脱 羧酶 (acetoacetate decarboxylase， AADC) 基因 adc 的转录， 但丙酮产量并未减少 ； 接着， Tummala 利用相同的方法抑制该菌中辅酶 A 转移酶 (coenzyme A transferase， CoAT) 基 因 ctfAB 的转录， 虽然抑制了丙酮的产生， 但由于该法不可避免同时抑制了丁醇和乙醇合 成途径关键酶基因 adhE 的转录， 几乎无乙醇和丁醇的产生 (Tummala， S.B.， Welker， N.E.， Papoutsakis， E.T.， Journal of b。

12、acteriology 2003 185 ： 1923-1934) ； 因此在抑制 ctfAB 的转录基础上过表达乙醇脱氢酶 E(Alcohol dehydrogenase E， ADHE)， 但只提高了乙醇的 产量， 丁醇的产量只恢复到野生菌水平， 丁醇比例反而下降 (Tummala， S.B.， Junne， S.G.， Papoutsakis， E.T.， Journal of bacteriology 2003 185 ： 3644-3653)。 0011 可见， 抑制辅酶 A 转移酶活性无法提高丁醇比例 ； 而抑制乙酰乙酸脱羧酶的基因 转录不能彻底阻断丙酮合成。因此， 要阻断丙酮的合。

13、成， 提高丁醇比例， 必须彻底抑制乙 酰乙酸脱羧酶活性。这可以通过对该基因进行敲除的手段实现。在丙酮丁醇梭菌进行基 因敲除的方法包括 ： 1) 非复制型整合载体的同源重组 ； 2) 复制型整合载体的同源重组 ； 3) 基于原核生物二类内含子的 Targetron 基因敲除技术。第一种使用非复制型载体， 已成 功敲除的有 buk， pta， aad， 及 solR 基因 (Green， E.M.， and Bennett， G.N.Appl Biochem Biotechnol1996.57-58 ： 213-221 ； Green， E.M.， Boynton， Z.L.， Harris， L。

14、.M.， Rudolph， F.B.， Papoutsakis， E.T.， and Bennett， G.N.Microbiology 1996.142(Pt 8) ： 2079-2086 ； Nair， R.V.， Green， E.M.， Watson， D.E.， Bennett， G.N.， and Papoutsakis， E.T.Journal of bacteriology 1999 181 ： 319-330.)。第二种方法是采用可在丙酮丁醇梭菌中复制的穿梭 质粒来构建敲除质粒， 因为具有可复制的起点， 该方法增加了同源重组的机会。Harris 通 过该方法， 成功敲除了 s。

15、po0A(Harris， L.M.， Welker， N.E.， and Papoutsakis， E.T.Journal of bacteriology 2002.184 ： 3586-3597)。第三种方法是最近发展起来的不依赖于同源 重组的新方法。已报道的利用 Targetron 技术的敲除载体有 pMAL007(Heap， J.T.， et al， J.Microbiol.Methods， 2007， 70 ： 452-464)， pSY6(Shao， L.， et al.， Cell Res.， 2007， doi ： 10.1038/cr.2007.91)。 0012 上海生物丁醇。

16、协作组蒋宇等通过敲除该菌丙酮合成途径关键酶 ( 乙酰乙酸脱羧 酶 ) 的基因， 基本阻断了丙酮的产生， 并经代谢流分析与发酵优化将丁醇的比例提高到 80以上 (Jiang et al， Metab Eng， 2009.11(4-5) ： 284-91)。但是乙酸积累增加， 溶剂转 化率下降。 0013 (2) 传统诱变法 0014 根据专利号 ZL 95111733.5 的中国发明专利， 通过传统的分离诱变获得的突变菌 株Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061， 其发酵液中丁醇的比例从原来的60提 说 明 书 CN 102533720 A 4 3/10。

17、 页 5 高到 70， 丁醇丙酮乙醇为 7 2 1， 以 8玉米糊化液分批发酵时丁醇产量达到约 14.5g/L。 0015 综上所述， 通过阻断丙酮等副产物的合成可以提高丁醇比例， 如何进一步减少酸 的积累并提高溶剂的转化率和产率， 对于降低丁醇的生产成本具有重要意义。 发明内容 0016 本发明的目的就在于通过减少产溶剂梭菌酸的积累， 提高产溶剂梭菌发酵产物中 总溶剂的转化率的方法。 0017 本发明的提高梭菌发酵产物中总溶剂的转化率的方法， 通过化学和基因工程手段 构建天然产溶剂梭菌变体， 减少产溶剂梭菌酸的积累来实现， 具体地， 所述的化学诱变手段 是使用诱变剂亚硝基胍对菌株进行诱变筛选。

18、。所述的基因工程手段即指抑制由丁酰辅酶 A 到丁酸的代谢途径， 通过抑制磷酸丁酰转移酶 (phosphotrans butyrylase， ptb) 和 / 或丁 酸激酶 (butyrate kinase， buk) 的活性来实现。 0018 更具体地， 所述抑制丁酸激酶活性通过中断丁酸激酶编码基因 (buk 基因 ) 来实 现。 0019 更具体地， 所述中断丁酸激酶编码基因 (buk 基因 ) 通过 Targetron 基因敲除技术 实现。 0020 根据本发明， 所述天然产溶剂梭菌为 C.acetobutilicum， C.beijerinckii， C.saccharobutylicu。

19、m，C.saccharoperbutylacetonicum，C.aurantibutyricum， C.butyricum，C.casaveris，C.pasteurianum，C.pyniceum，C.sporogenes， C.tetanomorphum， C.thermosacharolyticum， 或 C.felsineum。优选的， 所述产溶剂梭菌 为 Clostridiumacetobutylicum ATCC 824。更优选的， 所述 C.acetobutilicum 菌株为 Clostridiumacetobutylicum CCTCCM 94061。 0021 另 一 方。

20、 面， 本 发 明 提 供 了 一 种 Clostridium acetobutylicum 的 变 体， 在 C.acetobutylicumCCTCC M 94061 重组菌株基础上经化学诱变， 已于 2010 年 12 月 17 日保 藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 ： CCTCC M 2010355。 0022 本 发 明 还 提 供 了 另 一 种 Clostridium acetobutylicum 的 变 体，在 Clostridiumacetobutylicum CCTCC M 2010355 基础上， 基因组中丁酸激酶编码基因 (buk 基因 ) 被敲除。 0023 。

21、本发明还提供了一种乙酰乙酸脱羧酶编码基因 (adc) 和丁酸激酶编码基因 (buk) 敲除的产溶剂梭菌变体在生产正丁醇的应用。 附图说明 0024 图 1 是丙酮丁醇梭菌的 ABE 代谢网络的示意图。 0025 图2是Clostridium acetobutylicum adc中转化质粒pSY7， 经过液体培养基传代 9 天， 涂布平板后的菌落的菌落 PCR 电泳图， 其中， 泳道 M 为 DNA Marker， 泳道 1-14 为 14 个 菌落， 泳道 + 为阳性对照 pSY6/7。上图是以 Em-N 和 Em-C 为引物扩增的结果， 下图是以引物 Cm-N 和 Cm-C 扩增的结果。 0。

22、026 图 3 是将图 2 中的 4， 11， 13， 14 号菌落为模板， 以 adc163-177 和 adc714-699 为引 说 明 书 CN 102533720 A 5 4/10 页 6 物扩增结果。+ 为阳性对照， 以 Clostridium acetobutylicum adc 菌落为模板， - 为阴性对 照， 以 Clostridium acetobutylicum 菌落为模板。 0027 图 4 是 buk-targetron 片段的 PCR 扩增产物电泳图， 其中， 泳道 M 为 DNA Marker ； 泳道 1 为 buk-targetron。 0028 图 5 是 。

23、Clostridium acetobutylicum adc-M buk 敲除转化子菌落 PCR 扩增产物 电泳图， 其中， 泳道 7 是以野生型 Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061 基因组为 模板的扩增产物的电泳结果， 泳道1-6分别为以Clostridium acetobutylicum adc-M转化 子 1-6 号为模板的扩增产物的电泳结果， 泳道 M 为 1kb DNA ladder。 0029 图 6 是 Clostridium acetobutylicum adc-M 的 1-9 号转化子的基因组 PCR 产物 的电泳图， 其中， 泳。

24、道10为以野生型Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061基因组 为模板的电泳结果 ； 泳道 1-9 分别为以 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 的 1-9 号 转化子基因组为模板的电泳结果， 泳道 M 为 1kb DNA ladder。 具体实施方式 0030 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 如 分子克隆 ： 实 验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件， 或生 产厂商推荐的条件进行。 0031 本发。

25、明中提及的重组质粒载体 pSY6-buk 指的是用于敲除 buk 基因的重组质粒载 体。 0032 本发明中提及的 buk-targetron 片段指的是在 IBS， EBS2， EBS1d 位点碱基经修改 后， 用于敲除 buk 基因的片段， 属于 L1.LtrB 内含子一部分， 所述的 L1.LtrB 二类内含子为 原核二类内含子， 包括 ltrA 基因。 0033 本发明使用的菌株和质粒分别为 ： 质粒pSY6， 序列如SEQ ID NO ： 1所示， 为E.coli 和C.acetobutylicum的穿梭质粒， 在C.acetobutylicum中表达红霉素(Ery)抗性基因 ； 质。

26、 粒 pSY7， 序列如 SEQ ID NO ： 2 所示， 是在 pSY6 基础上把其红霉素 (Ery) 抗性基因换成甲砜 霉素 (Thia) 抗性基因得到， 在 C.acetobutylicum 中表达甲砜霉素 (Thia) 抗性基因 ； 质粒 pANS， 序列如 SEQ ID NO ： 3 所示， 具有壮观霉素 (Spc) 抗性 ； 菌株 E.coli ER2275 购自 NEB 公司。 0034 本发明中使用的 PCR 纯化、 DNA 胶回收纯化试剂盒和基因组抽提试剂盒均购自爱 思进 (Axygen) 生物技术有限公司， TargetronTM Gene Knockout System。

27、(TA0100)Kit 购自 Sigma-Aldrich。 0035 本 发 明 使 用 的 工 具 酶 ： KOD DNA 聚 合 酶， 限 制 性 内 切 酶， Taq 聚 合 酶 购 自 Fermentas， T4 连接酶和小牛碱性磷酸酶 (CIAP) 均购自 TaKaRa 公司。 0036 本发明中使用的CGM液体培养基的配方均为 ： 2g(NH4)2SO4， 1g K2HPO4， 0.5gKH2PO4， 0.1g MgSO47H2O， 0.015g FeSO47H2O， 0.01g CaCl2， 0.01g MnSO4H2O， 0.002g CoCl2， 0.002g ZnSO4， 。

28、2g Tryptone， 1g Yeast Extraction， 50g Glucose， 溶于 1L 水中。CGM 固体 培养基配方为在相应液体培养基中加入 1.5 (w/v) 的琼脂粉。 0037 ETM 缓冲液配方如下 ： 270mM 蔗糖， 0.6mM Na2HPO4， 4.4mM NaH2PO4， 10mMMgCl2。 0038 ET 缓冲液配方如下 ： 270mM 蔗糖， 0.6mM Na2HPO4， 4.4mM NaH2PO4。 说 明 书 CN 102533720 A 6 5/10 页 7 0039 P2 培养基配方如下 ： 葡萄糖 60g ； K2HPO4 0.5g ； K。

29、H2PO4 0.5g ； CH3COONH4 2.2g ； MgSO47H2O 0.2g ； MnSO4H2O 0.01g ； NaCl 0.01g ； FeSO47H2O 0.01g ； 氨基苯酸 (-aminobenzoic acid)1mg ； 维生素 B1(thiamine)1mg ； 生物素 (biotin)0.01mg 溶于 1L 水中。 0040 本 发 明 中 的 Clostridium acetobutylicum adc 指 的 是 adc 基 因 敲 除 的 C.acetobutylicumCCTCC M 94061 重组菌株 ( 专利申请号 ： 200810033954。

30、.7)。 0041 本 发 明 中 的 Clostridium acetobutylicum adc-M 指 的 是 在 Clostridium acetobutylicum adc的基础上通过传统诱变筛选得到的变体， 已于2010年12月17日保藏 于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 ： CCTCC M 2010355。 0042 本发明中的 Clostridium acetobutylicum adc-M-buk 指的是在 Clostridium acetobutylicumadc-M 的基础上 buk 基因敲除的 Clostridium acetobutylicum 变体。 0043 。

31、根据产溶剂梭菌的丙酮、 丁醇、 乙醇 (ABE) 代谢途径， 本发明致力于通过抑制副 产物丙酮， 乙酸， 丁酸的合成或积累， 从而提高发酵产物中总溶剂的转化率。为了减少 Clostridium acetobutylicum adc 乙酸和丁酸的积累， 本发明采用化学诱变的手段， 进一 步通过抑制由丁酰辅酶 A 到丁酸的代谢途径， 本发明设法失活该途径中的关键酶丁酸激 酶， 具体地是通过中断丁酸激酶编码基因来失活丁酸激酶。更具体地是 Targetron 基因敲 除技术来中断丁酸激酶编码基因。 0044 本发明通过利用本实验室构建的质粒 pSY6/7(Shao L.， Hu S.， Yang Y.。

32、， Chen J.， Yang Y， Jiang W， Yang S， Cell research， 2007， doi ： 10.1038/cr.2007.91)， 在 Clostridium acetobutylicumATCC 824， Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061 中 进行基因敲除。 0045 本 发 明 通 过 PCR， 扩 增 出 buk 的 targetron 片 断， 将 其 经 XhoI 及 BsrG I 双 酶切后， 与经同样酶切的 pSY6 载体连接， 得到敲除质粒 pSY6-buk， 电转 Clostridium ac。

33、etobutylicumATCC 824或者Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061。 由菌落PCR 鉴定出内含子插入的重组菌。经测序确定 buk 插入了 L1.LtrB 内含子片段。 0046 以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。 0047 实施例 1、 Clostridium acetobutylicum adc 中敲除质粒 pSY6-adc 的丢失 0048 通 过 向 来 源 于 Clostridium acetobutylicum CCTCC M 94061 的 重 组 。

34、菌 Clostridiumacetobutylicum adc CCTCC M 2010355 中电转质粒 pSY7 的方法来消除 Clostridiumacetobutylicum adc 中的 targetron 质粒 pSY6-adc。 0049 将 pSY7 质 粒 经 E.coli ER2275/pANS 在 Cac8 I 位 点 甲 基 化 后，电 转 Clostridiumacetobutylicum adc， 复苏过夜后， 取 100l 细胞液涂布于 34g/ml Thia 的选择性平板， 厌氧箱内于 37培养 48-96 小时后， 挑单菌， 采用菌落 PCR 验证， 然后在 。

35、CGM(Thia34mg/ml) 培养基中传代。具体步骤如下 ： 0050 1.1、 pSY7 质粒的甲基化 0051 将 pANS 转化 E.coli ER2275， 获得 E.coli ER2275/pANS。 0052 制备 E.coli ER2275/pANS 的感受态细胞， 然后将 pSY7 质粒转化 E.coli ER2275/ pANS， 由于 pANS 质粒具有 Spc 抗性， 故在含有 100g/ml Amp， 50g/mlSpc 的 LB 培养基平 说 明 书 CN 102533720 A 7 6/10 页 8 板上过夜培养， 然后挑单菌落至 4ml 加有 100g/ml 。

36、Amp， 50g/mlSpc 的 LB 培养基中， 过 夜培养。 然后， 将获得的含pANS及pSY7的E.coli ER2275， 用质粒抽提试剂盒抽提， 从而获 得 Cac824 I 识别位点已甲基化的质粒 pSY7。 0053 1.2、 电转 pSY7 质粒至 Clostridium acetobutylicum adc 0054 将 Clostridium acetobutylicum adc 在 CGM 平板上划线分离单菌， 在厌氧箱内 37培养 48-96 小时， 挑 Clostridium acetobutylicum adc 的单菌落至 CGM 培养液， 37 培养过夜 ； 然。

37、后， 以 1比例转接至 100ml CGM 培养基中， 于 37培养至 OD600为 0.7 左右， 取 50ml 菌液， 4000rpm， 4离心 10min， 弃去上清 ； 再以 ETM 缓冲液悬浮， 4000rpm， 4离心 10min， 弃去上清 ； 然后以 1.0ml ET 缓冲液悬浮 ； 取 100l 悬浮液， 加入 1-3g pSY6-buk 质粒， 混匀后， 加入电转杯中 (2mm)， 使用 MicroPulserTM电转仪电转， 电击条件为电压 2.0kV， 其余参考使用手册。电击后， 再加入 CGM 培养基 1ml， 37培养 10h 左右， 取 200l 细胞液涂布于含 。

38、Thia 抗性 (34g/ml) 的 CGM 平板， 培养约 2-3 天， 获得具有 Thia 抗性的 Clostridium acetobutylicum adc 转化子。 0055 1.3、 验证引物合成及转化子验证 ： 0056 甲砜霉素基因验证引物 ： 0057 Cm-N ： ATGTTACAGTAATATTGA 0058 Cm-C ： TTATAAAAGCCAGTCATT 0059 红霉素基因验证引物 ： 0060 Em-N ： CCTACGCGTCTTATTTACTTCGTAATT 0061 Em-C ： GTAACGCGTGCGCAAAAGACATAATCG 0062 adc 基。

39、因敲除验证引物 ： 0063 adc163-177 ： GAGCCCTTAGTCAGG 0064 adc714-699 ： AACTTCAGCTCTAGGC 0065 以Clostridium acetobutylicum adc转化子为模板， 以Cm-N和Cm-C为引物， 进行 PCR扩增。 PCR反应条件 ： 95 5min ； 95 30s， 52 30s， 72 1m， 30个循环 ； 72 2min。 0066 取上述PCR产物， 使用琼脂糖凝胶电泳检测， 在0.7kb处有明显条带的转化子则为 电转进 pSY7 质粒的 Clostridium acetobutylicum adc。 。

40、0067 1.4、 传代丢失 pSY6-adc 0068 把上面验证正确的转化子在接5ml CGM液体(含Thia 34mg/ml)中， 给过24小时， 取 200ul 转接新的 5mlCGM 液体 ( 含 Thia 34mg/ml)。反复经过 9 天时间传代， 取 200l 细 胞液涂布于含 Thia 抗性 (34g/ml) 的 CGM 平板。 。以 Em-N 和 Em-C 为引物扩增红霉素基 因， 以 Cm-N 和 Cm-C 为引物扩增氯霉素基因， 采用实施例 1.3 相同的反应体系， 进行 PCR 扩 增。 0069 PCR 反应条件 ： 95 5min ； 95 30s， 52 30s。

41、， 72 1m， 30 个循环 ； 72 2min。 0070 取上述 PCR 产物， 使用琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图 2 所示。根据图 2 结果， 其 中 4， 11， 13， 14 号菌落无法扩增出红霉素基因， 但可以扩增出氯霉素基因。取这 4 个菌落为 模板扩增用引物 adc163-177 和 adc714-699 扩增， 结果如图 3 所示。根据图 3 结果， 4 个菌 落均显示内含子为插入状态， 为发生环出。因此可以认为这 4 个菌的 pSY6-adc 已经丢失。 0071 实施例 2、 Clostridium acetobutylicum adc 的诱变筛选 说 明 书 CN 。

42、102533720 A 8 7/10 页 9 0072 通过亚硝基胍来诱变 Clostridium acetobutylicum adc， 从中筛选溶剂转化率高 的诱变株。具体步骤如下 ： 0073 2.1、 Clostridium acetobutylicum adc 的诱变筛选 0074 将实施例 1 的已经丢失 pSY6-adc 的 Clostridium acetobutylicum adc 在 CGM 平板上划线分离单菌， 在厌氧箱内 37培养 48-96 小时， 挑 Clostridium acetobutylicum adc 的单菌落至 CGM 培养液。 0075 称取 NTG 。

43、溶于 pH6-7.5 的磷酸缓冲液中， 使浓度为 4 毫克 / 毫升。在 6 毫升菌液 中加入 NTG 溶液 2 毫升， 摇匀后 37 度保温半小时， 稀释涂在加有丙烯醇的平板上， 将平板置 于干燥器内， 37 度厌氧培养 48-72 小时， 挑取平板上单菌进行发酵。 0076 2.2、 发酵 0077 将单菌挑至 5ml CGM 培养基， 37下厌氧培养过夜， 将获得的培养液按 5接 种量转接至 50ml CGM 培养基， 培养至对数生长中期， 然后按 10的接种量转接至 150ml 浓度分别为 8的玉米培养基中， 添加 1克碳酸钙， 于 37厌氧培养 48h。然后， 利 用气相色谱测定溶剂。

44、产量。其中部分菌株发酵结果如表 2 所示。将诱变后菌命名为 Clostridiumacetobutylicum adc-M。 0078 表 2、 诱变后发酵结果 0079 0080 实施例 3、 构建 pSY6-buk 质粒载体 0081 通过 PCR， 扩增 buk targetron 片断， 经 XhoI 及 BsrG I 双酶切， 与同样酶切的 pSY6 载体连接， 得到敲除质粒 pSY6-buk。其中， 扩增 buk targetron 的模板及引物设计源 于 Sigma-Aldrich 公司的 TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit。具。

45、体步骤如 下 ： 0082 3.1、 引物设计 0083 参考TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit提供的方法， 分别设计用于 构建 pSY6-buk 质粒载体的引物 buk-IBS、 buk-EBS1d 和 buk-EBS2， 其序列分别为 ： buk-IBS ： 0084 5 -CCGCTCGAGATAATTATCCTTACAACTCAAATTGGTGCGCCCAGATAGGGTG-3 ； 0085 buk-EBS1d ： 0086 5 -CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCAAATTGGTTAACTTACCT。

46、TTCTT 0087 TGT-3 ； 说 明 书 CN 102533720 A 9 8/10 页 10 0088 buk-EBS2 ： 0089 5 -TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTAGTTGTCGATAGAGGAAAGTGTCT-3 。 0090 同时， 还使用由 TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit 提供的通用引 物 EBS。 0091 其中 buk-IBS2 和通用引物 EBS 位于内含子内部， buk-IBS 和 buk-EBS1d 位于内含 子上下游两侧。试剂盒预测的内含子理论插入位点是在基因组 buk 基因的第 。

47、49 和 50 个碱 基之间， 正向插入。 0092 3.2、 buk-targetron 片段制备 0093 参考厂商提供的方法， 使用其提供的模板， 以 buk-IBS， buk-EBS1d， buk-EBS2 和 EBS 为引物， 使用 TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物进行凝胶电泳， 结果如图 4 所示， 根据图 4 的结果， 在 350bp 处有条带， 与预期的结果一 致， 说明经 PCR 扩增得到 buk-targetron 片段。 0094 然后， 使用爱思进 (Axygen) 公司的胶回。

48、收试剂盒纯化回收 PCR 产物， 获得 buk-targetron 片段。 0095 3.3、 pSY6-buk 重组质粒载体构建 0096 将纯化的 buk-targetron 片段经 XhoI 和 BsrGI 酶切， 与同样经 XhoI 及 BsrGI 酶 切的载体 pSY6， 使用 T4 连接酶连接， 将获得的连接产物转化 E.coli DH5 感受态细胞， 并 在含氨卞青霉素 Amp(100mg/L) 的 LB 固体培养基中培养， 筛选， 获得有 Amp 抗性的转化子。 随机挑选 3 个转化子进行测序， 测序结果显示， 获得的转化子均含有如 SEQ ID NO ： 13 所示 的序列，。

49、 即特异性识别 buk 基因插入位点的内含子序列， 该结果显示所获得的质粒在酶切 位点XhoI和BsrGI之间已插入了含buk-targetron片段上下游引物buk-IBS和buk-EBS1d 的 buk-targetron 片段。 0097 根据上述检测结果， 连接产物转化E.coli DH5感受态细胞后获得的阳性转化子 含有重组质粒 pSY6-buk。 0098 实施例 4、 Clostridium acetobutylicum adc-M buk 基因的敲除 0099 将 pSY6-buk 质 粒 经 E.coli ER2275/pANS 在 Cac8 I 位 点 甲 基 化 后，电 转 Clostridiumacetobutylicum adc-M， 复苏过夜后， 取 100l 细胞液涂布于 40g/ml Ery 的选择性平板， 厌氧箱内于37培养48-96小时后， 挑单菌， 采用菌落PCR验证， 具体步骤如 下 ： 0100 4.1、 pSY6-buk 质粒的甲基化 0101 将 pANS 转化 E.coli ER2275， 获得 E.coli ER2275/pANS。 0102 制 备 E.coli ER2275/pANS 的 感 受 态 细 胞，然 后 将 pSY6-buk 质 粒 转 化 E.coliER2275/pANS， 。