一种疟疾疫苗及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102533677 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102533677 A *CN102533677A* (21)申请号 201210005573.4 (22)申请日 2012.01.10 CGMCC NO.5602 2011.12.15 C12N 7/01(2006.01) C12N 15/30(2006.01) C12N 15/866(2006.01) C07K 14/445(2006.01) A61K 39/015(2006.01) A61P 33/06(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 特菲 （天津） 。

2、生物医药科技有限公司 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区洞庭路 220 号天津市国际生物医药 联合研究院实验楼 5 层 S514 室 (72)发明人 吴昕昕 陈剑清 舒特俊 张耀洲 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人 张艳赞 (54) 发明名称 一种疟疾疫苗及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种疟疾疫苗及其制备方法， 属 于生物医药技术领域。本发明通过构建一种重组 家蚕杆状病毒， 并运用杆状病毒表面展示技术将 恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片 段 (MSP119C) 表达于家蚕杆状病毒表面， 以家蚕蛹 作为生物反应器生。

3、产重组杆状病毒， 并以此重组 杆状病毒制备疟疾疫苗。相比于传统的疟疾疫苗 生产具有安全性好、 生产成本低、 产量高、 易于操 作、 适用于大规模生产的特点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 5 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 5 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一种家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c， 该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC No.5602。 2. 一种权利要求。

4、 1 所述家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c的制备方法， 其特征在 于， 所述方法包括以下步骤 ： (1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋 白 gp64 跨膜域基因序列， 通过BamH I/EcoR I 和XhoI/Hind双酶切插入 pFastBacI 载体 多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体 pFastBacI-gp64 ； (2) 由 PCR 扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原基因 MSP119c序列， 其 5 和 3 端分别 引入EcoRI 和XhoI 酶切位点后， 连接到步骤 (1) 所得表面展示载体 pFastBac。

5、I-gp64， 构建 成重组转移质粒 pFastBacI-gp64-MSP119C； (3) 取步骤 (2) 所得的重组转移质粒 pFastBacI-gp64-MSP119C转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞， 在含有卡那霉素、 庆大霉素、 四环素、 X-gal 和 IPTG 的 LB 培养板上进行蓝白斑 筛选， 避光培养 4048h 后挑取白斑， 培养 2024h 后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组， 并 用 M13 通用引物、 MSP119c引物做 PCR 鉴定 ； (4)取步骤(3)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞， 发 病后获得一代病毒悬液 0 4保存，。

6、 提取病毒基因组用 M13 通用引物、 MSP119c引物做 PCR 鉴定， 获得所述家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c。 3. 种权利要求 1 所述的重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c表达的抗原蛋白， 其氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 10 所示。 4. 一种权利要求 3 所述抗原蛋白的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤 ： (1) 将权利要求 1 所述的重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119C感染家蚕 BmN 细胞进行病 毒扩增 ； (2) 针刺接种法接入家蚕蛹 ； (3) 收集表达的权利 3 所述抗原蛋白。 5.一种权利要。

7、求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP119c在疟疾疫苗制备中的应 用。 6. 一种权利要求 3 所述的蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102533677 A 2 1/7 页 3 一种疟疾疫苗及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种疟疾疫苗及其制备方法， 尤其涉及疟疾疫苗制备中的重组质粒和 重组病毒的制备， 属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 据世界卫生组织统计， 全球大约有 3.2 亿人口生活在疟疾流行的地区， 每年夺去 大约 100 万人的性命并导致 4 亿人感染， 而每年各国用于疟疾预防和治疗的资金也达到了 10亿美元。 由于疫区感染。

8、人口的流动性和血液传播等新的传播方式的出现使得疟疾疫情的 控制面临更加严峻的挑战。 每年感染疟疾致死的人群中， 92%为五岁以下的儿童。 因而疟疾 疫苗的研制势在必行， 并已成为疟疾防治中的重要内容。 0003 疟原虫生活史有多个时期， 每个生活时期具有多种抗原， 而且每种抗原具有多个 表位， 而不同宿主的免疫反应也不相同， 所有的这些因素使得疟疾疫苗的研究变得异常困 难。 传统的疟疾治疗主要依赖于药物治疗， 氯喹是一种使用方便、 疗效好且经济的红内期抗 疟药物， 氯喹可以与恶性疟原虫体内的血红蛋白降解产物高铁血红素结合从而影响恶性疟 原虫的解毒， 来达到杀灭疟原虫的目的。任何一种药物经过长时。

9、间的使用之后都会使其作 用受体对其产生一定的耐受性， 由于药剂量不足、 治疗不彻底、 药物半衰期长、 疟疾传播密 度高等都有可能致使恶性疟原虫对氯喹产生抗性， 因此药物疗措施已面临着严重的挑战。 0004 疟疾的临床症状主要发生在疟原虫裂殖子孢子在人体红细胞内无性增殖阶段， 目 前疟疾疫苗研究的热点主要是基于阻止此阶段疟原虫的无性裂殖来预防疟疾的感染。 裂殖 子表面膜蛋白 1C- 末端的 19kD 片段 (MSP119C) 在子孢子侵染红细胞后仍然存在于裂殖子表 面， 可诱导机体T细胞和B细胞产生免疫应答， 因此是当前最重要的疟疾疫苗研制的候选抗 原位点之一。 发明内容 0005 有鉴于此， 。

10、本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的疟疾疫苗。本发明通过构建 一种重组家蚕杆状病毒， 并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白 1C- 末端的 19kD 片段 (MSP119C) 展示在家蚕杆状病毒表面 MSP119C基因通过与 GP64 基因的 跨膜 (TM) 基因与信号肽 (SP) 基因相连， 通过信号肽 (SP) 基因的引导和跨膜 (TM) 基因的 锚定， 在病毒表达和复制过程中将 MSP119C蛋白展示于家蚕杆状病毒的表面。以家蚕蛹作为 生物反应器生产重组杆状病毒， 并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原进行生产， 相比于传 统疟疾疫苗生产具有安全性好、 生产成本低、 产量高、。

11、 易于操作、 适用于大规模生产的特点。 0006 为了达到上述目的， 本发明的技术方案如下 ： 一种家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c， 该病毒于 2011 年 12 月 15 日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为 CGMCC( 地址 ： 北京市朝阳区北辰西 路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101) 保藏， 分类命名为家蚕核型多角体 病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus） ， 保藏编号为 CGMCC No.5602。 说 明 书 CN 102533677 A 3 2/7 页 4 000。

12、7 上述家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c的制备方法， 包括以下步骤 ： (1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋 白 gp64 跨膜域基因序列， 通过BamHI/EcoR I 和XhoI/Hind双酶切插入 pFastBacI 载体 多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体 pFastBacI-gp64 ； (2) 由 PCR 扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原基因 MSP119c序列， 其 5 和 3 端分别 引入EcoRI 和XhoI 酶切位点后， 连接到步骤 (1) 所得表面展示载体 pFastBacI-gp64， 构建 成重组。

13、转移质粒 pFastBacI-gp64-MSP119C； (3) 取步骤 (2) 所得的重组转移质粒 pFastBacI-gp64-MSP119C转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞， 在含有卡那霉素、 庆大霉素、 四环素、 X-gal 和 IPTG 的 LB 培养板上进行蓝白斑 筛选， 避光培养 40h48h 后挑取白斑， 培养 20h24h 后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组， 并用 M13 通用引物、 MSP119c引物做 PCR 鉴定 ； (4)取步骤(3)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞， 发 病后获得一代病毒悬液 0 4保存， 提取病毒基因组用 M13。

14、 通用引物、 MSP119c引物做 PCR 鉴定， 获得所述家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c。 0008 本发明还提供上述重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c表达的抗原蛋白， 其氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 10 所示。 0009 上述抗原蛋白的制备方法， 包括以下步骤 ： (1) 将上述的重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119C感染家蚕 BmN 细胞进行病毒扩增 ； (2) 针刺接种法接入家蚕蛹 ； (3) 收集表达的上述抗原蛋白。 0010 本发明进一步提供上述重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSP119c在疟疾疫苗制备中的应 用。。

15、 0011 本发明还提供上述蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。 0012 本发明实现的技术效果如下 ： 1、 世界上首次利用家蚕杆状病毒表面展示技术高效表达恶性疟原虫抗原蛋白， 制备疟 疾疫苗 ； 2、 利用家蚕幼虫、 蛹作为生物反应器高效表达真核生物蛋白， 可以达到蛋白的正确折 叠， 从而能保证完整的抗原性 ； 3、 蚕蛹作为天然食品， 且杆状病毒对哺乳动物无感染， 致热源性少， 疫苗安全性高 ； 4、 本方法适用于大规模生产， 降低了成本， 且产量高， 所生产的疟疾疫苗应用价值大。 附图说明 0013 图 1 显示的是融合杆状病毒囊膜蛋白 gp64 信号肽和跨膜区的表面展示载体 pFastBac。

16、I-gp64 ； 图2显示的是含有PfMSP119c的重组基因结构示意图 ； pPolh ： 多角体启动子 ； SP ： gp64 基因的信号肽序列 ； PfMSP119c： 恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白 1C- 末端的 19kD 片段 ； TM ： gp64 基因的跨膜区序列 ； Poly(A) ： 多腺苷酸化信号 ； 图3显示的是GP64信号肽SP基因的PCR扩增结果图 ； M ： 10kb DNA标记 ； 1 ： 信号肽 SP 的 PCR 产物 ； 说 明 书 CN 102533677 A 4 3/7 页 5 图 4 显示的是 GP64 基因跨膜结构域 TM 基因的 PCR 扩增结果 ； 。

17、M ： 10kb DNA 标记 ； 1： 跨膜结构域 TM 的 PCR 产物 ； 图5显示的是MSP119c基因的PCR扩增 ； M ： 10Kb DNA分子量标准 ； 1 ： MSP119C基因扩增的 PCR 产物 ； 图 6 显示的是重组质粒的鉴定 ； M ： 10Kb DNA 分子量标准 ； 1 ： pFastBacI-gp64-MSP119C 重组质粒的双酶切产物 ； 2 ： pFastBacI-gp64-MSP119C重组质粒的 PCR 产物 ； 图 7 显示的是 Bacmid-gp64-MSP119c的鉴定 ； M ： 10Kb DNA 分子量标准 ； 1 ： M13 上、 下游 。

18、引物 PCR 结果 ； 2 ： MSP119c引物 PCR 结果 ； 图8A显示的是重组病毒在细胞中的PCR检测结果 （用M13通用引物鉴定） ； M ： 10Kb DNA 分子标准量大小 ； 1 ： M13 上、 下游引物的 PCR 产物 ; 图 8B 显示的是重组病毒在细胞中的 PCR 检测结果 （用 MSP119c 基因引物鉴定） ； M ： 10Kb DNA 分子标准量大小 ； 1 ： MSP119c引物的 PCR 产物 ； 图 9A 显示的是 MSP119C蛋白在蚕蛹中表达中的 SDS-PAGE 检测结果 ； M ： 标记 ； 1 ： 正常蚕 蛹上清 ； 2 ： 正常蚕蛹沉淀 ； 3。

19、 ： 发病蚕蛹上清 ； 4 ： 发病蚕蛹沉淀 ； 图 9B 显示的是 MSP119C蛋白在蚕蛹中表达中的 Western Blotting 检测结果 ； M ： 标记 ； 1 ： 正常蚕蛹上清 ； 2 ： 正常蚕蛹沉淀 ； 3 ： 发病蚕蛹上清 ； 4 ： 发病蚕蛹沉淀 ； 图 10A 显示的是离心过程均取样的 SDS-PAGE 检测结果 ； M ： 标记 ； 1 ： 超离上清 ； 2 ： 超 离沉淀 ； 3 ： 300kD 超滤流出 ； 4 ： 300kD 超滤截留 ； 5 ： 8000rpm 上清 ； 6 ： 8000rpm 沉淀 ； 7 ： 15000rpm 上清 ； 8 ： 15000。

20、rpm 沉淀 ； 图 10B 显示的是离心过程均取样的 Western Blotting 检测结果 ； M ： 标记 ； 1 ： 超离上 清 ； 2 ： 超离沉淀 ； 3 ： 300kD 超滤流出 ； 4 ： 300kD 超滤截留 ； 5 ： 8000rpm 上清 ； 6 ： 8000rpm 沉 淀 ； 7 ： 15000rpm 上清 ； 8 ： 15000rpm 沉淀。 具体实施方式 0014 以下具体说明都是例示性的， 旨在对本发明提供进一步的发明。 除非另有说明， 本 文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。 0015 本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒。

21、， 并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟 原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP119C)展示在家蚕杆状病毒表面(如图2)， MSP119C基因通过与 GP64 基因的跨膜 (TM) 基因与信号肽 (SP) 基因相连， 通过信号肽 (SP) 基因的引导和跨膜 (TM) 基因的锚定， 在病毒表达和复制过程中将 MSP119C蛋白展示于家蚕 杆状病毒的表面。 0016 下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。 0017 实施例 1 ： 重组转移质粒 pFastBacI-gp64-MSP119c的构建 以杆状病毒 gp64 序列为模板， 分别用引物 P1( 如 SEQ ID NO ： 1。

22、 所示 )、 P2( 如 SEQ ID NO ： 2 所示 ) 和 P3( 如 SEQ ID NO ： 3 所示 )、 P4( 如 SEQ ID NO ： 4 所示 ) 进行 PCR 扩增 gp64 的信号肽 (SP) 序列和跨膜区序列 (TM)， PCR 产物通过BamHI、EcoR I 和XhoI、Hind ( 均 购自 Fermentas 公司 ) 双酶切插入 pFastBacI 载体多克隆位点上下游两端， 构建展示载体 pFstBacI-gp64。以恶性疟原虫 3D7 标准株 cDNA( 由云南昆明科学院杨照青教授惠赠 ) 为 模板， 用引物 P5( 如 SEQ ID NO ： 5 所。

23、示 )、 P6( 如 SEQ ID NO ： 6 所示 ) 进行 PCR 扩增恶性疟 说 明 书 CN 102533677 A 5 4/7 页 6 原虫裂殖子表面膜蛋白 1C- 末端的 19kD 抗原位点的 DNA 序列， PCR 产物通过EcoRI 和XhoI ( 均购自 Fermentas 公司 ) 双酶切插入展示载体 pFastBacI-gp64( 见图 1)， 构建重组转移 质粒 pFastBacI-gp64-MSP119c。该重组转移载体包括多角体启动子 （pPolh） 、 gp64 信号肽 （SP） 和跨膜区 （TM） 、 恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白 1C- 末端 19kD 片段 。

24、（PfMSP119c） ， 结构如 图 2 所示。将含有 PfMSP119c（融合有 gp64 ） 的通过EcoR和Xho插入到多角体启动子 下， 利用该多角体启动子启动PfMSP119c融合基因的表达， 使融合蛋白N端具有信号肽(SP)， C 端具有跨膜区 (TM)， 由于该启动子属于极晚期基因启动子且为强启动子， 即使融合蛋白 是对杆状病毒和宿主细胞有毒性的蛋白， 由于以该启动子启动融合基因表达时病毒粒子已 经形成， 所以融合蛋白也可以得到高效、 大量地表达。恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白 1C- 末 端 19kD 片段 （PfMSP119c） 通过杆状病毒囊膜蛋白 gp64 的信号肽 （SP。

25、） 引导和跨膜区 （TM） 锚 定展示于杆状病毒表面， 形成刺猬状 （伪病毒） ， 末端的多腺苷酸化信号PolyA对融合蛋白的 翻译有重要作用。引物序列设计如下 ： (1)gp64 信号肽 (SP) 基因 ( 如 SEQ ID NO ： 7 所示 ) 的扩增 以 gp64 DNA 为模板， PCR 反应参数设计为， 94预变性 3min， 94变性 30s， 68复性 延伸 30s， 30 个循环， 68延伸 5min。 0018 在一个无菌的 0.5ml 离心管中， 混合下列成分 ： 10PCR Buffer 10l 25mmol MgCl2 8l 2.5 mmol dNTPs 8l Psp。

26、1 1l Psp2 1l 模板 1l KOD-Plus DNA 聚合酶 1l 加无菌双蒸水至 100l 各组分混匀后， 放入 PCR 仪中， 按上述反应参数设计 30 个循环。 待反应结束后， 电泳 鉴定扩增片断， 结果显示出现与预期大小一致的 DNA 条带 ( 见图 3), 同时切胶回收目的片 断。 说 明 书 CN 102533677 A 6 5/7 页 7 0019 (2)gp64 跨膜区 (TM) 基因 ( 如 SEQ ID NO ： 9 所示 ) 的扩增 以 gp64 DNA 为模板， PCR 反应参数设计为， 94预变性 3min， 94变性 30s， 68复性 延伸 30s， 3。

27、0 个循环， 68延伸 5min。 0020 100l的反应体系同上， 所用引物为Ptm1 和Ptm2， 各组分混匀后， 放入PCR仪中， 按上述反应参数设计30个循环。 待反应结束后， 电泳鉴定扩增片断(见图4)， 结果显示出 现与预期大小一致的 DNA 条带同时切胶回收目的片断。 0021 (3)MSP119c基因 ( 如 SEQ ID NO ： 8 所示 ) 的扩增 以恶性疟原虫 3D7 标准株 cDNA 为模板， PCR 反应参数为 94预变性 5min， 94变性 45s， 55退火 30s， 68复性延伸 90s， 35 个循环， 68延伸 10min。 0022 在一个无菌的 0。

28、.5ml 离心管中， 混合下列成分 ： 10PCR Buffer 5l 2.5mmol MgSO4 2l 2.5 mmol dNTPs 5l Pama1 5l Pama2 1.5l 模板 1l KOD-Plus DNA 聚合酶 1l 加无菌双蒸水至 50l 各组分混匀后， 放入 PCR 仪中， 按上述反应参数设计 35 个循环。 待反应结束后， 电泳 鉴定扩增片断(见图5)， 结果显示出现与预期大小一致的DNA条带同时切胶回收目的片断。 0023 (4) 载体构建 将上述 PCR 扩增获得的 gp64 的信号肽 (SP) 序列和跨膜区序列 (TM) 分别通过BamHI、 EcoR I 和Xho。

29、 I、Hind ( 均购自 Fermentas 公司 ) 双酶切插入 pFastBac I 载体多 克隆位点上下游两端， 构建展示载体 pFstBac I-gp64。然后将 MSP119c的 PCR 产物通过 EcoR I 和Xho I 双酶切插入展示载体 pFastBacI-gp64 中 ( 见图 1)， 构建重组转移质粒 pFastBacI-gp64-MSP119c。 通过酶切、 PCR分析鉴定目的条带与载体正确连接(见图6)。 PCR 体系及反应程序同 (3)， 酶切体系及反应条件如下 ： 重组载体 pFastBacI-gp64-MSP119c分别用EcoRI 和XhoI 双酶切消化。反。

30、应条件如下 ： PCR 产物 / 载体 25L EcoR 1L Xho 1L 10Buffer 5L ddH2O18L Total50L 分别轻微震荡混匀， 37反应 30min。 0024 实施例 2 ： 家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c的获得及扩增 鉴定重组成功的 pFastBacI-gp64-MSP119c 转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞 ( 购 自 Invitrogen 公司 )， 在含有卡那霉素 (Kan)、 庆大霉素 (Gen)、 四环素 (Tet)、 X-gal 和 IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)的LB培养板上进行蓝白斑筛选， 避光培养48h。

31、后挑取 白斑， 培养 24h 后用异丙醇抽提基因组， 用 M13 通用引物及 MSP119c 引物做 PCR 鉴定， 结果 显示， 分别在 2500bp3000bp 之间及 400bp500bp 之间出现特异性条带 ( 见图 7)。 说 明 书 CN 102533677 A 7 6/7 页 8 0025 鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕 BmN 细胞 ( 方法参照 Invitrogen 公司脂质体转染试剂Cellfectin Reagent说明书)， 发病(显微镜下观察) 后获得一代病毒悬液4保存， 试剂盒提取病毒基因组并用M13通用引物及MSP119c基因引 物进行 PCR 。

32、鉴定， 结果显示分别在 2500bp3000bp 之间 ( 见图 8A) 及 400bp500bp 之间出 现特异性条带 ( 见图 8B)， 获得病毒株命名为 BmNPV-gp64-MSP119c。取发病的细胞， 将其轻 轻混匀， 并转移到无菌Eppendorf管中， 800g离心5 min， 小心取上清液即为一代病毒株， 于 4保存， 提取病毒基因组用 M13 通用引物、 MSP119c引物做 PCR 鉴定。取 80 L 第一代病毒 感染健康的家蚕 BmN 细胞 ( 购自 Invitrogen 公司 )， 72 h 后收获第二代重组病毒株， 以相 同方法扩增该病毒至获得第四代重组病毒株。 0。

33、026 实施例 3: 家蚕重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c在家蚕蚕蛹中的表达和鉴定 选取上簇后第 6-9 天的蚕蛹 ( 为一代杂交种菁松 皓月， 由浙江中奇生物药业股份有 限公司 )， 除去坏死、 败血、 状况不好的蚕蛹以减少蚕蛹注射后的细菌感染率， 用 70% 浸润酒 精消毒后， 于节间膜处分别接种 15l 实施例 3 所得第四代重组病毒， 注射后放置在人工 气候箱内， 25保护 4-5 天， 让重组病毒充分繁殖， 然后收集发病的蚕蛹， 取部分用于检测， 其余 -80保存备用。 0027 分别取 10g 上述发病蚕蛹进行转录翻译水平检测基因的表达。取发病蚕蛹置 于研钵中充分。

34、研磨后置于离心管中， 12000rpm， 4离心 10min， 分别取上清沉淀制样进行 SDS-PAGE电泳， 以未感染病毒的正常蚕蛹上清沉淀为阴性对照。 电泳结束后转移到 PVDF膜 ( 购自 Sigama 公司， 30cm2) 上， 以抗 MSP1 标准阳性羊血清 ( 购自北京鼎国生物技术公司 ) 为一抗， 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗鼠 IgG (HRP) ( 购自北京鼎国生物技术公司 ) 为二抗， DAB 显色检测目的蛋白 ( 如 SEQ ID NO ： 10 所示 ) 的表达， 如图 9A 所示， 发病蚕蛹 上清样品在 26kDa34kDa 之间约为 28kDa 处有特异性。

35、条带， 而其沉淀样品及正常蚕蛹样品 均无条带， 说明目的蛋白在蚕蛹中表达， 且主要分布在上清液中， 但其表观分子量比预测分 子量 (18.7kDa) 偏大， 推测重组蛋白在家蚕蛹中进行了翻译后修饰， 其与抗 MSP1 标准阳性 羊血清的特异性反应表明重组蛋白具有良好的反应原性 ( 见图 9 B)。 0028 实施例 4 ： 疟疾疫苗的获得 (1) 从蚕蛹中分离纯化重组病毒 BmNPV-gp64-MSP119c( 疟疾疫苗 ) a取 100g 经重组杆状病毒 BmNPV-gp64-MSP119c感染的蚕蛹样品， 4解冻后， 与 100ml 预冷灭菌 ddH2O 混合， 匀浆至浆液细致均匀即可 ；。

36、 b将匀浆液加入 500ml 离心管中， 配平 4， 8000rpm 离心 60min， 取 200ml 上清， 小心 弃去油脂， 重复离心三次 ； c将 8000rpm 离心上清液倒入 50ml 离心管， 配平 4， 15000rpm 离心 30-120min， 取上 清用 4 层纱布过滤， 弃油脂， 重复离心三次 ； d15000rpm 离心后取 100ml 上清， 进行下一步超滤。 0029 (2) 超滤 使用中空纤维膜进行超滤， 选择截留分子量为 300KD 的中空纤维素进行清洗后加样。 将上述步骤 d 中的 100ml 上清液置于超滤系统中， 超滤浓缩至 10ml 之后， 用 2L 。

37、无菌超纯水 稀释后再进行超滤， 最后取 50ml 超滤截留液。 0030 (3) 超速离心 说 明 书 CN 102533677 A 8 7/7 页 9 将上述超滤截留液置于 25ml 超速离心管中， 配平置于超速离心机中 ( 购自 Hitachi 公司 ),4， 40000rpm 离心 1h。离心结束后， 取 1ml 上清制样， 沉淀用 2ml 超纯无菌水重 悬， 所得悬液即为纯化后病毒粒子。上述离心过程均取样进行 SDS-PAGE 电泳及 Western Blotting 检测 ( 见图 10A、 图 10B)， 检测方法同实施例 2。从图 10A、 图 10B 中可以看出， MSP119。

38、C蛋白在 8000rpm、 15000rpm 超滤截留和超离的沉淀中均存在， 并且能够与抗 MSP1 标 准阳性羊血清的特异性反应表明在蚕蛹中表达的MSP119C蛋白具有良好的反应原性， 并且该 方法能够有效地分离纯化重组病毒。 0031 (3) 疫苗效果 疟疾疫苗进行动物体 ( 新西兰雄兔、 2.5kg， 3-4 个月， 购自天津奥易动物饲养中心 ) 试 验， 皮下注射， 注射剂量为 0.1-50mg/kg， 2-4 周后检测抗体效价， 其保护抗体效价大于 1 ： 150， 攻毒试验结果显示该剂量疫苗能产生中和抗体并具有明显抵抗病毒的效果。 0032 以上所述， 仅为本发明的优选实施例， 应。

39、当指出， 对于本技术中的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明的核心技术特征的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些润饰和改 进也应属于本发明的专利保护范围。 说 明 书 CN 102533677 A 9 1/5 页 10 SEQUENCE LISTING 特菲 ( 天津 ) 生物医药科技有限公司 一种疟疾疫苗及其制备方法 111703-I-CP-TJYU 10 PatentIn version 3.5 1 49 DNA 引物 1 cgcggatcca tggtaggcgc tattgtttta tacgtgcttt tggcggcgg 49 2 68 DNA 引物 2 cgacgtaggc。

40、 ctttgaattc baccgccgca aaggcagaat gcgccggcgc cgccgccaaa 60 agcacgta 68 3 25 DNA 引物 3 序 列 表 CN 102533677 A 10 2/5 页 11 ccgctcgaga tggctgaagg cgaat 25 4 26 DNA 引物 4 cccaagcttt taatattgtc tactat 26 5 27 DNA 引物 5 ccggaattct ttaaaaaccc ttacgac 27 6 27 DNA 引物 6 gacctcgagg gaactgcaga aaatacc 27 7 60 DNA gp。

41、64 信号肽基因 7 atggtaggcg ctattgtttt atacgtgctt ttggcggcgg cgcattctgc ctttgcggcg 60 序 列 表 CN 102533677 A 11 3/5 页 12 8 501 DNA PfMAP1-19c 基因 8 tttaaaaacc cttacgactt cgaagcaatt aaaaaattga taaatgatga tacgaaaaaa 60 gatatgcttg gcaaattact tagtacagga ttagttcaaa attttcctaa tacaataata 120 tcaaaattaa ttgaaggaaa 。

42、attccaagat atgttaaaca tttcacaaca ccaatgcgta 180 aaaaaacaat gtccagaaaa ttctggatgt ttcagacatt tagatgaaag agaagaatgt 240 aaatgtttat taaattacaa acaagaaggt gataaatgtg ttgaaaatcc aaatcctact 300 tgtaacgaaa ataatggtgg atgtgatgca gatgccacat gtaccgaaga agattcaggt 360 agcagcagaa agaaaatcac atgtgaatgt actaaacct。

43、g attcttatcc acttttcgat 420 ggtattttct gcagttcctc taacttctta ggaatatcat tcttattaat actcatgtta 480 atattataca gtttcattta a 501 9 132 DNA gp64 跨膜区基因 9 atggctgaag gcgaattggc cgccaaattg acttcgttca tgtttggtca tgtagccact 60 tttgtaattg tatttattgt aattttattt ttgtactgta tggttagaaa ccgtaatagt 120 agacaatatt a。

44、a 132 10 序 列 表 CN 102533677 A 12 4/5 页 13 166 PRT PfMSP1-19c 蛋白 10 Phe Lys Asn Pro Tyr Asp Phe Glu Ala Ile Lys Lys Leu Ile Asn Asp 1 5 10 15 Asp Thr Lys Lys Asp Met Leu Gly Lys Leu Leu Ser Thr Gly Leu Val 20 25 30 Gln Asn Phe Pro Asn Thr Ile Ile Ser Lys Leu Ile Glu Gly Lys Phe 35 40 45 Gln Asp Met L。

45、eu Asn Ile Ser Gln His Gln Cys Val Lys Lys Gln Cys 50 55 60 Pro Glu Asn Ser Gly Cys Phe Arg His Leu Asp Glu Arg Glu Glu Cys 65 70 75 80 Lys Cys Leu Leu Asn Tyr Lys Gln Glu Gly Asp Lys Cys Val Glu Asn 85 90 95 Pro Asn Pro Thr Cys Asn Glu Asn Asn Gly Gly Cys Asp Ala Asp Ala 100 105 110 Thr Cys Thr Glu。

46、 Glu Asp Ser Gly Ser Ser Arg Lys Lys Ile Thr Cys 115 120 125 Glu Cys Thr Lys Pro Asp Ser Tyr Pro Leu Phe Asp Gly Ile Phe Cys 序 列 表 CN 102533677 A 13 5/5 页 14 130 135 140 Ser Ser Ser Asn Phe Leu Gly Ile Ser Phe Leu Leu Ile Leu Met Leu 145 150 155 160 Ile Leu Tyr Ser Phe Ile 165 序 列 表 CN 102533677 A 14 1/5 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102533677 A 15 2/5 页 16 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102533677 A 16 3/5 页 17 图 6 图 7 图 8A 说 明 书 附 图 CN 102533677 A 17 4/5 页 18 图 8B 图 9A 图 9B 说 明 书 附 图 CN 102533677 A 18 5/5 页 19 图 10A 图 10B 说 明 书 附 图 CN 102533677 A 19 。