技术领域
本发明涉及一种生物学试样的前处理方法，其特征在于，在检测生物学试样中所含的基因和/或基因位点的甲基化，分析基因的方法中，在生物学试样中添加多糖类而不添加蛋白质变性剂。此外，本发明还涉及实施这种前处理的生物学试样中所含的基因和/或基因位点的甲基化的检测方法。进而，还涉及通过使用该甲基化的检测方法检测特定基因的甲基化的瘤形成检查方法。
本申请在此参照、援引并要求日本特许出愿特愿2004-359471号及特愿2004-360339号优先权。
背景技术
通过分析存在于生物学试样中的基因，可以使感染性疾病诊断和基因诊断成为可能。例如，使用存在于哺乳类血液或粪便中的病毒，肠内细菌群或病原性细菌，或消化管粘膜细胞，恶性瘤形成细胞、瘤形成细胞和分泌液中的基因片段，进行各种疾病的原因探求和诊断，对于个体的健康状态的把握和恶性瘤形成的早期发现非常有用。
近年来，报道认为基因的异常甲基化的获得这种现象多为瘤形成和恶性瘤形成的特征。
在真核细胞中，直接存在于鸟嘌呤核苷的5’侧的胞嘧啶残基的甲基化优先发生于CG缺乏的区域中(Bird，A.，Nature(1986)321：209)。与之相对，称之为CpG区域的含有不连续CG双核苷酸的区域存在于基因的启动子区域，但是常染色体中几乎所有的基因相关的CpG区域受甲基化保护。CpG区域的广泛涉及的甲基化与印记基因的转录的非活性化和雌的非活性X染色体上的基因转录的不活性化相关。此外，近年的研究报道了人肿瘤中异常的甲基化在各种基因的启动子区域发生(非专利文献1-3)。
CpG区域中的甲基化胞嘧啶的以往的检测是采用甲基化感受性限制酶或甲基化反应性化学物质进行的。但是，由于该方法中只能分析限于存在甲基化可能性的部位的部分，因此存在一般无法广泛应用的缺点。此外，还存在只能分析可 以由该限制酶识别的序列中的CpG区域的缺点。由于即使通过组合甲基化感受性限制酶和核酸扩增反应，也难于区别限制酶切断不完全的情况和甲基化等位基因数少的情况，因此例如在检测少量试样中的癌抑制基因的高甲基化等时，甲基化等位基因仅为集团的一小部分时，就没有可信度。
不使用上述甲基化感受性限制酶或甲基化反应性化学物质，高敏感度检测基因的甲基化的方法中，有用重亚硫酸盐(bisulfite)处理基因的方法。通过重亚硫酸盐处理基因，将非甲基化的所有非甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶，使用这种修饰核酸可以检测基因的甲基化。作为这种方法，可以例举有例如甲基化特异PCR(MSP)法(专利文献1)和COBRA(combined bisulfite restriction assay)法(非专利文献4)，Methylight法(专利文献2)等。但是，这些方法中在重亚硫酸盐处理前不能不进行DNA的提取纯化，而且需要比较多的DNA。而且，重亚硫酸盐处理基因后，为了通过PCR等扩增DNA进行分析，需要再次进行DNA的纯化。
一般的D NA的提取纯化方法为采用苯酚、氯仿等有机溶剂的方法，市售的试剂盒有很多。此外，作为不使用有机溶剂的试剂盒，MagExtractor(东洋纺制)和QIAamp Stool DNA分离试剂盒(QIAGEN制)也有市售。前者是用小珠破碎膜后，用磁力珠回收吸附于小珠上的DNA，后者是通过加热使膜蛋白质变性，来分离DNA的试剂盒。
作为不使用有机溶剂来提取分离DNA的试剂盒，公开了组合有蛋白质分解酶，和含有蛋白质变性剂、表面活性剂、螯合剂和蛋白质变性剂中的至少一种的水溶液，和盐及共沉淀剂，以及蛋白质变性溶解剂的试剂盒(专利文献3)，含有蛋白质变性剂、共沉淀剂和蛋白质变性剂的试剂盒(专利文献4)。这些试剂盒必需有蛋白质分解酶或蛋白质变性剂，以获得在PCR等中可以使用的纯度的核酸为目的。
如上所述，像DNA甲基化检测那样，在DNA扩增反应等分析前需要人为修饰核酸的步骤时，由于需要进行多次纯化，因此存在操作复杂、费时的问题。以往，核酸修饰前的提取纯化中使用用于获得与核酸扩增反应前相同的高纯度DNA的纯化方法。
在采用粪便的消化器官的恶性瘤形成(具体是大肠癌)的检测方法中，有研究便潜血反应(Fecal Occult-Blood Testing；FOBT)的方法。根据欧美的随机对照试验3研究，进行便潜血检查，可以发现早期癌，结果 显示有死亡率减少(检诊群中降低15-35％)的效果。此外，由于可以在检诊群中发现早期癌，因此确认了患病率和浸润癌减少(NEngl JMed.(1993)328：1365-71，Lancet(1996)348：1472-7，Lancet(1996)348：1467-71)。但是，该检查方法敏感度低，便潜血反应阳性患者中大肠癌的发现率停留于2-17％。此外，在先前的欧美的随机对照试验3研究中，大肠癌患者中，由便潜血反应的检诊发现大肠癌的患者为27％，不能认为是令人满意的。
对于消化器官中的瘤形成和恶性瘤形成，随着近年来的分子生物学的发展越来越清楚了基因变异的特征。据报道大肠癌中的基因变异有例如KRAS基因的点突变，APC(adenomatous polyposis coli)基因的点突变，p53基因的点突变，BRAF基因的点突变。但是，即使研究所有这些基因的变异也无法检测出所有的大肠癌，而且检测方法和技术目前多为困难且花费高。如果能从粪便中检测基因的变异，推测可以检测瘤形成和恶性瘤形成(Nat Rev Cancer.(2002)Mar；2(3)：210-9)。此外，也有关于通过加热人粪便使膜蛋白变性，然后利用分离DNA的试剂盒提取纯化DNA，然后进行DNA的重亚硫酸盐处理，检测瘤形成中特异性的甲基化异常，尝试诊断大肠癌的报道(非专利文献5)。该方法中，在DNA的提取纯化中使用试剂盒，但并不经济。
非专利文献1：Jones，P.A.等人，Nat.Genet.，(1999)；21：163-167
非专利文献2：Issa等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，(2000)；910：140-153
非专利文献3：Herman等人，N.Engl.J.Med.，(2003)；349：2042-2054
非专利文献4：Xiong等人，Nucleioc Acids Res(1997)；25：2532-2534
非专利文献5：Muller等人，The Lancet，(2004)；363：1283-1285，
专利文献1：特表2000-511776号公表公报
专利文献2：特表2002-543852号公表公报
专利文献3：特开平7-236499号公开公报
专利文献4：特开2001-17173号公开公报
发明内容
本发明的课题在于提供简便又经济地检测生物学试样中所含基因的甲基化的方法。进而，以在采用基因的甲基化的检测方法检查瘤形成时提供正确且敏感度良好的检查方法为课题。
为了解决上述课题，本发明人反复进行了积极的研究，结果发现，在检测基因的甲基化时，作为将未甲基化的非甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶，区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶的方法，可以例举有重亚硫酸盐处理方法，但是如果在试样中添加多糖类，不添加蛋白质变性剂，即使不再纯化DNA，也可以在此之后进行重亚硫酸盐处理，可以检测出未修饰成尿嘧啶的甲基化胞嘧啶，从而完成本发明。而且，通过检测生物学试样中所含多种基因的甲基化，计算它们的总和，可以更为正确地进行瘤形成的检测，从而完成本发明。
也就是说，本发明由以下内容构成。
1.生物学试样的前处理方法，其特征在于，在检测生物学试样中所含的基因和/或基因位点的甲基化的方法中，在前述生物学试样中添加多糖类，不添加蛋白质变性剂。
2.根据前项1中记载的生物学试样的前处理方法，其中，多糖类为糖原。
3.基因和/或基因位点的甲基化的检测方法，该方法通过使经前项1或2中记载的前处理方法进行前处理的生物学试样与重亚硫酸盐相接触，使该生物学试样中所含的基因和/或基因位点的非甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，检测没有转换成尿嘧啶的胞嘧啶。
4.瘤形成的检查方法，其通过检测生物学试样中所含的基因和/或基因位点中的SFRP2基因、DCC基因和MGMT基因的甲基化，计算甲基化基因的总和。
5.根据前项4中记载的瘤形成的检查方法，其通过再检测APC基因和/或hMLH1基因的甲基化，计算甲基化基因的总和。
6.根据前项4或5中记载的瘤形成的检查方法，甲基化的检测是通过前项3中记载的方法进行的。
通过本发明的前处理方法，可以在极短时间内极简便地获得提供给用于使生物学试样中所含的基因和/或基因位点的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的处理的试样。此外，本发明的前处理的方法，由于操作简便，可以防止试样的污染和试样的损失，可以大量获得经过前处理的试样。因此，可以适用于只能微量采取的试样，需要大量核酸的分析方法等。
进而，如果根据本发明的检查方法，可以正确且敏感度良好地检查瘤形成。
附图说明
图1：是表示生物学试样为粪便时包括前处理方法的一系列操作的图。(实施例1)
图2：是表示粪便溶解溶液的稀释例的图。(实施例1)
图3：是表示粪便中的APC基因的1A启动子区域的甲基化的有无的分析结果的图。SM表示大小标记，各编号表示试样编号。而且，Mc表示甲基化的对照，M表示检测出甲基化，U表示没有检测出甲基化。(实施例3)
图4：是表示粪便中DCC基因的启动子区域或5’区域的甲基化的有无的分析结果的图。SM表示大小标记，各编号表示试样编号。而且，Mc表示甲基化的对照，M表示检测出甲基化，U表示没有检测出甲基化。(实施例3)
图5：是表示粪便中MGMT基因的启动子区域的甲基化的有无的分析结果的图。SM表示大小标记，各编号表示试样编号。而且，Mc表示甲基化的对照，M表示检测出甲基化，U表示没有检测出甲基化。(实施例3)
图6：是表示粪便中SFRP2基因的启动子区域或5’区域的甲基化的有无的分析结果的图。SM表示大小标记，各编号表示试样编号。而且，Mc表示甲基化的对照，M表示检测出甲基化，U表示没有检测出甲基化。(实施例3)
符号说明
a试样(粪便)
b溶解缓冲液
c试样溶液
c1试样溶液沉淀
c2试样溶液上清
d糖原
e重亚硫酸钠
具体实施方式
本发明中所谓“生物学试样”包括从生物体采取的组织、血液、尿、血清、粪便、射出精液、咳痰、鼻涕、唾液、脑脊髓、泪等体液。作为本发明的生物学试样，粪便是特别合适的。粪便中存在肠粘膜细胞、血液细胞、肠内细胞群、病原微生物(例如细菌和病毒)、肠内新生组织(包括大肠癌和息肉)等。粪便作为用于进行各种疾病相关基因和微生物相关基因，例如遗传病等的原因基因、大肠癌组织来源基因或细菌来源基因等分析的非侵袭DNA材料是有效的。
首先，优选使采取的生物学试样悬浮或溶解于适当的溶解液中，适当稀释，制备试样溶液。可以采用通过从不含蛋白质变性剂的公知液体中考虑生物学试样的种类和量来适当选择悬浮或溶解生物学试样的溶解液。本发明中，所谓“蛋白质变性剂”是指从生物学试样中提取DNA等核酸时通常使用的蛋白质变性剂，具体可以举例有尿素、盐酸胍、鸟嘌呤硫酸盐、硫氰酸胍盐等。另一方面，也可以预先使该溶解液中含有蛋白酶K、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等非特异性蛋白质分解酶。
例如，在生物学试样为粪便时，可以将粪便中所含的固体物质溶解于前述溶解液中，并且只要是不含蛋白质变性剂的物质，就没有特别的限制，例如优选Tris-EDTA缓冲液，pH值为9前后的溶液。可以通过对于1mg粪便加入0.1-100μL，优选1-30μL，更优选3-7μL左右的上述溶解液来制备试样溶液。例如，可以在1.5mL的管中，取100mg粪便，加入500μL溶解液来溶解粪便。
在将粪便中的肠内细菌等微生物的基因的检测作为目的时，为了使微生物的膜蛋白变性，可以将试样溶液进行例如60-95℃加热10分钟-10小时的处理。可以对如上述方式获得的试样溶液进行适当的离心分离。离心分离可以以3000-8000rpm，优选4000-6000rpm，更优选5000rpm左右的旋转数进行1-5分钟。试样为粪便时，优选进行离心分离以除去不需要的固体物等，使用上清液。
(前处理方法)
在提交进行基因的修饰处理前对按上述方式获得的试样溶液或试样溶液的离心分离后的上清液(以下，存在将两者均称为“试样液”的情况)进行前处理。作为前处理，在试样液中添加多糖类。多糖类，只要是具有作为DNA载体的功能，对随后进行的重亚硫酸盐处理不产生影响的多糖即可，作为这种多糖类，具体而言，优选糖原。
按作为DNA载体起作用的量添加多糖类。例如，可以对于10-100μL试样液加入2-200μg的糖原。更优选在42μL上述试样液中加入45μg糖原，可以形成合计45μL的溶液。糖原可以使用市售的糖原。可以在试样液中直接添加糖原的粉末使之溶解，但是优选添加制备成糖原溶液的糖原。糖原溶液的浓度可以根据试样的量等适当调整，可以调制成例如15-20mg/mL。糖原以存在于试样液中的状态于37℃温育15-30分钟。
接着，优选进行使试样液中的DNA碱性变性，由双链变成单链DNA的反应。碱性变性处理可以通过公知的方法进行。例如可以通过氢氧化钠溶液的添加进行。进而，可以于37℃温育15-30分钟。然后，在进行的分析中，使用市售的试剂盒时，存在市售的试剂盒中含有碱性变性试剂的情况。这种情况，可以按照试剂盒的使用说明书中记载的方法进行碱性变性。
例如，在43μL通过离心分离溶解了粪便的试样溶液所获得的上清液中添加2μL糖原溶液(15-20mg/mL)，5μL氢氧化钠溶液(例如使用 DNA甲基化试剂盒TM(ZYMO RESEARCH公司)时为M-DilutionBufferTM)，使总体积为50μL。这种情况，可以在添加糖原和氢氧化钠溶液后进行一次温育。具体而言，可以于35-40℃，优选37℃下温育15-30分钟。
(甲基化的检测方法)
本发明还涉及基因和/或基因位点的甲基化的检测方法。本发明中，所谓“基因和/或基因位点的甲基化的检测”是指检测与存在于生物学试样中的特定的基因启动子区域或5’区域或基因位点相关的CpG岛/CpG序列的胞嘧啶的甲基化。使用重亚硫酸盐修饰存在于试样液中的生物学试样中的所有基因的非甲基化胞嘧啶，进行向尿嘧啶的转化。在使用重亚硫酸盐的修饰处理时，由于甲基化胞嘧啶没有转化为尿嘧啶，如果检测出修饰处理后的胞嘧啶，该胞嘧啶则被判断为甲基化，含有该胞嘧啶的基因和/或基因位点也被判断为甲基化。
对于实施了前述前处理的试样液，非甲基化胞嘧啶的修饰可以通过本身公知的方法进行。例如，通过使含有重亚硫酸盐的市售修饰试剂与经前处理的试样液直接接触，修饰试样液中所含的基因和/或基因位点中的非甲基化胞嘧啶，可以转换成尿嘧啶。具体而言是可以使用DNA甲基化检测用试剂盒的市售产品，例如DNA甲基化试剂盒TM(ZYMORESEARCH公司)、MethylEasyTM(Human Genetic Signatures公司)、CpGenome DNA Modification试剂盒TM(CHEMICON公司)等进行。
甲基化的检测方法可以使用本身公知的方法。基因中的甲基化的有无的检测可以按照甲基化特异PCR(MSP)法、COBRA(combinedbisulfite restriction assay)法、Methylight法等进行。例如，由PCR扩增的该扩增的DNA中的非甲基化胞嘧啶是否转换成尿嘧啶的确认，可以通过使用可以扩增非甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶的序列的引物，和可以扩增甲基化胞嘧啶未转换成尿嘧啶的序列的引物来扩增核酸，确认该扩增产物来进行。在试样的性质上，扩增的基因优选200bp以下，更优选180bp以下。
(瘤形成的检查方法)
本发明还涉及通过检测生物学试样中所含的基因和/或基因位点的甲基化来检查瘤形成的方法。在本发明中，所谓上述生物学试样中所含的基因，具体可以例举有SFRP2(secreted apoptosis-related protein-2)基因、DCC(deleted in colorectal carcinomas)基因和MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)基因。进而，还可以包括APC(adenomatouspolyposis coli)基因和/或hMLH1基因。这些基因和/或基因位点已知为尤其是与消化器官的恶性瘤形成(癌)和瘤形成(腺瘤)相关的基因。通过检测上述所示的各基因和/或基因位点的甲基化，可以检测与消化器官相关的瘤形成。
瘤形成可以是恶性瘤形成(癌)，也可以是瘤形成(腺瘤)。在这种情况下，作为用于检测甲基化而进行重亚硫酸盐处理前的生物学试样，例如粪便的前处理，实施上述说明的本发明的前处理方法，即添加多糖类而不添加蛋白质变性剂的方法是简便的，合适的，并没有特别的限定。例如也可以使用MagExtractor(东洋纺制)和QIAamp Stool DNA分离试剂盒(QIAGEN制)等市售产品，根据本身公知的方法实施提取DNA的方法。
在本发明中，所谓“计算甲基化基因的总和”可以通过定量加算通过上述基因和/或基因位点的甲基化的检测所定量检测出的各基因的基因启动子区域或5’区域的甲基化的值而算出的值，也可以按照不伴随定量的方法计算出甲基化的基因数的总和。例如，通过求出SFRP2、DCC和MGMT基因的甲基化的总和，可以正确地检查消化器官的瘤形成。进而，还可以包括APC和/或hMLH1基因的甲基化的总和。
具体而言，检测存在于SFRP2基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化、存在于DCC基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化、以及存在于MGMT基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化，通过求出它们的总和来实现。进而，可以通过检测存在于APC基因的1A启动子区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化和/或存在于DCC基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化，加算于先前所示的3种基因来源甲基化的总和上而求出总和。由此可以检测出存在于消化器官中的瘤形成。
本发明的特定的基因或基因位点的碱基序列，对于SFRP2基因如 NC_000004中所示，对于DCC基因如同No.NT_033905.3所示，对于MGMT基因如同No.HSU95038所示。进而，对于APC基因如GenBank登录号No.HSU02509所示，hMLH1基因如同No.AB017806所示。此外，可以再研究SFRP1基因的甲基化，对于该SFRP1基因如NC_000008所示。
可以使用以下引物作为存在于这些基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的核酸扩增用引物。
可以扩增存在于APC基因的1A启动子区域的CpG区域的引物如下所示。
APC1A-NF：5’-ATATTTTYGAGGGGTAYGGGGTTA(序列号1)
APC1A-MF：5’-TATTGCGGAGTGCGGGTC(序列号2)
APC1A-NR：5’-ACRAAAATAAAAAACRCCCTAATC(序列号3)
APC1A-NF(序列号1)和APC1A-NR(序列号3)被设计成可与甲基化胞嘧啶的存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶的存在的等位基因杂交，通过这两个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都可获得148bp的扩增产物。
另一方面，APC1A-MF(序列号2)设计为只与甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，如果存在甲基化胞嘧啶，通过APC1A-MS(序列号2)和APC1A-NAS(序列号3)这两个引物可以获得84bp的扩增产物。
也就是说，在确认了存在于APC基因的1A启动子区域的CpG区域的胞嘧啶上的甲基化时，则确认有148bp和84bp两种基因扩增产物，此外，在存在于APC基因的1A启动子区域的CpG区域的胞嘧啶上没有确认甲基化时，则只确认有148bp这一种基因扩增产物(图1)。
只要是可以扩增APC基因的必需区域的引物，不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。优选通过组合使用序列号1-3引物进行一次核酸扩增处理，可以确认根据存在于APC基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化而碱基数不同的DNA的扩增。
可以扩增存在于DCC基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的引物如下所示。
DCC-NF：5’-AGGTGGAGAAAGAGGTGGAGGAA(序列号4)
DCC-MR：5’-ACCAAAAATCGCGAACAACG(序列号5)
DCC-NR：5’-TCAACCAACACCTTCRAAACCAAA(序列号6)
DCC-NF(序列号4)和DCC-NR(序列号6)被设计成可与甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶的存在的等位基因杂交，通过这两个引物组，无论有无甲基化胞嘧啶，都获得了151bp的扩增产物。
另一方面，DCC-MR(序列号5)设计为只与甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，如果存在甲基化胞嘧啶，则通过DCC-MR(序列号5)和DCC-NF(序列号4)这两个引物可以获得133bp的扩增产物。
也就是说，在确认了存在于DCC基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶上的甲基化时，则发现了151bp和133bp两种基因扩增产物，此外，在存在于DCC基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶上没有确认甲基化时，则只发现了151bp这一种基因扩增产物(图2)。
只要是可以扩增DCC基因的必需区域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。优选通过组合使用含有序列号4-6所示序列的引物进行一次核酸扩增处理，可以确认根据存在于DCC基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化而碱基数不同的DNA的扩增。
可以扩增存在于MGMT基因的启动子区域的CpG区域的引物如下所示。
MGMT3-NF：5’-GYGTTTYGGATATGTTGGGAT(序列号7)
MGMT3-MF：5’-ACGTTCGTAGGTTTTCGC(序列号8)
MGMT3-NR：5’-AACTCCRCACTCTTCCRAAAACRA(序列号9)
MGMT3-NF(序列号7)和MGMT3-NR(序列号9)被设计成可与甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，通过这两个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都可获得134bp的扩增产物。
另一方面，MGMT3-MF(序列号8)设计为只与甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，如果存在甲基化胞嘧啶，则通过MGMT3-MF(序列号8)和MGMT3-NR(序列号9)这两个引物可以获得82bp的扩增产物。
也就是说，在确认了存在于MGMT基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶上的甲基化时，则发现了134bp和82bp的两种基因扩增产物，此外，在存在于MGMT基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶上没有确认甲基化时，则只发现了134bp这一种基因扩增产物(图3)。
只要是可以扩增MGMT基因的必需区域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。优选通过组合使用含有序列号7-9表示的序列的引物进行一次核酸扩增处理，可以确认根据存在于MGMT基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化而碱基数不同的DNA的扩增。
可以扩增存在于hMLH1基因的启动子区域的CpG区域的引物如下所示。
hMLH15-NF：5’-YGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA(序列号10)
hMLH15-MF：5’-CGTTCGTCGTTCGTTATATATC(序列号11)
hMLH15-NR：5’-TATACCTAATCTATCRCCRCCTCA(序列号12)
hMLH15-NF(序列号10)和hMLH15-NR(序列号12)被设计成可与甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，通过这两个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都可获得149bp的扩增产物。
另一方面，hMLH15-MF(序列号11)设计为只与甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，如果存在甲基化胞嘧啶，则通过hMLH15-MF(序列号11)和hMLH15-NR(序列号12)这两个引物组可以获得109bp的扩增产物。
也就是说，在确认了存在于hMLH1基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶上的甲基化时，则发现了149bp和109bp两种基因扩增产物，此外，在存在于hMLH1基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶上没有确认甲基化时，则只发现了149bp这一种基因扩增产物。
只要是可以扩增hMLH1基因的必需区域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。优选通过组合使用含有序列号10-12所表示的序列的引物进行一次核酸扩增处理，可以确认根据存在于hMLH1基因的启动子区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化而碱基数不同的DNA的扩增。
可以扩增存在于SFRP1基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的引物如下所示。
S1-NF：5’-GYGTTTTTTTGTTYGTYGTATTTT(序列号13)
S1-MF：5’-TCGTAGCGTCGTTTTTTC(序列号14)
S1-NR：5’-AAAACRCAATCCCCAACRTTAC(序列号15)
S1-NF(序列号13)和S1-NR(序列号15)被设计成可与甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，通过这两个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都可获得166bp的扩增产物。
另一方面，S1-MF(序列号14)设计为只与甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，如果存在甲基化胞嘧啶，则通过S1-MF(序列号14)和S1-NR(序列号15)这两个引物可以获得120bp的扩增产物。
也就是说，在确认了存在于SFRP1基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶上的甲基化时，则发现了166bp和120bp两种基因扩增产物，此外，在存在于SFRP1基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶上没有确认甲基化时，则只发现了166bp这一种基因扩增产物。
只要是可以扩增SFRP1基因的必需区域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。优选通过组合使用含有序列号13-15所表示的序列的引物进行一次核酸扩增处理，可以确认根据存在 于SFRP1基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化而碱基数不同的DNA的扩增。
可以扩增存在于SFRP2基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的引物如下所示。
S2-NF：5’-GGTTGTTAGTTTTTYGGGGTTT(序列号16)
S2-MF：5’-TCGTTTCGTTTTTTTTCGGTTTC(序列号17)
S2-NR：5’-CAACAACAACRAACCAAAACCCTAC(序列号18)
S2-NF(序列号16)和S2-NR(序列号18)被设计成可与甲基化胞嘧啶存在的等位基因以及非甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，通过这两个引物，无论有无甲基化胞嘧啶，都可获得159bp的扩增产物。
另一方面，S2-MF(序列号17)设计为只与甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交，如果存在甲基化胞嘧啶，则通过S2-MF(序列号17)和S2-NR(序列号18)这两个引物可以获得87bp的扩增产物。
也就是说，在确认了存在于SFRP2基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶上的甲基化时，则发现了159bp和87bp两种基因扩增产物，此外，在存在于SFRP2基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶上没有确认甲基化时，则只发现了159bp这一种基因扩增产物。
只要是可以扩增SFRP2基因的必需区域的引物，就不限于上述引物，也可以使用具有相同功能的引物。优选通过组合使用含有序列号16-18所表示的序列的引物进行一次核酸扩增处理，可以确认根据存在于SFRP2基因的启动子区域或5’区域的CpG区域的胞嘧啶的甲基化而碱基数不同的DNA的扩增。
前述扩增产物的确认可以通过本身公知的方法进行。具体而言，可以通过用琼脂糖凝胶进行电泳来确认。而且，在使用要进行甲基化检测的基因或基因位点中的基因扩增时使用的引物，只使用设计为可与甲基化胞嘧啶存在的等位基因和与非甲基化胞嘧啶存在的等位基因杂交的引物时，可以采取以DNA芯片进行的杂交，克隆文库法，变性梯度凝 胶电泳法(DGGE法)，温度梯度凝胶电泳(TGGE法)，Methylight法或SSCP法。
(试剂和试剂盒)
本发明还涉及试样前处理试剂，其是核酸修饰前使用的试剂，其特征在于含有糖原但不含蛋白质变性剂，另外还涉及上述前处理方法中使用的含有糖原不含蛋白质变性剂的试样前处理试剂盒，以及上述核酸修饰方法中使用的核酸修饰试剂盒。
而且，本发明除了涉及检查存在于消化器官中的瘤形成的方法之外，还涉及上述引物，引物组合。而且，本发明还涉及检查存在于消化器官中的瘤形成的检查用试剂和检测用试剂盒。本发明的试剂中可以以上述各引物作为试剂，而且试剂盒中还可以含有引物或引物组合。试剂盒中除了上述引物之外也可以含有上述试样前处理试剂以及核酸扩增用试剂，扩增产物的确认中使用的试剂等。
实施例
通过以下实施例说明本发明，然而本发明显然不受这些实施例的限制。
(实施例1)生物学试样为粪便时的试样的前处理方法
按照图1和图2说明生物学试样为粪便时的试样的前处理方法。
1)作为用于溶解粪便的溶液，制备500mmol/L Tris-HCL、16mmol/LEDTA、10mmol/LNaCl、pH9.0的组成的溶液(溶解缓冲液)。将在1.5mL管中加入78mg样品No.9的粪便，117mg样品No.12的粪便，162mg样品No.45的粪便，146mg样品No.51的粪便，将各粪便溶解于1000
μL的溶解缓冲液中，制备各粪便溶液。然后，将各粪便溶液于95℃加热处理10分钟(图1：左上)。
2)粪便溶液的离心分离
以5000rpm对所得的粪便溶液进行3分钟离心分离，分离上清液和沉淀(图1：右上)。
3)向溶液添加糖原
在43μL上述粪便溶液的上清液(样品No.45-1、51-1)(图2)中加入2μL糖原溶液(15mg/mL)，搅拌。此外，用500μL溶解缓冲液稀释100μL该上清液(样品No.45-2、51-2)(图2)、在43μL获得的稀释溶液中加入2μL糖原溶液(15mg/mL)，搅拌(图1：右下)。
4)DNA向单链的变性
以下的步骤按照DNA甲基化试剂盒(DNA甲基化试剂盒，EZ：ZYMO RESEARCH制)的步骤进行。在各5μL样品中加入试剂盒中所含的M-Dilution Buffer(氢氧化钠溶液)，于37℃温育15分钟。
5)非甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的转换
用DNA甲基化检测用试剂盒DNA甲基化试剂盒TM(ZYMORESEARCH制)将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。在上述样品No.9、12、45-1、51-1、45-2、51-2的溶液中添加试剂盒所含的CT转化试剂(重亚硫酸钠溶液)，进行温育，修饰所有的非甲基化胞嘧啶，转化成尿嘧啶(图1：左下)。
6)DNA的纯化
用试剂盒中所含的Zymo-Spin I Column将获得的修饰基因来源的DNA纯化至高纯度。
(实施例2)预备研究
从250例的大肠癌患者，10例大肠腺肿瘤患者，85例胃癌患者分别获得瘤形成部分或正常粘膜部分的生物学试样，进行以下的研究。
以施行了外科手术切除和内窥镜切除的250例大肠癌组织(包括遗传性非腺肿瘤性大肠癌)，10例大肠腺肿瘤组织(包括家族性大肠腺肿瘤症)，85例胃癌组织，225例的正常大肠粘膜组织和85例的正常胃粘膜组织作为生物学试样，对从各生物学试样中提取的DNA进行重亚硫酸盐处理，首先，用239病例的大肠癌进行合计15种基因启动子区域或5’区域和基因位点(SFRP1，SFRP2，DCC，APC，MGMT，hMLH1， MINT1，MINT2，MINT31，CACNA1G，p14，p16，THBS1，DAPK，COX2)的甲基化研究。根据其结果，选择甲基化频率高的6个基因(SFRP1，SFRP2，APC，DCC，MGMT，hMLH1)作为大肠癌和消化器官瘤形成的检测用标记。
然后，用250例大肠癌组织(包括遗传性非腺肿瘤性大肠癌)，10例大肠腺肿瘤组织(包括家族性大肠腺肿瘤症)，85例胃癌组织，225例的正常大肠粘膜组织和85例的正常胃粘膜组织对这6个基因启动子区域或5’区域的甲基化频率和倾向进行分析、研究。为了检测SFRP1，SFRP2，APC，DCC，MGMT，hMLH1各基因的甲基化，使用了表1的引物。表1的引物由含有序列表的序列号1-18表示的序列的寡核苷酸构成。各引物的在各基因中的位置，碱基长度和Tm值也示于表1中。
表1
为了各基因的甲基化的检测，通过PCR进行DNA扩增反应。使用10×PCR缓冲液(Invirogen公司)，1.5mM MgCl2，0.2mM各引物，0.1mMdNTP，1单位的Taq聚合酶(Platinum taq聚合酶；Invirogen公司)，以2μL从组织提取的DNA进行了重亚硫酸盐处理的溶液为模板，合 计20μL的PCR反应溶液。
扩增反应条件为于95℃加热3分钟后，以于95℃30秒，于各Tm温度30秒，于72℃30秒为1循环，进行合计36个循环，然后于7加热5分钟。
对250个病例的大肠癌试样，10个病例大肠腺肿瘤试样研究各基因的甲基化的有无的结果是，在这6种基因启动子区域或5’区域中确认了1个以上的甲基化的大肠癌病例为100％(250/250)，而且在大肠腺肿瘤中也为100％(10/10)。而且，在85例胃癌病例中也为100％(85/85)。
对于各基因启动子区域或5’区域，对于发现了甲基化的基因给予1分的评价，对于没有发现甲基化的基因给予0分的评价，对于各试样，计算上述6种基因或基因位点的总和，以该总值作为M.I(甲基化指数)。大肠癌，大肠腺肿瘤，胃癌，大肠正常粘膜和胃正常粘膜的M.I的平均值和各基因的甲基化的频率示于表2。而且，各组织中M.I平均值的测定中使用分散分析，P值表示其值。而且，M.I平均值的括号内表示95％可信区间。
表2
如表2所示，在大肠癌、大肠腺肿瘤和大肠正常粘膜中发现M.I平均值有显著差异(P<0.0001)。而且，在胃癌和胃正常粘膜中也发现M.I平均值有显著差异(P<0.0001)。也就是说，确认了消化器官瘤形成与消化器官正常粘膜的M.I平均值有明显的差异。
例如，大肠癌的情况是，与正常粘膜相比，显著发现尤其SFRP2，DCC，MGMT各基因的甲基化。大肠腺肿瘤的情况是显著发现SFRP2，APC，MGMT各基因的甲基化。进而，胃癌的情况是，显著发现SFRP2，DCC，hMLH1各基因的甲基化。根据该结果，提示从粪便中检测出这6种基因启动子区域或5’区域的甲基化，根据其M.I值提示也许可以预测消化器官瘤形成的存在。
根据预备研究获得的结果，在理论上，显示多个基因启动子区域或5’区域中甲基化的有无的总和在瘤形成与正常组织中有差异。与此结果相同，通过从粪便中所含的基因中检测DNA甲基化，进行了是否可以检测消化器官中瘤形成的存在的研究。
(实施例 3)基因启动子区域或5’区域的甲基化的总和与病理诊断的关系
从60名获得知情同意的大肠内窥镜检查预定患者中获得检查施行前的粪便作为生物学试样。用实施例1中记载的方法对获得的粪便进行糖原处理和重亚硫酸钠处理。对2μL经该重亚硫酸钠处理的溶液，与预备研究中进行的方法相同的方法检测SFRP1，SFRP2，DCC，APC，MGMT，hMLH1各基因的启动子区域和/或5’区域的甲基化。
检测60个病例的粪便中所含的基因的甲基化的结果，大肠内窥镜和上部消化管内窥镜检查结果示于表3。性别，将女性表示为F，将男性表示为M。FOBT表示便潜血反应检查(Fecal Occult-Blood Test)，(+)表示便潜血反应阳性，(-)表示便潜血反应阴性，N.D.表示不管是否进行便潜血反应检查都不能确认的病例。而且，甲基化状况(MethylationStatus)，在确认基因启动子区域或5’区域的甲基化时表示为1，没有发现甲基化时表示0。而且，对于没有发现核酸扩增反应者，表示为N.A.(Not Amplified)。对于各基因启动子区域和/或5’区域发现了甲基化时，M.I.加1分，N.A.不加分(即与0分意义相同)。
表3
将表3所示的60个病例分成以下3组：恶性瘤形成(包括胃腺癌，大肠腺癌，十二指肠良性肿瘤)组，良性瘤形成(包括胃底腺息肉，胃增生性息肉，大肠管状腺癌)组，和W.N.L(没有发现瘤形成(癌或肿瘤)的病例)。分成这3类的病例组与APC，DCC，MGMT，hMLH1，SFRP1，SFRP2各基因的启动子区域或5’区域的甲基化频率以及M.I.平均值之间的关系示于表4。P值的3组间与M.I.平均值的比较中使用分散分析。而且，3组间的M.I.平均值的比较中使用分散分析。而且，3组间各基 因启动子区域或5’区域的甲基化频率的比较用Pearson测定。
表4
其结果是，通过粪便中所含的基因的甲基化的检测，发现其甲基化基因的总和的值的平均值，在伴随恶性瘤形成的病例和伴随良性瘤形成的病例和不伴随瘤形成(W.N.L)的病例间有显著差异。尤其是，发现了恶性瘤形成时，就SFRP2，DCC，MGMT和APC基因而言，良性瘤形成时，就SFRP2和APC基因而言，与没发现瘤形成的组相比有显著差异。该结果与预备研究有相同倾向。
SFRP2启动子区域或5’区域的甲基化可以检测瘤形成(癌和腺肿瘤)，APC基因的1A启动子区域的甲基化也有相同倾向。还显示出在DCC启动子区域或5’区域的甲基化中，可以重点检测恶性瘤形成，在MGMT启动子区域的甲基化中也发现了这种倾向。
在本实施例中，非定量检测了各基因启动子区域和/或5’区域的甲基化。考虑表4的结果，M.I.值为2以上的病例为检查阳性组(也就是怀疑消化器官中存在瘤形成的病例组)，而且，M.I.值为1或0的病例为检查阴性组，计算该检查方法中的敏感度和特异性。其结果示于表5。而且，P值表示Fisher的正确测定值。
表5
如表5所示，检测存在于消化器官中的瘤形成的敏感度为90.0％，特异性为53.3％。而且，对于恶性瘤形成，显示出可以100％检测。
(比较例1)通过便潜血来确认
对于上述预备研究中所示的病例中的60个病例进行便潜血反应，调查了通过大肠内窥镜研究显示出阳性的20例患者中是否有瘤形成，结果示于表6。W.N.L为没有发现瘤形成(癌或腺肿瘤)的病例。这样一来便潜血反应阳性的病例中有一半以上没有发现瘤形成。
表6
病理诊断便血潜反应(+)恶性瘤形成5/15(33.3％)良性瘤形成5/15(33.3％)W.N.L10/30(33.3％)
根据以上结果，认为通过便潜血反应几乎不可能进行瘤形成的判断。另一方面，通过本发明的检查方法，提示通过检测尤其是多个基因启动子区域或5’区域的甲基化，求出它们的总和(M.I.)，可以正确且简便地进行瘤形成的检查。
工业上利用的可能性
如上所述，通过本发明的前处理方法，即使不使用蛋白质变性剂， 在以后的步骤中修饰基因中所含的非甲基化胞嘧啶，可以使之转换成尿嘧啶。
而且，通过检测本发明的SFRP2基因，DCC基因和MGMT基因的甲基化，求出甲基化的总和，发现可以从生物学试样，优选粪便中判定消化器官中存在的瘤形成(癌或腺肿瘤)。而且，这提示通过检测APC基因和/或hMLH1基因的甲基化，再求出甲基化总和，可以更正确地检测大肠癌。
对于在实施例中所示的粪便试样，研究了各基因启动子区域和/或5’区域的甲基化，结果显示可以从粪便中检查大肠癌和/或良性瘤形成。
这样确认了用本发明的前处理法处理作为非侵袭DNA材料的粪便是可以实际应用的。
而且，由于不只在各种疾病的诊断上有用而且可以操作性处理多数试样，因此可以应用于以正常集团作为对象的大肠癌等的各种检诊中。因此，通过本发明的方法可以一定程度预测与消化器相关的瘤形成，对于经本发明的检查方法判断为需要注意的患者，也可以进行内窥镜检查等，以减轻患者的负担。
序列表
<110>国立大学法人冈山大学
<120>基因的甲基化检测方法以及通过甲基化检测进行的瘤形成的检测方法
<130>GP05-1029PCT
<150>JP2004-359471
<151>2004-12-13
<150>JP2004-360339
<151>2004-12-13
<160>18
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
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<220>
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