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1、(10)授权公告号 CN 101260371 B (45)授权公告日 2010.12.01 CN 101260371 B *CN101260371B* (21)申请号 200810050619.8 (22)申请日 2008.04.18 CGMCC No.2360 2008.01.24 C12N 1/15(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12N 15/04(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (73)专利权人 吉林农业大学 地址 130118 吉林省长春市新城大街 28。
2、88 号 (72)发明人 王丕武 张发福 付永平 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 22100 代理人 魏征骥 CN 1335388 A,2002.02.13, 全文 . 金加明 . 木霉纤维素酶产酶适宜条件及对秸 秆降解参数优化的研究 . 中国优秀硕士学位论文 全文数据库 农业科技辑 2.2008,(2),D050- 19. 王菁莎等 . 康宁木霉固态发酵秸秆生 产纤维素霉的研究 . 纤维素科学与技术 13 4.2005,13(4),26-31. 都占魁等 . 一株高活力纤维素酶生产 菌绿色木霉 T2 产酶研究 . 太阳能学报 27 12.2006,27(12),1。
3、298-1301. 林英等 . 绿色木霉原生质体诱变筛选纤维素 酶高产菌株 . 生物技术 16 2.2006,16(2),50- 51. K. Reczey 等 .CELLULASE PRODUCTION BY T.REESEI.Bioresource Technology 57.1996,(57),25-30. (54) 发明名称 一种基因组重排木霉菌及其制备及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种基因组重排木霉菌及其制备 及其应用。其在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心的保藏号为 CGMCC No.2360。该 菌株可用于固体发酵生产纤维素酶， 对其固态发 酵过程为 ： 接种量为。
4、 5 15浓度， 水料比为 1.0 3.0， 发酵培养基中包括 1.5 2质量 浓度的碳源和 1.5 2质量浓度的氮源， 发酵 曲的初始 pH 值为 4.5 7.0 左右， 发酵于 26 31条件下进行需氧发酵培养， 发酵 72h 84h。 在降解玉米秸秆的过程中， 可叶片的薄壁组织降 解， 使叶片分层并将细胞内组分释放出来， 只剩下 表皮部分。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 朱晓乐 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 3 页 CN 101260371 B1/1 页 2 1. 一种基因组重。
5、排木霉菌 (Trichoderma sp.)， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心的保藏号为 CGMCC No.2360。 2. 如权利要求 1 所述的基因组重排木霉菌在固态发酵产纤维素酶中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的基因组重排木霉菌在固态发酵产纤维素酶中的应用， 其发酵 过程为 ： 接种量为 5 15浓度， 水料比为 1.0 3.0， 发酵培养基中包括 1.5 2 质量浓度的碳源和 1.5 2质量浓度的氮源， 发酵曲的初始 pH 值为 4.5 7.0， 发酵于 26 31条件下进行需氧发酵培养， 发酵 72h 84h。 4. 权利要求 1 所述的基因组重排木霉菌在降。
6、解玉米秸秆中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101260371 B1/11 页 3 一种基因组重排木霉菌及其制备及其应用 技术领域 0001 本发明属于微生物领域， 具体涉及一种产纤维素酶高及降解玉米秸秆效果好的木 霉菌基因组重排菌株、 重排菌株的制备方法、 固体发酵产酶的条件优化及该菌株降解玉米 秸秆。 背景技术 0002 纤维素 (cellulose) 是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物。同时， 它也是地 球上最丰富、 最廉价的再生资源， 纤维素是植物细胞壁的主要成分， 约占植物干重的三分之 一至二分之一， 广泛而大量地存在于自然界中， 是地球上最为丰富的可再生的生物聚合物 之一。有。
7、资料表明， 全世界每年的植物体生成量达 1500 亿吨千物质， 其中纤维素及半纤维 素的总量为 850 亿吨。 0003 经过长期的研究， 人们发现能够降解和利用变性纤维素 ( 如磷酸膨胀纤维素 )， 纤维素衍生物 ( 如梭甲基纤维素 ) 的微生物种类繁多， 在真细菌、 放线菌、 部分酵母和 高等真菌等很多主要的微生物类群中都有发现。但是， 能合成组分齐全的纤维素酶体 系， 并向外分泌， 水解天然纤维素材料的种类则相对有限， 许多种细菌、 放线菌以及担子 菌可在天然纤维素材料上生成， 有很强的分解纤维素的能力， 但胞外纤维素酶活往往很 低， 而多数纤维素降解真菌， 特别是霉菌产生的纤维素酶都能。
8、分泌于体外。目前多数纤 维素酶的研究都集中在胞外酶活较高的木霉属 (Tri choderma) 的几个种 ： 粉状侧孢 (Sporitrichumpalverulentum)， 腐皮镰孢 (Fusarium solani)， 绳状青霉 (Pencillium funiculosum)， 曲霉属 (AspergiLLus)， 青霉属 (PeniciLLium) 和枝顶孢霉 (Acremonium) 等霉菌和木腐菌菌株上。其中尤以木霉属的产量居多， 木霉 (Trichoderma sp.) 属于半 知菌亚门、 丝孢纲、 丝孢目、 粘孢菌类， 是一类普遍存在的丝状真菌。霉菌是线状的， 对纤 维素纤维。
9、的降解集中在纤维的端部， 并不断生长， 由内向外消化纤维素， 使其逐渐被分解 破坏。里氏木霉 (Trichoderma reesei)、 康氏木霉 (Trichoderma koningii) 和绿色木 霉 (Trichodermaviride) 等是木霉属中产纤维素酶活性较高的菌种， 特别是绿色木霉 (Trichodernia viriLe) 及其近缘的菌株， 能产生三类纤维素酶， 所产生的纤维素酶能分泌 到菌体外， 一般不聚集形成多酶复合体， 但相互发生强烈的协同作用， 破坏植物细胞壁， 将 植物纤维素分解为葡萄糖。 0004 Genome shuffling 技术是在传统诱变基础上， 通。
10、过细胞融合技术， 对诱变后的微 生物细胞进行基因组重组， 从而使具有正向突变的菌株将其优点结合在一起， 进而提高微 生物细胞的正向突变频率及正向突变速度。随着 DNA 改组等定向进化技术的发展， 在 90 年代初美国加州的 Maxgen 公司 Stemmer 等人提出的 Genome shuffling 技术的概念， 这种 技术是分子定向进化在全基因组水平上的延伸 . 它将重组的对象从单个基因扩展到整个 基因组， 因此， 可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合 . 进行基因组重 排首先需要有一个含有各种不同正突变的基因组库 ( 例如 ： 通过经典的诱变育种得到目的 性状发生改进的不。
11、同的正突变菌株就构成了所需的基因组库 ). 随后通过原生质体融合将 说 明 书 CN 101260371 B2/11 页 4 这些正突变菌株的全基因组进行随机重组， 并筛选目的性状得到进一步改进的菌株来进行 下一轮基因组重排， 这样， 通过循环多轮的随机重组可以快速、 高效地选育出表型得到较大 改进的杂交菌种 . 其具体操作过程是通过对出发菌株进行诱变， 然后在模拟 DNA 重组的条 件下对原生质体进行递推式多次融合 (recursive protoplast)， 最后筛选出具有多重正向 进化标记的目标菌株。具体做法如下 ： 在采用递推式原生质体融合对目标菌株进行融合的 过程中， 诱变， 首先。
12、要进行原生质体的制备， 然后模拟 DNA 改组的反应温度条件对原生质体 进行融合， 然后在非选择条件下再生 ； 再生原生质体菌丝混合就构成了 F1 ； F1 长成菌落， 长 出的菌落再被制备成为原生质体， 同时用同样的方法再进行融合再生， 这一过程重复三、 四 次得到后代菌落 ； 与对照相比， 融合后代有效率达到 60、 17、 2.5， 较之未融合前增加 了 40-105倍。这一过程中操作的方法与原生质体融合技术基本相同。例如， 在 Ying-Xin Zhang 等人的研究中， 以四株营养缺陷型的弗氏链霉菌为模型进行链霉菌之间的重组， 实验 表明采用的原生质体融合是实现基因组重组的十分有效的。
13、办法， 重组有效率超过 20。检 测四株经多营养缺陷型的链霉菌的原生质体重组的后代发现， 重组中含有两个标记的重组 后代为 3， 含有三个标记的为 0.04， 四个标记为 0.00005。在这一过程中， 我们可以 看到， 后代中带有多重正向进化标记重组子出现的几率是采用原始诱变育种方法的 40-105 倍。这一结果将为多基因重组提供有效依据， 使得我们可以通过 DNA 改组， 获得含有多个亲 本遗传信息的更有意义的子代。采用表型的筛选法， 可以直接对已知或未知的代谢途径进 行快速优化、 构建新的代谢途径用于合成新化合物或降解毒害物质， 极大地促进了代谢工 程的进一步发展和应用。 其优化范围从单。
14、个蛋白， 整个代谢途径或前体供应途径， 到整个基 因组。 Genome shuffling可以利用重组DNA技术对细胞的多种不同基因组进行定点改造和 修饰， 增加多基因重组的几率， 可以得到各种改造后的细胞组成多样性的基因组库， 然后通 过循环的基因组重排， 筛选集多个改造基因于一体的细胞， 这样可以极大地加快工程菌株 的构建进程， 减少对菌株进行多个基因改造和组合的困难， 并明确重组优化的原因或本质。 基因组重排已经被证明是一种有效的、 新颖的全细胞的进化方式， 可以快速提高工业微生 物的表型。这是在传统育种、 原生质体融合育种以及基因工程育种的基础上对微生物育种 技术的一次革命性的改进。 。
15、0005 原始菌株绿色木霉和康宁木霉购自中科院微生物研究所， 可以发酵产纤维素 酶， 但是这两种木霉菌产酶能力有限， 还不能达到工业生产的要求， 通过传统的诱变方法提 高产酶能力的幅度不大， 而基因工程的方法又不能克隆齐全的纤维素酶系。 发明内容 ： 0006 本发明提供一种基因组重排木霉菌及其制备及其应用。通过基因组重排技术手 段， 以解决原始菌株绿色木霉产酶能力有限、 不能达到工业生产要求的问题。 0007 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC No.2360。 保藏日期 2008.1.24， 分类命名 ： 木霉。 0008 本发明所提供一种上述基因组重排木霉。
16、菌的制备方法 ： 包括下列步骤 ： 0009 (一)将原始菌株绿色木霉AS3.3711和康宁木霉， 分别采用PDA培养基进行纯化， 并进行形态学观察， 挑取生长较旺盛的菌落进行刚果红培养基平板及固体发酵培养， 测定 纤维素酶活 ； 说 明 书 CN 101260371 B3/11 页 5 0010 ( 二 ) 基因组重排 ： 0011 (1) 原生质体制备与再生 ： 将纯化后生长最旺盛产酶最高的绿色木霉 AS3.3711 和康宁木霉的孢子在水中稀释至呈浅绿色， 为 (1 5)107个孢子ml-1， 将孢子悬浮 液 1ml 加入到盛有 100ml 液体菌丝培养基的三角瓶中， 瓶放到摇床中， 振荡。
17、培养， 条件为 ： 28-30， 200r/min， 20-24h， 在无菌条件下， 将无菌条件下培养的菌丝经 4 层无菌擦镜纸过 滤， 用无菌水冲洗两次， 再用高渗缓冲液清洗两次， 称重后加入到 50mL 离心管中， 将新配制 好的酶液加入到 50ml 离心管中， 加入量为菌丝重的 2 倍， 29-32下振荡培养 180r/min， 2-5h， 用4层无菌擦镜纸过滤除去菌丝碎片， 收集滤液置于离心管中， 3000r/min离心10min 收集原生质体， 重新用该高渗缓冲液反复洗涤23次， 用血球计数法确定原生质体溶液的 浓度， 并调至 107个 /ml ； 0012 (2) 原生质体初级诱变。
18、 0013 将步骤 (1) 制备的原生质体分别采用紫外线 UV 和甲基磺酸乙酯 EMS 两种诱变方 法进行诱变处理， 涂布到再生培养基上再生， 然后将再生菌株通过刚果红培养基平板和固 体发酵试验， 分别筛选得到经紫外线诱变的产纤维素酶比原始菌株增加 1以上的多株突 变菌株 -Tv-UV 及 Tk-UV 和经甲基磺酸乙酯诱变的产纤维素酶比原始菌株增加 1以上的 多株突变菌株Tv-EMS 及 Tk-EMS ； 0014 (3) 多母本递进式原生质体融合即基因组重排 0015 将步骤(2)得到的紫外线-UV和甲基磺酸乙酯-EMS诱变菌株按照步骤(1)分别制 备原生质， 并把各原生质体等体积混合后均分。
19、为两组， 一组置于功率 15W 的紫外灯下处理 5-20min， 另一组置于 60水浴中处理 30-120min 完全灭活后， 混合后 3000rpm 离心 5min， 弃上清， 加入 30预热的 PEG 融合液 1ml， 30保温 20min， 4000rpm 离心， 用液体高渗缓冲 液离心洗涤 3 次， 并作适当稀释， 取 200ul 涂布于再生培养基上， 29培养 5-7 天观察长出 菌落。将菌落接种到刚果红培养基平板培养测透明圈， 挑取透明圈与菌落比较大的进行固 体发酵测定纤维素酶活。得到产酶量比原始菌株高 2的以上的突变菌株T-F1 ； 0016 将 4 个 T-F1 菌株继续步骤 。
20、(3) 进行下一轮的原生质体制备、 灭活、 融合与刚果红 培养基平板固体发酵试验筛选， 测定纤维素酶活， 得到产酶量比 T-F1 突变菌株高 2以上 的突变菌株 -T-F2 ； 0017 对上述获得的 F2 菌株进行稳定性试验、 产酶量性质分析， 获得一株产纤维素酶最 高的突变菌株 T-F22， 即本发明所述的基因组重排木霉菌菌株。 0018 本发明中平板筛选方法中包括 ： 0019 纤维素刚果红培养基 ： K2HPO4 0.50g， MgSO4， 0.25g， 纤维素粉 1.88g， 刚果红 0.20g， 琼脂 14.00g， 明胶 2.00g， 加 1的微晶纤维素， 蒸馏水 1000ml，。
21、 PH 7.0。121灭菌 20min， 冷却至 50， 倒平板。将重组菌点接种到纤维素刚果红培养基平板中央， 29培养 3-5d， 测透明圈与菌落直径并算出二者的比值 ； 0020 . 固体发酵产酶试验 ： 麸皮 5.0g， K2HPO4 0.05g， 硫酸铵 0.125g， Tween-800.1ml 蒸 馏水 12.5ml， pH 5.5。28， 150rpm 进行需氧发酵培养， 发酵 84h， 取样测纤维素酶活。 0021 本发明所使用的方法 ： 以羧甲基纤维素钠为底物， 利用 3， 5- 二硝基水杨酸法 (DNS) 测定葡萄糖含量， 从而测定纤维素酶活。 0022 本发明涉及一种固态。
22、发酵产纤维素酶的方法 ： 先将菌种活化， 然后接种到种子培 说 明 书 CN 101260371 B4/11 页 6 养基中扩大培养， 再按接种量为515浓度， 水料比为1.03.0， 发酵培养基中包括碳 源为 1秸秆 +1麸皮质量浓度 1.5 2和氮源为硫酸铵质量浓度 1.5 2， 发酵 曲的初始 pH 值为 4.5 7.0 左右， 发酵于 26 31， 发酵 72h 84h。 0023 本发明在对基因组重排木霉菌 T-F22 在固态发酵培养基的优化过程中， 碳源为 2秸秆、 2麸皮、 1秸秆 +1麸皮、 1秸秆 +0.5麸皮 +0.5 CMC-Na ； 氮源为硫酸铵、 硝酸铵、 蛋白胨、 。
23、脲、 酵母膏。进一步优选实施方案中， 碳源为 1秸秆 +1麸皮 ； 氮源为硫 酸铵 ； 本发明最佳实施方案中碳源为 1秸秆 +1麸皮 ； 氮源为硫酸铵。 0024 进一步， 本发明采用响应面分析方法， 对本发明菌株木霉菌 T-F22 发酵培养基优 化实验， 确定培养基中成分最佳浓度。 0025 本发明基因组重排木霉菌 T-F22 接种量为 2 20浓度。进一步优选实施方案 中接种量为 5 15浓度 ； 本发明最佳实施方案中接种量为 10。 0026 本发明基因组重排木霉菌 T-F22 初始 pH 值为 4.5 7.0 左右。进一步优选实施 方案中初始 pH 值为 5.0 6.0 左右 ； 本发。
24、明最佳实施方案中初始 pH 值为 5.5。 0027 本发明基因组重排木霉菌 T-F22 发酵温度 26 31。进一步优选实施方案中 发酵温度 27 30 ； 本发明最佳实施方案中发酵温度为 28。 0028 本发明基因组重排木霉菌 T-F22 发酵时间 24h 108h， 进一步优选实施方案中发 酵时间 72h 84h ； 本发明最佳实施方案中发酵时间为 84h。 0029 本发明所提供一种基因组重排木霉菌高效降解玉米秸秆的应用。 0030 本发明提供的基因组重排木霉菌 T-F22 菌株的特征如下 ： 0031 分类命名为 ： 木霉亚种。 特征描述为 ： 菌落在PDA平板上生长较快， 菌丝层。
25、比较薄， 呈丛束状， 初期为白色， 平坦， 中期产生分生孢子呈大小不同零星状， 外部被白色菌丝包裹， 后期大小不同零星状产孢区部分呈深绿色。该菌种具有较高纤维素酶酶活， 经固态发酵条 件优化， 优化后的条件为 ： 接种量为 10浓度， 发酵培养基中包括 1秸秆粉 +1麸皮的碳 源和2体积浓度的氮源， 发酵曲的初始pH值为5.5左右， 发酵于2829， 发酵72h 84h， 其酶活是绿色木霉 AS3.3711 的 1.5-2 倍。在降解玉米秸秆的过程中， 可将叶片的薄壁 组织降解， 使叶片分层并将细胞内组分释放出来， 只剩下表皮部分。 0032 本发明对每一轮突变菌株进行表型筛选 ( 纤维素酶产。
26、量 )， 获得多个亲本突变株 后进行基因组重排 (genome shuffling)， 使菌株的正突变特性高度组合， 选育高产纤维素 酶的优良菌株。 解决了原始菌株绿色木霉产酶能力有限的问题， 能满足工业生产的要求。 附图说明 0033 图 1 为重排木霉菌 T-F22 经 10 次传代培养产酶量变化。 0034 图 2 为重排木霉菌 T-F22 与原始菌株的形态比较。 0035 图 3 为突变株与原始菌株的产酶能力的比较。 0036 图 4 为重排木霉菌 T-F22 与原始菌株全细胞 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳比较。 0037 图 5 为优化发酵条件响应面法立体分析图。 0038 图 6 。
27、为重排木霉菌 T-F22 降解玉米秸秆产还原糖含量曲线。 0039 图 7 为重排木霉菌 T-F22 与原始菌株降解玉米秸秆效果。 0040 如图 1 所示， 其中重排木霉菌 T-F22 固体培养基发酵 84h， 测定纤维素酶活。横坐 说 明 书 CN 101260371 B5/11 页 7 标表示重排木霉菌 T-F22 培养的次代数， 纵坐标表示每代发酵产酶。 0041 如图 2 所示， A 为绿色木霉 AS3.3711 菌落形态， B 为重排菌株 T-F22 菌落形态， C 为康宁木霉菌落形态。 0042 如图 3 所示， 突变株与原始菌株固体培养基发酵 84h， 测定纤维素酶活。Tv 表。
28、示 原始菌株绿色木霉 AS3.3711 ； Tk 表示原始菌株康宁木霉 ； Tv-UV 表示经紫外诱变的绿色木 霉菌株 ； Tk-UV 表示经紫外诱变的康宁木霉菌株 ； Tv-EMS 表示经甲基磺酸乙酯诱变的绿色 木霉菌株 ； Tk-EMS 表示经甲基磺酸乙酯诱变的康宁木霉菌株 ； T-F11-14 表示第一轮改组菌 株 ； T-F21-23 表示第二轮改组菌株。 0043 如图 4 所示， 重排木霉菌 T-F22 与原始菌株绿色木霉 AS3.3711 和康宁木霉进行全 细胞 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳比较， M 表示蛋白质 marker ； A 表示重排木霉菌 T-F22 ； B 表 示绿。
29、色木霉 AS3.3711 ； C 表示康宁木霉。绿色木霉 AS3.3711 和康宁木霉是同属木霉属， 有 很多相似条带， 重排木霉菌T-F22多数条带与康宁木霉相同， 也有3-4条特征带只与绿色木 霉 AS3.3711 相同， 还有些条带与绿色木霉 AS3.3711 亮度上也有差异。 0044 如图 5 所示， 从响应面立体分析图中可知， 当吐温 -80 为 0.3g 和微晶纤维素为 3.0g 时， 纤维素酶产量达到最大值 127.496IU/ml。 0045 如图6所示， 重排木霉菌T-F22降解玉米秸秆产还原糖含量曲线， 还原糖含量随培 养天数的变化而波动， 在第 5 天出现最低点。 00。
30、46 如图 7 所示， A 表示降解前的玉米秸秆 ； B 表示绿色木霉 AS3.3711 降解后玉米秸 秆 ； C 重排木霉菌 T-F22 降解后玉米秸秆。 具体实施方式 0047 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 0048 实施例 1、 基因组重排技术选育木霉菌株 0049 ( 一 ) 原始菌株的纯化和形态学研究及产酶特性分析 0050 将原始菌株绿色木霉 AS3.3711 和康宁木霉， 分别采用 PDA 培养基进行纯化， 并进 行形态学观察， 挑取生长较旺盛的菌落进行刚果红培养基平板及固体发酵培养， 测定纤维 素酶活。 0051 纤维素刚果红培养基 ： K2HPO4 0.50。
31、g， MgSO4， 0.25g， 纤维素粉 1.88g， 刚果红 0.20g， 琼脂 14.00g， 明胶 2.00g， 加 1的微晶纤维素， 蒸馏水 1000ml， PH 7.0。121灭菌 20min， 冷却至 50， 倒平板。将重组菌点接种到纤维素刚果红培养基平板中央， 29培养 3-5d， 测透明圈与菌落直径并算出二者的比值 ； 0052 . 固体发酵产酶试验 ： 麸皮 5.0g， K2HPO4 0.05g， 硫酸铵 0.125g， Tween-800.1ml 蒸 馏水 12.5ml， pH 5.5。28， 150rpm 进行需氧发酵培养， 发酵 84h， 取样测纤维素酶活。 0053。
32、 本发明所使用的方法 ： 以羧甲基纤维素钠为底物， 利用 3， 5- 二硝基水杨酸法 (DNS) 测定葡萄糖含量， 从而测定纤维素酶活。 0054 ( 二 ) 基因组重排 0055 (1). 原生质体制备与再生 0056 将纯化后生长最旺盛产酶最高的绿色木霉 AS3.3711 和康宁木霉的孢子在水中稀 释至呈浅绿色， 为 (1 5)107个孢子ml-1。将孢子悬浮液 1mL 加入到盛有 100mL 液体 说 明 书 CN 101260371 B6/11 页 8 菌丝培养基的三角瓶中， 瓶放到摇床中， 振荡培养， 条件为 ： 28-30， 200r/min， 20-24h， 在 无菌条件下， 将。
33、无菌条件下培养的菌丝经 4 层无菌擦镜纸过滤， 用无菌水冲洗两次， 再用高 渗缓液清洗两次， 该高渗缓冲液为 ： 0.6M的山梨糖醇， 0.01MTris-HCl PH值7.5， 10mMCaCl2； 称重后加入到 50mL 离心管中， 将新配制好的酶液加入到 50mL 离心管中， 该酶液为 ： 0.5 溶壁酶 +0.3蜗牛酶 +0.3纤维素酶， 加入量为菌丝重的 2 倍， 29-32下振荡培养 180r/ min， 2-5h， 用 4 层无菌擦镜纸过滤除去菌丝碎片， 收集滤液置于离心管中， 3000r/min 离心 10min 收集原生质体， 重新用高渗缓冲液反复洗涤 2 3 次， 用血球计。
34、数法确定原生质体溶 液的浓度， 并调至 107个 /ml。 0057 (2). 原生质体初级诱变 0058 紫外线 UV 诱变 ： 将步骤 (1) 制备好的原生质体调整浓度为 107cfu/ml， 取 10ml 原 生质体置于灭过菌的带磁力棒的培养皿 ( 直径 90mm) 中， 培养皿放置在磁力搅拌器载物台 上， 开启搅拌器， 在预热 20min 的紫外灯下 ( 距离为 30cm) 边照射边搅拌， 并计时。分别于 2min， 5min， 10min， 15min和20min各取2ml原生质体溶液， 进行倍数稀释后涂布于再生培养 基上再生， 29， 培养箱避光培养， 5天后观察结果。 将再生平板。
35、上长出的菌落点接种到纤维 素刚果红平板上， 29， 培养箱避光培养 3d， 挑取透明圈与菌落直径比值较大的进行固体发 酵， 3d 测定纤维素酶产量。获得两株产酶量较高的菌株 -Tv-UV1 和 Tk-UV1。 0059 其中再生培养基为 ： 葡萄糖 20.0g， 蔗糖 200g， 琼脂 4.0g， (NH4)2SO4 1.4g， KH2PO4 2.0g， K3PO4 4.0g， MgSO47H2O 0.3g， NaCl 17.5g， CaCl2 0.3g， 吐温 -80 0.1g， 再加入矿质 元素 (mg/L).FeSO47H2O 5.0mg， MnSO4 1.6mg， ZnSO47H2O 。
36、1.4mg， CoCl2H2O2.0mg， 定 容至 1000ml。 0060 甲基磺酸乙酯 (EMS) 诱变 ： 将步骤 A 制备好的原生质体调整浓度为 107cfu/ml， 取 10ml 原生质体， 向其中加入甲基磺酸乙酯使终浓度为 1.0mol/L， 分别于 2min， 5min， 10min， 15min 和 20min 各取 2ml 原生质体溶液， 3000r/min 离心 10min 收集原生质体， 重新用高渗 缓冲液反复洗涤 2 3 次， 倍数稀释后涂布于原生质体再平板上， 29， 培养箱避光培养， 5 天后观察结果。 按紫外线诱变后筛选方法进行筛选， 获得两株产酶量较高的菌株-。
37、Tv-EMS2 和 Tk-EMS2。 0061 (3). 多母本递进式原生质体融合即基因组重排 0062 将步骤 (2) 得到的 4 株紫外线 -UV 和甲基磺酸乙酯 -EMS 诱变菌株按照步骤 (1) 分别制备原生质， 并把各原生质体等体积混合后均分为两组， 一组置于功率 15W 的紫外灯 下处理 5-20min， 另一组置于 60水浴中处理 30-120min 完全灭活后， 混合后 3000rpm 离 心 5min， 弃上清， 加入 30预热的 PEG 融合液 1ml， 该 PEG 制备方法是 ： 70g PEG-4000 溶于 100mLddH2O 中， 1.034105Pa 灭菌 20。
38、min， 4保存， 30保温 20min， 4000rpm 离心， 用液体 高渗缓冲液离心洗涤 3 次， 并作适当稀释， 取 2ml 涂布于再生培养基上， 29培养 7 天观察 长出菌落。将菌落接种到刚果红培养基平板培养测透明圈， 挑取透明圈与菌落比较大的进 行固体发酵测定纤维素酶活。获得 4 株产酶量较高的菌株 T-F11 T-F12 T-F13T-F14 ； 将所 得的4株F1菌株按同样策略进行培养， 原生质体制备， 融合， 再生后将菌落接种到刚果红培 养基平板培养测透明圈， 挑取透明圈与菌落比较大的进行固体发酵测定纤维素酶活， 获得 3 株产酶量较高的 F2 菌株 T-F21， T-F2。
39、2， T-F23。 0063 ( 三 ) 突变菌株的遗传稳定性试验 说 明 书 CN 101260371 B7/11 页 9 0064 将第二轮重排菌株分别进行PDA培养基传代10次， 对每一代菌株进行固体发酵产 酶实验， 测定纤维素酶活 ( 图 1)。基因组重排木霉菌 T-F22 经 10 次传代培养， 每一代菌株 固体发酵产酶量没有发生显著变化， 说明突变菌株具有很好的遗传稳定性。 0065 实施例 2 ： 突变株与原始菌株的比较 0066 (1) 突变株与原始菌株的形态的比较 0067 将重排菌株T-F22与原始菌株绿色木霉AS3.3711和康宁木霉点接种到PDA上(图 2)， 由图可知。
40、， T-F22 的生长速度介于原始菌株绿色木霉 AS3.3711 和康宁木霉生长速度中 间， 且形态上处于零星分布， 与原始菌株不同， 大部分颜色与绿色木霉 3.3711 相似， 零星的 成熟部分与康宁木霉形态相似。 0068 (2) 突变株与原始菌株的产酶能力的比较 0069 将经紫外线(Tv-UV1和Tk-UV1)， 甲基磺酸乙酯(Tv-EMS2和Tk-EMS2)诱变的和第 一轮重排， 第二轮重排菌株与原始菌株分别经固体发酵， 进行纤维素酶活测定(图3)。 比较 产纤维素酶能力， 经紫外线， 甲基磺酸乙酯诱变的菌株产酶量较原始菌株区别不显著 ； 而重 排菌株 (T-F11-14， T-F2。
41、1-23) 产酶能力较原始菌株有明显提高。第二轮重排菌株提高更显 著。 0070 (3) 第二轮重排菌株与原始菌株全细胞 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳比较 0071 将第二轮重排菌株与原始菌株进行全细胞 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( 图 4)。由 图可见， 重排菌株T-F22与原始菌株绿色木霉AS3.3711和康宁木霉大多数蛋白电泳条带在 相同位置， 也有个别条带或与绿色木霉 AS3.3711 相同位置， 或与康宁木霉相同位置。 0072 实施例 3 ： 固态发酵产纤维素酶的方法 0073 先将菌种活化， 然后接种到种子培养基中扩大培养， 再按接种量为 5 15浓 度， 水料比为 1.0 。
42、3.0， 发酵培养基中包括碳源为 1秸秆 +1麸皮质量浓度 1.5 2和氮源为硫酸铵质量浓度 1.5 2， 发酵曲的初始 pH 值为 4.5 7.0 左右， 发酵于 26 31， 发酵 72h 84h。 0074 在对基因组重排木霉菌 T-F22 在固态发酵培养基的优化过程中， 碳源为 2秸秆、 2麸皮、 1秸秆+1麸皮、 1秸秆+0.5麸皮+0.5CMC-Na ； 氮源为硫酸铵、 硝酸铵、 蛋 白胨、 脲、 酵母膏。进一步优选实施方案中， 碳源为 1秸秆 +1麸皮 ； 氮源为硫酸铵 ； 本发 明最佳实施方案中碳源为 1秸秆 +1麸皮 ； 氮源为硫酸铵。 0075 进一步， 本发明采用响应面分。
43、析方法， 对本发明菌株木霉菌 T-F22 发酵培养基优 化实验， 确定培养基中成分最佳浓度。 0076 基因组重排木霉菌 T-F22 接种量为 2 20浓度。进一步优选实施方案中接种 量为 5 15浓度 ； 本发明最佳实施方案中接种量为 10。 0077 基因组重排木霉菌 T-F22 初始 pH 值为 4.5 7.0 左右。进一步优选实施方案中 初始 pH 值为 5.0 6.0 左右 ； 本发明最佳实施方案中初始 pH 值为 5.5。 0078 基因组重排木霉菌 T-F22 发酵温度 26 31。进一步优选实施方案中发酵温 度 27 30 ； 本发明最佳实施方案中发酵温度为 28。 0079 。
44、基因组重排木霉菌 T-F22 发酵时间 24h 108h， 进一步优选实施方案中发酵时间 72h 84h ； 本发明最佳实施方案中发酵时间为 84h。 0080 培养基条件的优化 说 明 书 CN 101260371 B8/11 页 10 0081 在纤维素酶固体发酵中， 培养基成分是重要的影响因素， 特别是一些产酶促进剂 对纤维素酶的产量起到很大的作用。因此， 我们采用 Placket-Burman 设计 ( 本领域常用的 一种统计优化试验设计法 ) 方法对 1 秸秆 +1麸皮、 硫酸铵、 大豆粉、 吐温 -80、 微晶纤维 素、 磷酸二氢钾、 氯化钙、 硫酸镁等营养物质进行优化， 从而获得。
45、产酶高的发酵培养基。 0082 (1) 二水平试验 对基因组重排菌株 T-F22， 采用 Placket-Burman 设计 ( 表 1) 0083 表 1.Placket-Burman 设计 0084 0085 对 1 秸秆 +1麸皮、 硫酸铵、 大豆粉、 吐温 -80、 微晶纤维素、 磷酸二氢钾、 氯化 钙、 硫酸镁等营养物质进行优化， 考察各因素的主效应和交互效应的一级作用(表2)。 利用 SAS 软件进行分析， 结果表明吐温 -80、 微晶纤维素对基因组重排菌株 T-F22 产酶有显著影 响。 0086 表 2 Plackett-Burman 实验设计回归分析结果 0087 0088 。
46、说 明 书 CN 101260371 B9/11 页 11 0089 (2) 最陡爬坡试验 由回归分析结果可知， 1 秸秆 +1麸皮、 (NH4)2SO4、 大豆 粉、 CaCl2、 Mg2SO47H2O 对产酶影响不显著， 按照 SAS 给定的最优水平配比。而吐温 -80 和 微晶纤维素的浓度对基因组重组菌 T-F22 产纤维素酶影响显著， 且 X4 和 X5 的系数均为正 数， 说明同时升高吐温 -80 和微晶纤维素的浓度对基因组重组菌 T-F22 产纤维素酶有积极 的影响。 0090 以吐温-80(X1)每次增加0.1g和微晶纤维素(X2)每次增加1g基本步长()， 则 最陡爬坡试验设计。
47、及结果见表 3。从表 3 可以看出， 处理 3 的吐温 -80 和微晶纤维素的浓度 已在最优点附近， 可以此浓度为中心点采用中心组合设计来对培养基作进一步的优化 ( 表 3)。 0091 表 3 最陡爬坡试验设计及其结果 0092 0093 (3) 中心组合设计和响应面分析 根据爬坡试验得到的中心点， 对吐温 -80 和微 晶纤维素进行中心组合设计 ( 表 4 和表 5)。分析结果表明 ( 表 6)， 模型极显著 (P 0.1)， 并且有很好的确定系数， RSq0.9157这表明基因组重排木霉T-F22产纤维素酶量91.57 的可靠性可由模型来预测。并通过 SAS9.0 软件对实验数据进行回归。
48、拟合， 得二次方程为 ： 0094 Y1 127.48+0.374637*X1+0.090538*X2-2.340004*X1*X1-2.275*X1*X2 0095 -2.065003*X2*X2 0096 由于方程的二次系数为负值， 方程所代表的抛物面开口向下， 因而该方程有极大 值。给出了模型的二维响应面 ( 图 5)， 证实了拟合面具有最大值。 0097 表 4 中心组合设计各因子及其编码值 0098 0099 表 5 中心组合设计及其结果 0100 说 明 书 CN 101260371 B10/11 页 12 0101 注 ： 各因子代码中心化 X1 (X1-0.1)/0.1 x2 。
49、(X2-3)/1 0102 表 6 中心组合设计 (CCD) 回归分析结果 0103 0104 用 Mathematica 对方程进行求导， 可以得到模型的最大值， 即最大纤维素酶产量。 当吐温 -80 为 0.328g 和微晶纤维素为 2.91g 时， 纤维素酶产量达到 127.496IU/ml。为了进 一步验证实验结果， 在优化的培养基条件下进行重复实验 3 次， 得到纤维素酶平均产量为 127.01IU/ml， 这证明实验值和实际值之间具有良好的拟合性， 优化模型可靠。 0105 实施例 4 ： 基因组重排木霉菌 T-F22 降解玉米秸秆 0106 利用基因组重排木霉菌 T-F22 降解玉米秸秆， 液体产酶培养基 ： 蛋白胨 3.0g， 酵母膏 0.5g， 麸皮 5.0g， 硫酸铵 2.0g， 磷酸二氢钾 4.0g， 氯化钙 0.3g， 硫酸镁 0.3g， Tween-800.2ml， 蒸馏水定容 1000ml。200ml 培养基中加入 2.0g 玉米秸秆， 并加入 2ml 经种 子培养基预培养的重排木霉菌T-F22， 28， 150rpm培养， 每隔24h测定还原糖含量(图6)， 并设定对照。结果表明， 培养基还原糖含量有变化， 开始还原糖含量减少， 说明菌体生长消 耗。