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1、(10)授权公告号 CN 101319193 B (45)授权公告日 2011.04.27 CN 101319193 B *CN101319193B* (21)申请号 200810029163.7 (22)申请日 2008.07.01 CCTCC No:M208086 2008.06.10 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 任顺祥 黄振 (74)专利代理机构 广州粤高专。
2、利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 任重 (54) 发明名称 一种蜡蚧轮枝菌菌株及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种蜡蚧轮枝菌菌株， 所述菌 株为蜡蚧轮枝菌 VL-N6， 菌株保藏号 ： CCTCC No ： M208086， 2008 年 6 月 10 日在中国典型培养物保 藏中心保藏， 所述菌株属丝孢目， 轮枝孢属， 是从 广州地区被虫生真菌自然侵染的烟粉虱虫体上分 离获得， 将野生菌株回接于烟粉虱虫体上复壮获 得蜡蚧轮枝菌菌株， 对该菌株采用单孢子分离获 得纯化菌株。经长期的侵染生物学研究和室内生 物测定， 蜡蚧轮枝菌对粉虱、 蚜虫等多种刺吸式口 器害虫和蓟马等害虫具。
3、有很强的侵染杀虫效果。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 张颖慧 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 CN 101319193 B1/1 页 2 1.一种蜡蚧轮枝菌菌株(Verticillium lecanii(Zimmermann)Viegas)， 其特征在于所 述菌株为蜡蚧轮枝菌VL-N6， 菌株保藏号 ： CCTCC No ： M208086， 2008年6月10日在中国典型 培养物保藏中心保藏。 2. 一种权利要求 1 所述蜡蚧轮枝菌菌株的应用， 其特征在于应用于制备防治烟粉虱、 温室白粉虱、 蚜虫或蓟马的药物。
4、中。 权 利 要 求 书 CN 101319193 B1/7 页 3 一种蜡蚧轮枝菌菌株及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种蜡蚧轮枝菌菌株及其在防治害虫方面的 应用。 背景技术 0002 在烟粉虱、 温室白粉虱、 蚜虫和蓟马等害虫的防治上， 多采用传统的化学防治方 法。 0003 蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii(Zimmermann)Viegas)是一种昆虫病原真菌， 作为一种活体生物农药， 具有不同于现有化学杀虫剂的全新作用机理、 对环境无污染、 无残 留的特征， 可以作为防治某些对苏云金杆菌 (Bt) 产生抗药性的昆虫， 替代传统化学防。
5、治药 物， 以大力发展生物农药防治技术。 发明内容 0004 本发明的一个目的是克服现有技术的不足， 提供一种蜡蚧轮枝菌菌株。 0005 本发明的另一个目的是提供所述蜡蚧轮枝菌菌株的应用。 0006 本发明的目的通过下述技术方案来实现 ： 0007 提供一种蜡蚧轮枝菌菌株， 所述菌株是从广州地区被虫生真菌自然侵染的烟粉虱 虫体上分离获得， 并回接于烟粉虱虫体上复壮获得蜡蚧轮枝菌菌株， 对该菌株采用单孢子 分离获得纯化菌株。 该菌株为VL-N6， 菌株保藏号为 ： CCTCC No ： M208086， 2008年6月10日 在中国典型培养物保藏中心保藏。 0008 所述蜡蚧轮枝菌菌株属丝孢目，。
6、 轮枝孢属。 0009 所述蜡蚧轮枝菌菌株菌落白色至奶油色， 薄絮状， 背面无色至深浅不一的黄色。 分 生孢子梗不发达， 似营养菌丝， 其上有单生、 对生或 3 4 个轮生的瓶梗， 瓶梗纤细， 大小因 菌株及菌龄不同而差异较大， 8.5-400.8-2.2m ； 分生孢子椭圆形至圆柱形， 两端圆， 单 生， 在瓶梗顶部聚集成头状， 大小因菌株及而变异较大， 2.3-101-2.6m。 0010 本发明同时提供了所述蜡蚧轮枝菌菌株在制备防治烟粉虱、 温室白粉虱、 蚜虫或 蓟马的药物方面的应用， 本发明的蜡蚧轮枝菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、 温室白粉 虱、 蚜虫或蓟马等多种害虫有效。 0011。
7、 本发明与现有技术相比， 具有以下优点和有益效果 ： (1) 本菌株是从广东省广州 地区被侵染的烟粉虱虫体上分离获得， 为中国本土的菌株， 并非从国外引进， 能较好地适应 本地的自然环境。 (2)本发明所述的蜡蚧轮枝菌菌是一种昆虫病原真菌， 作为一种活体生物 农药， 具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、 对环境无污染、 无残留的特征， 适应 有机食品生产的要求。 (3)本发明的蜡蚧轮枝菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、 温室白粉 虱、 蚜虫和蓟马等多种害虫有效。 说 明 书 CN 101319193 B2/7 页 4 具体实施方式 0012 下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。 下述。
8、实施例为本发明较佳的实施 方式， 本发明主要阐述所述菌株的发明思想， 实施方式不一一在实施例中追述， 但并不因此 限制本发明， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 应为等效的置换方式， 包含在本发明内。 0013 实施例 1 0014 1.1 材料来源 0015 在广州地区的蔬菜黄瓜上采集到一种被虫真菌侵染的烟粉虱 Bemisia tabaci 虫尸。 0016 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA) ： 将 200g 马铃薯煮熟取汁， 然后在所取的汁液中 加入 20g 葡萄糖和 17 20g 琼脂粉， 加入水使总体积为 1000ml 并煮沸， 经。
9、高压灭菌， 灭菌 条件 121， 30min。 0017 无菌操作条件 ： 所有器皿和用具须经高压灭菌， 灭菌条件 121， 30min， 接种等操 作均在实验室常规规定的超净工作台内进行。 0018 培养条件 ： 置于 25光照 (14L 10D) 恒温箱中培养， 待菌落形成后， 转移到 PDA 斜面， 再转入 4冰箱贮存。 0019 1.2 病原菌的分离、 鉴定 0020 ( 一 ) 病原菌的分离与纯化 0021 (1) 分离 0022 从采回的被虫生真菌感染的烟粉虱虫尸样品上分离病原菌。利用 5的次氯酸钠 溶液对样品进行表面消毒， 消毒后的样品在灭菌水中洗涤 3 次， 并放入 PDA 平。
10、板中， 倒置于 25恒温箱中培养， 待菌落形成后， 转移到 PDA 斜面， 再转入 4冰箱贮存。 0023 (2) 复壮 0024 将分离到的菌株在 PDA 平板上培养 15 天， 待产生分生孢子后加入 0.03吐温 -80 的无菌水收集孢子， 将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌 20 分钟， 用小型手动喷雾器将稀释 成 1107孢子 /ml 的孢子悬浮液均匀地喷于带有烟粉虱的黄瓜叶片上， 保温 90以上， 24 小时。15 天后挑取被感染的烟粉虱， 按前面所述的方法分离到 A 分离株。 0025 (3) 纯化 0026 对 A 分离株在 PDA 平板上培养 15d， 待形成分生孢子后， 挑取孢子。
11、制成 1103孢子 /ml 的孢子悬液， 将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上， 在生物显微镜下观察， 将一个液滴中 只有一个分生孢子的玻片插入 PDA 培养基上， 放在培养箱中培养， 获得 B、 C、 D、 E、 F、 G 共 6 个分离株。 0027 (4) 病原菌的鉴定 0028 根据病原菌的培养性状、 菌丝、 分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定。 0029 1、 菌落形态描述 0030 将获得的 6 个分离株接种到 PDA 平板上， 于 25条件下培养。2 3 天可见到长 出白色的菌丝， 菌落长绒状、 白色、 中部隆起， 第 7 天后开始产生分生孢子。菌落背面无色或 黄色。 0031 2、 。
12、菌丝和孢子形态描述 0032 菌丝白色， 分生孢子梗不发达， 似营养菌丝， 单生、 对生或 3 4 个轮生的瓶梗， 瓶 说 明 书 CN 101319193 B3/7 页 5 梗纤细， 大小因菌株及菌龄不同而差异较大， 8.5-400.8-2.2m。 分生孢子椭圆形至圆柱 形， 两端圆， 单生， 在瓶梗顶部聚集成头状， 大小因菌株及而变异较大， 2.3-101-2.6m。 0033 ( 二 ) 蜡蚧轮枝菌分离株的筛选 0034 虫生真菌在遗传、 生态及生物学等方面具有多样性， 又存在有准性生殖现象， 同种 真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著， 菌株不同， 其 LD50、 LT50可相差数。
13、倍至数十 倍。高产优质菌株的筛选与获得， 是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选常用的 4 个 指标分别为致病力、 产孢量、 孢子萌发率、 菌落生长速率。 本发明以这些指标为依据， 筛选蜡 蚧轮枝菌的优势菌株。 0035 (1) 供试菌株的处理 0036 经纯化后获得的蜡蚧轮枝菌B、 C、 D、 E、 F、 G共6个分离株， 在PDA平板于250.5 的恒温箱 (14L 10D) 中培养。 0037 (2) 供试昆虫与寄主植物 0038 烟粉虱， 将网室中饲养在黄瓜上的烟粉虱成虫， 接种到无虫的黄瓜幼苗上， 产卵 12h后， 清除成虫， 将黄瓜幼苗置于250.5的光照培养箱中， 待烟粉虱发育至。
14、2龄若虫时 待用。 黄瓜(Cucumis sativusL.)， 品种为万吉青瓜， 购自广东省农科院蔬菜研究所， 试验苗 均采用 2 3 片展开叶的盆栽苗。 0039 (3) 菌落生长速率和产孢量的测定 0040 将 6 个分离株分别配制成 1107孢子 /ml 的分生孢子悬液， 分别取 1ml 悬液滴入 PDA培养基上， 用三角玻璃棒涂匀， 待23d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器新鲜菌落， 接种于 PDA 平板上， 然后置于培养箱中培养 (L D 14 10)。每个菌株 5 次重复。第 15d 测定菌落直径并收集分生孢子用血球计数板记数测定产孢量。 0041 具体操作如下 ： 用直尺测量。
15、菌落直径， 并用直径为 5mm 的灭菌打孔器在培养皿中 取菌丝生长均匀的菌块， 然后放入加有 20ml 0.03吐温 -80 无菌水中， 在磁力搅拌器上搅 拌 20 分钟， 使孢子充分分散， 制成孢子悬浮液， 用血球记数板记数测定产孢量。 0042 6 个分离株的菌落生长速率和产孢量见表 1， 菌落生长速率 B 与 C 差异不显著， B、 C 与其余的分离株之间差异显著。生长 15 天后， 分离株 C 与 B、 的产孢量差异不显著， B、 C 与 其它分离株之间的产孢量差异显著， 其中 B、 C 分离株为较优的分离株。 0043 表 1 蜡蚧轮枝菌 6 个分离株生长速率和产孢量 (15d) 0。
16、044 说 明 书 CN 101319193 B4/7 页 6 0045 注 ： 表中同列数字后字母相同者表示差异不显著 (DMRT 法 )。 0046 (4) 孢子萌发率的测定 0047 将 6 个分离株分别培养 15 天后， 用无菌水收集孢子并制成悬液， 用载玻片萌发法 试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上， 置于底部铺有滤纸的培养皿内， 在皿内滴加 3 4 滴 无菌水保湿 (100， RH)， 培养 36h 后镜检。每个处理 3 个重复。 0048 6 个分离株中， B、 E 分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著， 结果见 表 2， 其中 B 分离株的孢子平均萌发率最高， D 分离。
17、株的孢子萌发率最低。 0049 表 2 蜡蚧轮枝菌 6 个分离株的分生孢子萌发率 (36h) 0050 0051 注 ： 表中同列数字后字母相同者表示差异不显著 (DMRT 法 )。 0052 (5) 分离株对烟粉虱若虫致病力的测定 0053 将 6 个分离株培养 15d 后， 用无菌水收集孢子， 配制成浓度为 1107分生孢子 / mL 的孢子悬液。将带有 2 龄烟粉虱若虫的黄瓜叶片浸入悬液中， 对照浸入无菌水中， 20 秒 后取出， 自然晾干。每处理为 3 4 片叶， 每叶 50 100 头若虫， 3 次重复。摘下处理过的 叶片， 插于盛有无菌水的花泥中， 置于透明的保鲜盒内。再置于 25。
18、0.5的光照培养箱中 (L D 14 10)。每日镜检并记录感染死亡率， 连续观察 14d。上述所有试验数据均在 数据处理软件 SAS 系统上处理完成。 0054 致病力研究结果表明， 所有分离株的侵染率与对照相比差异显著。 6个分离株在第 3 4 天开始表现出侵染症状， 从第 7d 的侵染率可看出 B、 C 分离株显著高于 D、 F、 H、 G 分离 株， 第 14d 时 B 分离株与其它分离株的侵染率差异显著。从总体而言， 分离株 B 的致病力较 强， 平均为 89.23 (14d)， G 分离株的侵染率较低， 为 45.22 (14d)， 见表 3 所示。 0055 表 3 蜡蚧轮枝菌 。
19、6 个分离株对烟粉虱的致病力 0056 说 明 书 CN 101319193 B5/7 页 7 0057 注 ： 表中同列数字后字母相同者表示差异不显著 (DMRT 法 )。 0058 (6) 蜡蚧轮枝菌分离株的筛选 0059 在筛选优良分离株时， 致病性和产孢量是重要的参考指标， 孢子萌发率和菌落生 长速率次之。在本发明中， 菌落生长速率和产孢量分离株 B、 C 与 D、 E、 F、 G 差异显著。从孢 子萌发率和致病性上看， 分离株 B 较为优良， 具有致病性强、 产孢量高等特点， 由表 1 和表 3 可见。综合比较各方面的因素， B 分离株为最佳菌株， 将其命名为 VL-N6 菌株， 经。
20、贵州大学 刘爱英教授鉴定为蜡蚧轮枝菌 (Verticilliumlecanii(Zimmermann)Viegas)， 其菌株保藏 号 ： CCTCC No ： M208086， 2008 年 6 月 10 日在中国典型培养物保藏中心保藏。该蜡蚧轮枝菌 (Verticillium lecanii(Zimmermann)Viegas) 菌株 VL-N6， 属丝孢目， 轮枝孢属。该蜡蚧轮 枝菌菌落背面无色或黄色， 分生孢子梗单生或聚集成孢梗束， 1001.5 2m， 壁光滑， 透 明， 大多由着生46个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。 瓶梗基部球形， 或拟椭圆形膨大， 上部细长， 5.7 81 2m。
21、。分生孢子柱形至梭形， 光滑， 透明至微淡红色， 3 41 2m， 无厚垣孢子。 0060 上述所有试验数据均在数据处理软件 SAS 系统上处理完成。 0061 实施例 2 蜡蚧轮枝菌 VL-N6 菌株对烟粉虱的致病力测定 0062 生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一， 能 为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本发明就蜡蚧轮枝菌 VL-N6 菌株 对烟粉虱的致病力进行测定， 以筛选出在防治时所用的最佳浓度。 0063 供试昆虫与寄主植物 ： 烟粉虱， 将温室中饲养在黄瓜上的烟粉虱成虫， 接种到无虫 的黄瓜幼苗上， 产卵 12h 后， 清除成虫， 将。
22、黄瓜幼苗置于 250.5的光照培养箱中， 待烟粉 虱发育至2龄若虫时待用。 黄瓜(Cucumis sativus L.)， 品种为万吉青瓜， 购自广东省农科 院蔬菜研究所， 试验苗均采用 2 3 片展开叶的盆栽苗。 0064 (1) 供试菌株的处理 0065 经纯化后获得的蜡蚧轮枝菌 VL-N6 菌株， 采用 PDA 平板， 于 250.5的恒温箱 (14L 10D) 中培养 15 天， 加入 0.3吐温 -80 的无菌水收集孢子， 将孢子悬浮液在磁力搅 拌器上搅拌 20 分钟， 待孢子被打散均匀后， 用医用纱布过滤去杂质， 获得孢子悬浮液， 用血 球记数板记数确定孢子浓度后， 再配成1104。
23、、 1105、 1106、 1107、 1108孢子/ml 5个 说 明 书 CN 101319193 B6/7 页 8 浓度梯度待用。 0066 (2) 分离株对烟粉虱若虫的致病力测定 0067 将带有烟粉虱 2 龄若虫的黄瓜叶片浸入 5 个梯度的孢子悬浮液中， 对照浸入含 0.03吐温 -80 的无菌水中， 20 秒后取出， 自然晾干。每处理为 3 4 片叶， 每叶 50 100 头若虫， 3次重复。 处理过的叶片连同黄瓜苗一起放置于250.5的光照培养箱中(LD 14 10)。每日镜检并记录感染死亡率， 连续观察 14d。上述所有试验数据均在数据处 理软件 SAS 系统上处理完成。 00。
24、68 (3) 蜡蚧轮枝菌株对烟粉虱 2 龄的累计死亡率 0069 接种后的第34天， 各处理区的若虫开始表现出发病症状， 随后可观察到虫体上 有少量白色的菌丝长出， 几天后虫体表面出现孢子， 接着烟粉虱死亡。表 4 为蜡蚧轮枝菌处 理后 2 龄若虫第 7d、 14d 的累计死亡率， 结果表明随着浓度的增加烟粉虱 2 龄的死亡率也增 加， 同一浓度下随着时间的增加， 烟粉虱 2 龄的死亡率也增加。其中 1107和 1108处理 区， 烟粉虱的累计死亡率差异不显著。 0070 表 4 蜡蚧轮枝菌对烟粉虱 2 龄若虫的累计死亡率 0071 0072 注 ： 表中同列数字后字母相同者表示差异不显著 (。
25、DMRT 法 )。 0073 上述所有试验数据均在数据处理软件 SAS 系统上处理完成。 0074 实施例 3 蜡蚧轮枝菌 VL-N6 菌株对蚜虫的致病力测定 0075 供试昆虫与寄主植物 ： 蚜虫， 将网室中饲养在小白菜上的蚜虫成虫， 接种到无虫的 小白菜幼苗上， 产卵 12h 后， 清除成虫， 将小白菜幼苗置于 250.5的光照培养箱中， 待蚜 虫发育至3龄若虫时待用。 小白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis)， 购自广东省 农科院蔬菜研究所， 试验苗均采用 6 8 片展开叶的盆栽苗。 0076 (1) 供试菌株的处理 0077 经纯化后获得的蜡蚧轮。
26、枝菌 VL-N6 菌株， 在 PDA 平板上于 250.5的恒温箱 (14L 10D) 中培养 15 天， 加入 0.03吐温 -80 的无菌水收集孢子， 将孢子悬浮液在磁力 搅拌器上搅拌 20 分钟， 待孢子被打散均匀后， 用医用纱布过滤去杂质， 获得孢子悬浮液， 用 血球记数板记数确定孢子浓度后， 再配成 1104、 1105、 1106、 1107、 1108孢子 /ml 5 个浓度梯度待用。 0078 (2) 分离株对蚜虫的致病力测定 说 明 书 CN 101319193 B7/7 页 9 0079 将带有蚜虫 3 龄若虫的小白菜叶片浸入 5 个梯度的孢子悬浮液中， 对照浸入无菌 水中。
27、， 20 秒后取出， 自然晾干。每处理为 3 4 片叶， 每叶 10 头若虫， 3 次重复。处理过 的叶片放入灭菌的托盘中 (25cm35cm)， 并放置于 250.5的光照培养箱中 (L D 14 10)。每日镜检并记录感染死亡率， 并更换新鲜的白菜叶片， 连续观察 10 天。上述所 有试验数据均在数据处理软件 SAS 系统上处理完成。 0080 (3) 蜡蚧轮枝菌菌株对蚜虫 3 龄的累计死亡率 0081 接种后的第 3 4 天， 各处理区的幼虫开始表现出发病症状， 如虫体行动迟缓， 随 后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出， 几天后虫体表面出现孢子， 烟粉虱逐渐死亡。 表 5 为蜡蚧轮枝菌处理 3 龄若虫后第 7d、 14d 的累计死亡率， 结果表明随着浓度的增加， 蚜虫 3 龄的死亡率也增加， 同一浓度下随着时间的增加， 蚜虫 3 龄的死亡率也增加。其中 1107 和 1108处理区， 蚜虫的累计死亡率差异不显著。 0082 表 5 蜡蚧轮枝菌对蚜虫 3 龄若虫的累计死亡率 0083 0084 注 ： 表中同列数字后字母相同者表示差异不显著 (DMRT 法 )。 0085 上述所有试验数据均在数据处理软件 SAS 系统上处理完成。 说 明 书 。