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1、(10)授权公告号 CN 102586264 B (45)授权公告日 2013.05.22 CN 102586264 B *CN102586264B* (21)申请号 201110001453.2 (22)申请日 2011.01.06 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C07K 14/415(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人 中国科学院遗传与发育生物学研 究所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 2 号 (72)发明人 李云海 李胜军 刘亚菊 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公。
2、司 11245 代理人 关畅 CN 101824078 A,2010.09.08, CN 101855353 A,2010.10.06, Cheuk R. 等 .Accession No. BT015160. Genbank .2004, (54) 发明名称 一种提高植物产量的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种提高植物产量的方法。该 提高植物产量的方法， 是向出发植物中导入 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质的编码基因， 得到与所述出 发植物相比产量提高的目的转基因植物。实验 证明， 本发明方法通过过表达 STON1 能够促进植 物生长， 形成较多的叶片、 较大的花瓣和较长的角 果， 。
3、并且能够增加种子重量和单株产量。 本发明在 农作物高产育种中具有极大的生产应用潜力。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丽华 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102586264 B CN 102586264 B *CN102586264B* 1/1 页 2 1. 一种提高植物产量的方法， 包括如下步骤 ： 向出发植物中导入 SEQ ID NO ： 1 所示蛋 白质的编码基因， 得到与所述出发植物相比产量提高的目的。
4、转基因植物 ； 所述出发植物为拟南芥 （Arabidopsis thaliana） 。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述编码基因是通过重组表达载体导入 的 ； 所述重组表达载体是向出发载体 pMDC32 中插入所述编码基因得到的。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质的编 码基因如 SEQ ID NO ： 2 所示。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述产量为植物的单株种子重量。 5. 一种改善植物的与产量相关表型的方法， 包括如下步骤 ： 向出发植物中导入 SEQ ID NO。
5、 ： 1 所示蛋白质的编码基因， 得到与所述出发植物相比与产量相关表型得到改善的目的 转基因植物 ； 所述出发植物为拟南芥 （Arabidopsis thaliana） 。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述编码基因是通过重组表达载体导入 的 ； 所述重组表达载体是向出发载体 pMDC32 中插入所述编码基因得到的 ； 所述与产量相关表型得到改善为如下 1） -7） 中至少一种 ： 1） 与出发植物相比， 叶片数目增加 ； 2） 与出发植物相比， 叶片的面积增加 ； 3） 与出发植物相比， 花瓣的大小变大 ； 4） 与出发植物相比， 角果长度增加 ； 5） 与出发植物相。
6、比， 每个角果里的种子数目增加 ； 6） 与出发植物相比， 种子重量增加 ； 7） 与出发植物相比， 种子长度增加。 7. 根据权利要求 5 或 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质的编 码基因如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 所述叶片数目为基生叶的数目和 / 或茎生叶的数目 ； 所述花瓣的大小变大为如下中的至少一种 ： 花瓣的长度变长、 花瓣的宽度变宽和花瓣 的面积变大。 8.SEQ ID NO ： 2 所示基因和 / 或 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质在提高植物产量中的应用 ； 所述植物为拟南芥 （Arabidopsis thali。
7、ana） 。 权 利 要 求 书 CN 102586264 B 2 1/5 页 3 一种提高植物产量的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高植物产量的方法。 背景技术 0002 随着人口的不断增加， 耕地的逐渐减少， 如何提高作物产量已经成为一个世界性 的、 汲待解决的重大问题。植物器官大小直接关系到植物的产量。器官大小不仅受环境因 素影响， 而且受内源基因的调控。 所以， 研究植物体如何实现自身对器官大小的控制已经成 为提高作物产量的重要策略之一。 发明内容 0003 本发明的一个目的是提供一种提高植物产量的方法。 0004 本发明所提供的提高植物产量的方法， 包括如下步骤 ： 向出发。
8、植物中导入 SEQ IDNO ： 1 所示蛋白质的编码基因， 得到与所述出发植物相比产量提高的目的转基因植物。 0005 上述提高植物产量的方法中， 所述编码基因是通过重组表达载体导入的 ； 所述重 组表达载体是向出发载体 pMDC32 中 ( 具体可以是载体上的重组位点间 ) 插入所述编码基 因得到的。 0006 上述提高植物产量的方法中， 所述 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质的编码基因如 SEQ IDNO ： 2 所示。 0007 上述提高植物产量的方法中， 所述出发植物为双子叶植物。 0008 上 述 提 高 植 物 产 量 的 方 法 中， 所 述 双 子 叶 植 物 为 拟 。
9、南 芥 (Arabidopsis thaliana)。 0009 上述提高植物产量的方法中， 所述产量为植物的单株种子重量。 0010 本发明的另一个目的是提供一种改善植物的与产量相关表型的方法。 0011 本发明所提供的改善植物的与产量相关表型的方法， 包括如下步骤 ： 向出发植物 中导入 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质的编码基因， 得到与所述出发植物相比与产量相关表型得 到改善的目的转基因植物。 0012 上述改善植物的与产量相关表型的方法中， 所述编码基因是通过重组表达载体导 入的 ； 所述重组表达载体是向出发载体pMDC32中(具体可以是载体上的重组位点间)插入 所述编码基因得。
10、到的。 0013 上述改善植物的与产量相关表型的方法中， 所述与产量相关表型得到改善为如下 1)-6) 中至少一种 ： 0014 1) 与出发植物相比， 叶片数目增加 ； 0015 2) 与出发植物相比， 叶片的面积增加 ； 0016 3) 与出发植物相比， 花瓣的大小变大 ； 0017 4) 与出发植物相比， 角果长度增加 ； 0018 5) 与出发植物相比， 每个角果里的种子数目增加 ； 说 明 书 CN 102586264 B 3 2/5 页 4 0019 6) 与出发植物相比， 种子重量增加 ； 0020 7) 与出发植物相比， 种子长度增加。 0021 上述改善植物的与产量相关表型的。
11、方法中， 所述 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质的编码 基因如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 0022 上述改善植物的与产量相关表型的方法中， 所述叶片数目为基生叶的数目和 / 或 茎生叶的数目 ； 0023 上述改善植物的与产量相关表型的方法中， 所述花瓣的大小变大为如下中的至少 一种 ： 花瓣的长度变长、 花瓣的宽度变宽和花瓣的面积变大 ； 0024 上述改善植物的与产量相关表型的方法中， 所述出发植物为双子叶植物 ； 所述双 子叶植物为拟南芥 (Arabidopsis thaliana)。 0025 SEQ ID NO ： 2 所示基因在提高植物产量中的应用也属于本发明的保。
12、护范围。 0026 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白质在提高植物产量中的应用也属于本发明的保护范围。 0027 实验证明， 本发明方法通过过表达 STON1 能够促进植物生长， 形成较多的叶片、 较 大的花瓣和较长的角果， 并且能够增加种子重量和单株产量。本发明在农作物高产育种中 具有极大的生产应用潜力。 附图说明 0028 图 1 为转基因植株表型与野生型植株表型分析。 具体实施方式 0029 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0030 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0031 pCR8/GW/TOPO TA 克隆载体购。
13、自 invitrogen， 产品目录号为 K2500-20。 0032 一、 STON1 编码基因的获得 0033 1、 提取总 RNA 及反转录 0034 在液氮中研碎新鲜的拟南芥(Arabidopsis thaliana)花序， 以植物RNA提取试剂 盒(天根生化科技有限公司)提取总RNA， 用分光光度计(Eppendorf公司， 德国)检测样品 浓度。取 5g 总 RNA， 用反转录试剂盒 (Invitrogen， 美国 ) 进行反转录， 以得到 cDNA。 0035 2、 STON1 编码序列的获得 0036 以步骤 1 得到的 cDNA 为模板， 用引物对 STON1CDS-F/ST。
14、ON1CDS-R 进行 PCR 扩增。 0037 STON1CDS-F ： 5 -ATGTCTGCTCCTTCTGGCGGT ； 0038 STON1CDS-R ： 5 -TTAGAAAGCTAAACAACAAGG。 0039 50l PCR 反应体系为 ： 5l KOD plus buffer、 2l MgSO4、 5l dNTP 混合物、 0.2M 引物 STON1CDS-F 和 0.2M 引物 STON1CDS-R、 1l 的 KOD plus 聚合酶 (TOYOBO， 日 本 )。PCR 循环为 ： 94预变性 2 分钟 ； 再 94 15 秒， 55 30 秒， 68 1 分钟， 共。
15、 32 个循环 ； 最后 68 10 分钟。反应结束后加入 0.2l rTaq( 宝生物 ( 大连 ) 有限公司 )， 72反应 30 分钟加 A。 0040 在1的琼脂糖凝胶中电泳PCR扩增产物， 用凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限 公司 ) 回收约 750bp 的片段， 连接到 pCR8/GW/TOPO TA 克隆载体， 并测序验证 ( 北京诺赛基 说 明 书 CN 102586264 B 4 3/5 页 5 因组研究中心有限公司 )。 0041 测序表明， 亚克隆(命名为TOPOSTON1)在载体pCR8/GW/TOPO TA中插入了SEQ ID NO ： 2 所示基因。该基因为 STO。
16、N1 基因， CDS 全长 756bp(SEQ ID NO ： 2)， 编码一个 251 个氨 基酸的蛋白 (SEQ ID NO ： 1)。 0042 二、 重组植物表达载体 35S:STON1 的构建 0043 pMDC32载体购自Invitrogen， 这是一个GATEWAY系统的植物表达载体。 PMDC有一 系列载体， 是 Invitrogen 公司利用重组技术开发的一套 Gateway 载体， 优点是不需要设计 酶切接头， 不需要酶切连接。 0044 LR enzyme mix 购自 Invitrogen。 0045 1) 小量提取测序正确的亚克隆 ( 命名为 TOPOSTON1) 和。
17、 pMDC32 的质粒 DNA。 0046 2)LR 反 应。 体 系 ： TOPOSTON1 50ng， pMDC32 150ng， LR enzyme mix 1l， TEbuffer(PH8.0) 补足到 10l。室温反应 2 小时， 加入 1l 蛋白酶 K， 37反应 10 分钟。 冰浴 2 分钟， 热击转化 DH10B 感受态细胞， 提取质粒， 进行 Pst1 酶切， 电泳， 被消化成一条约 11kb 条带的为阳性克隆， 被消化成两条 2.4kb 和 9kb 条带的为没有重组的克隆。获得正确 的重组表达载体 ( 命名为 35S:STON1)。将重组表达载体 35S:STON1 进行测。
18、序验证， 结果 在 pMDC32 的重组位点间插入的基因序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0047 三、 植物转化 0048 Silwet L-77 购自 LEHLE SEEDS， 货号 ： VIS-02。 0049 农杆菌 GV3101 在文献 “Li， Y.， Zheng， L.， Corke， F.， Smith， C.， and Bevan， M.W.(2008).Control of final seed and organ size by the DA 1gene family in Arabidopsis thaliana.Genes Dev22， 1331-1336”。
19、 中公开过， 公众可从中国科学院遗传与 发育生物学研究所获得。 0050 1、 重组农杆菌构建 0051 电击转化重组植物表达载体 35S:STON1 到农杆菌 GV3101 中， 电击仪型号为 Micropuler(Bio-RAD)， 得到重组农杆菌。将重组农杆菌进行抗生素 (Kan， Gen， Rif) 平板抗 性筛选培养， 挑取阳性克隆。 0052 侵染农杆菌菌液制备 ： 将挑取的阳性克隆用 5ml 农杆菌培养基 28摇床培养过 夜， 再以 1 100 的体积比转接到农杆菌培养基中大摇至 OD600 为 1.2-1.4。然后， 14， 4000 转离心 10 分钟收集菌体， 用转化缓冲液。
20、重悬， 得到侵染菌液。 0053 农杆菌培养基组成 ： 向 YEP 培养基中添加抗生素 Kan、 抗生素 Gen 和抗生素 Rif， 得到农杆菌培养基。抗生素 Kan、 抗生素 Gen、 抗生素 Rif 和 YEP 培养基的比例为 50mg 40mg 12.5mg 1ml。 0054 转化缓冲液组成 ： 将 1/2MS 培养基， 蔗糖和 silwet L-77 混合， 调 PH 至 5.7， 得到 转化缓冲液。蔗糖、 silwet L-77 和 1/2MS 培养基的配比为蔗糖 ： silwet L-77 ： 1/2MS 培养 基 5mg 0.04ml 1ml。 0055 YEP培养基配制 ： 。
21、酵母提取物(OXOID)10g/L， 大豆蛋白胨(北京双旋微生物生物培 养基制品厂 )10g/L， NaCl 5g/L， 其余为水 ； 调 PH 值到 7.0。 0056 2、 拟南芥转化 0057 利用浸泡花序的方法转化拟南芥 Col-0 野生型， 以获得 35S:STON1 转基因植株。 说 明 书 CN 102586264 B 5 4/5 页 6 具体操作如下 ： 0058 1)、 拟南芥生长条件 0059 拟南芥 Col-0 野生型种子以 70乙醇表面消毒 1 分钟， 5次氯酸钠溶液消毒 10 分钟， 无菌水洗涤 5 遍。4冰箱春化 3 天后， 播种于 1/2MS 固体培养基上， 置于。
22、培养间， 22、 16 小时光照 /8 小时黑暗条件下培养， 7 天后将幼苗移至培养介质 ( 蛭石和草炭土的 体积比为 2 1 混匀 ) 中， 培养至得到带有花序的拟南芥植株。 0060 2)、 转基因植株的获得 0061 当拟南芥植株主枝长 5-15cm 时用步骤 1 中菌液进行侵染。将待转化的拟南芥花 序浸泡在菌液中 10 秒钟， 避光保湿 24h 后， 再培养一个月左右收种， 即为 T1 代种子。拟南 芥培养条件为 ： 16 小时光照 /8 小时黑暗， 强度为 4000Lux， 温度 22， 湿度 60-80。培养 介质为按 2 1 体积混匀的蛭石和营养土。 0062 所得 T1 代种子。
23、春化后播种在潮霉素抗性筛选培养基上筛选转基因植株， 10 天后 移栽到培养介质中。用这种方法共筛选到 78 个转基因植株， 多数具有较多的叶片、 较大的 花瓣、 角果、 种子等器官。整个过程中， 拟南芥培养条件为 ： 16 小时光照 /8 小时黑暗， 强度 为 4000Lux， 温度 22， 湿度 60-80。培养介质为按 2 1 体积混匀的蛭石和营养土。 0063 潮霉素抗性筛选培养基组成 ： 由葡萄糖、 潮霉素 (Hyg) 和 1/2MS 固体培养基组成， 葡萄糖、 潮霉素和1/2MS固体培养基的配比为10g葡萄糖 ： 30mg卡那霉素 ： 1L 1/2MS固体培 养基。 0064 同时以。
24、转入空载体 pMDC32 的拟南芥为空载体对照。 0065 3、 转基因植株的鉴定 0066 (1) 基因组 DNA 提取。 0067 剪 取 4-8cm2的 转 基 因 植 株 叶 片 和 野 生 型 Col-0 的 叶 片，加 入 100l REB(50mMTris-HCl(PH 8.0)， 25mM EDTA， 250mM NaCl， 0.5 SDS， 其余为水 ) 后玻璃棒研 碎， 加入等体积的苯酚 / 氯仿， 离心 10 分钟 ； 取上清， 加入 2 倍体积的无水乙醇 ； 离心 10 分 钟， 弃上清， 以 70乙醇洗沉淀， 凉干后加入 80l 无菌水。以 STON1CDS-F 和 。
25、STON1CDS-R 为引物， 分别以野生型和转基因拟南芥的基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应。 0068 结果显示， 35S:STON1转基因拟南芥的PCR扩增产物有750bp的清晰条带， 而野生 型拟南芥无此条带， 说明 78 棵转基因植株全部为阳性。空载体对照与野生型一致。选取表 型显著的 10 株收种， 为 T2 代种子。在 T3 代通过潮霉素抗性分离出纯合的转基因系， 进行 下一步的表型统计分析。 0069 4、 表型统计分析 0070 相同条件下种植野生型、 转空载体植株和转基因纯合系， 统计花瓣、 角果、 种子、 单 株产量等指标， 方法如下 ： 0071 下述各图中， I。
26、 为野生型， II 为转基因株系。 0072 下述实验均设 3 次重复， 结果取平均数。 0073 (1)统计基生叶和茎生叶的叶片数目。 结果 ： 转基因株系的基生叶数目平均为13/ 株 ； 野生型的基生叶数目平均为 11.4/ 株。转基因株系的茎生叶数目平均为 3.9/ 株 ； 野生 型的茎生叶数目平均为 2.8/ 株。如图 1E 所示， 表明过表达植株具有较多的基生叶和茎生 叶。 说 明 书 CN 102586264 B 6 5/5 页 7 0074 与野生型对照相比， 转基因株系的叶片面积增加 ( 图 1B)。 0075 (2) 取下主茎上第 3- 第 7 朵正在开放的小花， 用镊子小心。
27、将花瓣剖下， 展平， 放在 体式镜 (LEICA S8APO， 德国 ) 下观察并拍照 (LEICA DFC420， 德国 )。用 Image J1.41 软件 测量花瓣的长、 宽、 面积， 利用 EXCEL 进行统计分析 ( 图 1D)。 0076 结果 ： 0077 花瓣长度 ： 转基因株系平均为 3.7mm ； 野生型平均为 3.3mm。 0078 花瓣宽度 ： 转基因株系平均为 1.2mm ； 野生型平均为 1.1mm。 0079 花瓣面积 ： 转基因株系平均为 2.5mm2； 野生型平均为 2.2mm2。 0080 表明过表达植株的花瓣长度增加12， 宽度增加8， 面积增加20。 说。
28、明拟南芥 STON1 基因能够显著增加花瓣的大小 ( 图 1A)。 0081 (3) 取主茎上第 3- 第 7 个即将成熟的角果， 在体式镜下拍照， Image J 软件测量大 小， EXCEL 统计分析 ( 如图 1C， 1F 和 1G)。 0082 角果长度 ： 转基因株系平均长度为 15.5mm ； 野生型平均长度为 13.9mm( 图 1F)。 0083 每个角果里的种子数目 ： 转基因株系为 64 粒 ； 野生型平均为 57 粒 ( 图 1G)。 0084 结果表明过表达植株的角果长度增加 11， 每个角果里的种子数目增加 12。 0085 (4) 收获主茎上第 3- 第 10 个角。
29、果的种子， 室温放置 1 个月后在体式镜下拍照， Image J 软件测量种子大小， EXCEL 统计分析。精确数出 500 粒种子， 在天平上测量种子重 量(METTLER TOLEDO AL104， 中国)， 5次重复。 结果表明野生型植株的种子长度主要集中在 0.45-0.5mm， 而过表达植株主要集中在 0.5-0.55mm。 0086 500粒种子重量 ： 转基因株系平均为9.74mg ； 野生型平均为9.36mg。 500粒种子重 量增加 5 ( 图 1H)。图 1I 的纵坐标是不同大小的种子所占的百分数。1 为 0.50-0.55mm， 2 为 0.45-0.50mm， 3 为 。
30、0.40-0.45mm。 0087 (5) 收集单株种子， 分别称量全株种子质量 ( 即为单株产量 )。 0088 单株产量结果表明， 转基因株系 243.2mg ； 野生型 200.5mg。过表达植株的整株产 量约增加 21 ( 图 1J)。 0089 转空载体拟南芥与野生型拟南芥结果一致。 说 明 书 CN 102586264 B 7 1/4 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102586264 B 8 2/4 页 9 0003 序 列 表 CN 102586264 B 9 3/4 页 10 0004 序 列 表 CN 102586264 B 10 4/4 页 11 序 列 表 CN 102586264 B 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102586264 B 12 。