技术领域
本发明涉及一种制备抗原的方法，尤其涉及一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达狂 犬病毒抗原基因或联合抗原基因的方法，用于制备注射和口服用狂犬病疫苗，属于基因工 程领域。
背景技术
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)侵犯中枢神经系统引起的人兽共患致死性 脑脊髓炎，一旦发病，死亡率几乎为100％。到目前为止无特效治疗药物，有效的办法只 有注射疫苗进行预防，因此对狗、猫和野生动物的大面积的预防免疫是控制和消灭狂犬病 的根本措施。目前我国兽用的狂犬病疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。尽管传统疫苗在狂犬病 预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险 因素很难避免。因此，传统疫苗亟需加以改进，研制安全、高效的狂犬病分子疫苗仍显得 非常必要。
随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用 生物反应器来高效表达狂犬病基因，可望达到大幅度提高狂犬病抗原产量、降低生产成本 的目的(ZHEN FANG Fu，Immunology，vol.88，pp.2001-2005，March 1991，)。
杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆 状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.Cell Biol.，3：2156-2165，1983)， 已有数百个外源基因得到了高效表达，仅我国就有口蹄疫空衣壳粒子(李志勇等，Plos one， e2273，2008)，α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、 慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖 庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。利用此系统来生产狂犬病抗原的优点在 于：1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达10毫克级/虫的水平。因而可大大降低狂 犬病抗原的生产成本并使通过基因工程方法大规模生产狂犬病抗原成为可能；2.这一表达 系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活 性等与天然产品相似，这为所表达的狂犬病抗原具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性提 供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV) 表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统 在昆虫体内安全、高效的同时表达多种狂犬病抗原的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种制备狂犬病抗原的方法，包括：将狂犬病毒的抗原基因或抗原基因的联合表达组 合分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；将构建得到转移表达载体与 杆状病毒DNA进行共转染以发生同源重组或转座，将狂犬病病毒的抗原基因或抗原基因的 联合表达组合分别转移到杆状病毒的基因组上获得重组杆状病毒；用重组杆状病毒感染昆 虫宿主和细胞；培养被感染的昆虫宿主表达相应的狂犬病抗原；收获并纯化所表达的抗原， 即得。
其中，所述的狂犬病毒的抗原基因优选为狂犬病病毒抗原蛋白G基因(其核苷酸序列 为SEQ ID NO：1所示)或狂犬病病毒抗原蛋白N基因(其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所 示)；所述狂犬病毒的抗原基因的联合表达组合为狂犬病病毒抗原蛋白G基因和狂犬病病 毒抗原蛋白抗原蛋白N基因的联合表达组合(即G-IRES-N组合基因)，其核苷酸序列为 SEQ IDNO：5所示；
所述的杆状病毒运载载体的表达盒优选由多角体蛋白启动子、p10启动子或ie-1启动 子与增强子所组合成的表达盒，例如，该杆状病毒运载载体可选自pBM034，pBM93， AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlucBacII(pETL)， p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360，pAc373，pAcAB3，pAcAB 4，PAcAS3，pAcC129，pAcC4， DZI，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2，pAcMLF7，pAcMLF8，pAcMP1，pAcMP2， pAcRP23，pAcRP25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1，pAcUW21，pAcUW2A，pAcUW2B， pAcUW3，pAcUW31，pAcUW41，pAcUW42，pAcUW43，pAcUW51，pAcVC2，pAcVC3， pAcYM1，pAcJcC5，pBac1，pBac2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55，mXIV，pIEINeo， pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391，pVL 1392，pVL 1393，pVL941， pVL 945，pVL 985，pVTBac，pBM030，pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载 体，更优选为pVL1393状病毒运载载体。
本发明中所构建的转移载体优选为pVL1393(G)、pVL1393(N)，或pVL1393 (G-IRES-N)(即用I R E S(内部核糖体进入位点，Chain A，Structure Of Ribosome-Bound Cricket Paralysis Virus Ires Rna.)序列在家蚕中用一个重组病毒同 时进行双基因的联合表达)。
所述的杆状病毒优选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、 MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV或SpltNPV，更优选为家蚕杆状病毒亲本株 Bm-NPV-ZJ8。
所述的重组杆状病毒优选为以下任意一种：(1)用于表达狂犬病糖蛋白G的重组家蚕 核型多角体病毒rBmNPV(G)；(其微生物保藏号是：CGMCC No.2550；保藏地址是： 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心；保藏时间：2008年6月18日；分类命名：家蚕核型多角体病毒Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus)；(2)用于表达狂犬病核蛋白N的重组家蚕核型多角体病毒 rBmNPV(N)；(3)可用于同时表达狂犬病糖蛋白G和狂犬病核蛋白N的重组家蚕核型多 角体病毒rBmNPV(G-IRES-N)。
所述的昆虫宿主选自包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕 (Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、 柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、 苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、 斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等；更优选为家蚕(Bombyx mori)。
所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体 (更优选为：将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感 染3-6天后收集含各种狂犬病抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆)；其中，所述的蛹体 为1-2天的早期嫩蛹。
本发明采用基因重组技术，将来源于狂犬病病毒的不同基因组合，包括狂犬病的糖蛋 白G、核蛋白N、糖蛋白G和核蛋白N的基因联合表达组合G-IRES-N构建到各种由启动 子为多角体蛋白，p10，ie-1等及与增强子组合所驱动的杆状病毒表达所用表达盒的杆状病 毒表达转移运载载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac， Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3， pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、 25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、 3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo， pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1， pSYNXIVVI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985， pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使狂犬病病毒不同的基因组合，包括G、N或G-IRES-N 基因在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内 或体外(in vivo/in vitro)重组，将狂犬病病毒不同的基因组合，包括G、N或G-IRES-N 整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒；重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透 过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期 嫩蛹)，表达生产各种狂犬病病毒抗原。
本发明中最优选的一个技术方案是：将SEQ ID NO：1(狂犬病毒抗原蛋白G基因)、 SEQ ID NO：3(狂犬病毒抗原蛋白N基因)或SEQ ID NO：5(G-IRES-N)所示的DNA序 列插入到运载载体pVL1393上，再通过体内重组将全长狂犬病病毒G、N或G-IRES-N基 因分别转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin 基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带狂犬病不同基因组合的重组家蚕杆状 病毒rBmNPV(G)、rBmNPV(N)、rBmNPV(G-IRES-N)；将其感染家蚕细胞系或穿刺 接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖rBmNPV(G)、rBmNPV(N)、rBmNPV(G-IRES-N)； 当rBmNPV(G)、rBmNPV(N)、rBmNPV(G-IRES-N)在蚕体内复制时，G、N或G-IRES-N 基因在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，产生狂犬病抗原；在感染3-6天(最 佳为5天，25度饲养温度)后收集含狂犬病抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)， 每毫升蚕血淋巴可产生10毫克以上的相应狂犬病抗原，杀灭感染性病原后，经过蛋白纯 化后便得到安全、高效的狂犬病抗原，此种抗原可用于制备预防狂犬病的注射用疫苗；另 将所制备的抗原用脂肪酸乳化后(优选的，将初步纯化的狂犬病毒抗原用等体积的浓度为 25-35％的脂肪酸(为了达到最佳的效果，所述的脂肪酸最好由以下体积百分比的各组分组 成：棕榈酸7％、油酸20.5％、3％硬脂酸、余量为水)混合在一起，经超声波乳化后得到 注射或口服疫苗，经口添饲动物，动物能产生相应的保护抗体，并能经受住狂犬病毒的攻 击，此种抗原可用于制备预防狂犬病口服用疫苗。
本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产狂犬病抗 原，其生产成本显著低于传统的制备狂犬病抗原方法(例如通过细胞繁殖病毒制备狂犬病 抗原)，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于家蚕已经被我国卫 生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接 制作疫苗免疫动物。
总体而言，本发明方法可以大幅度降低狂犬病抗原的生产成本，具有安全、高效、能 耗少、成本低等诸多优点。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们 仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
试验材料
1.大肠杆菌株E.coli TG1和DH5α购自Promega公司；运载载体pVL1393购自于Invitrogen 公司、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8由中国农业科学院生 物技术研究所保存；狂犬病病毒由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病研究室保存； 抗原检测试剂盒购自武汉生物制品研究所基因工程室，高表达家蚕品种JY1由中国农 业科学院生物技术研究所保存。
2.酶与试剂：限制性内切酶、PNK酶、连接酶为Promega公司产品。
3.生化试剂：IPTG、X-Gal为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR 试剂盒、T4DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、胎牛血清及其他试剂购于Invitrogen 公司，细胞培养基TC-100购于Sigma公司。
4.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；家 蚕细胞培养基为TC-100。
5.狂犬病病毒基因不同组合表达产物的动物实验在中国农业科学院兰州兽医研究所动物 隔离实验室进行。
实施例1狂犬病抗原G蛋白的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验
1、狂犬病病毒抗原蛋白G基因的克隆和序列分析
1.1目的基因的获得
设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出狂犬病病毒抗原蛋白G基因(SEQ ID NO：1)。 所设计的抗原蛋白G基因的扩增引物为：
pVL-G上游5′AGGATCCAACATGGTTCCTCAGGTTCTT 3′
BamH I
pVL-G下游5′AGAATTCTCACAGTCTGATCTCACC 3′
EcoR I
取狂犬病病毒CVS毒株90h致死的小鼠一只，无菌解剖取脑组织，按常规方法研磨。 研磨后，用细胞培养液(MEM)制成1∶5的悬液，并加适量的抗菌素，在室温下浸毒6h 或4℃过夜，然后反复冻融几次，使细胞裂解。7500r/min离心5min，取上清液用于总RNA 的提取。
从狂犬病病毒感染致死的小白鼠脑组织中提取总RNA。将提取的总RNA用PVL-G 上游引物在AMV反转录酶的作用下，42℃反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板， 用特异性引物进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：
表1PCR反应条件
PCR反应过程：94℃变性10min；94℃1min，59℃1min，72℃2min，共30个循 环。最后延伸反应10min。
1.2.PCR产物的纯化
将PCR扩增的G基因产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约1.5kb的片段。 在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。 方法如下：切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w) 体积的6M NaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μl玻璃奶(Glass milk)，混匀后室温下放 置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液洗 三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入30μl 0.1×TE Buffer溶解DNA， 离心后去沉淀，取上清作进一步分析。
1.3.酶切与连接反应
酶切反应：纯化后的G片段用BamHI和EcoRI双酶切分析，反应总体积为50μl，其 中纯化的PCR产物10μl，10×酶相应缓冲液5μl，两种酶各为1μl，无菌水补足体积。37 ℃反应2小时以上。将转移质粒pGEM-3Z作同样酶切反应。反应结束后于65℃灭活10 min。
连接反应：连接总体积15μl，PCR产物8μl，载体1μl，5×T4DNA连接缓冲液3μl， T4DNA连接酶1μl，无菌水补足体积，12～14℃连接过夜。
1.4.大肠杆菌的遗传转化
用75mM CaCl2制备大肠杆菌TG1感受态细胞。取步骤3中制备的连接混合物5μl， 加到200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激2分钟，迅速置于冰上1～ 2min，加入已温育至37℃的LB培养基500μl，37℃培养1小时，取100～200μl涂布于 含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。
1.5.质粒DNA的制备
(1)从转化的LB平板上挑取单个菌落，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基中， 37℃培养过夜。
(2)取1.5ml菌液于小离心管中，3500rpm离心4min，去上清。
(3)加入Solution I 150μl，混匀后置于冰上15℃。
(4)加入Solution II 300μl，氯仿150μl，轻轻混匀后静置5min。
(5)加入Solution III 450μl，混匀后置于冰上15min。
(6)11000g离心10min，上清移入新管。
(7)加入异丙醇450μl，混匀后置于4℃15min。
(8)11000g离心6min，去上清。
(9)加入TER 250μl，混匀后置于37℃20min。
(10)加入PPt Buffer 300～350μl，混匀后静置15min。
(11)11000g离心6min，去上清。
(12)加入75％乙醇400μl。
(13)11000g离心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1×TE Buffer 40μl溶解，于-20℃保 存。
1.6.重组子的鉴定
用BamHI/EcoRI双酶切步骤5中制备的质粒DNA，电泳后出现约1.5kb的DNA条带 的质粒为重组运载质粒pGEM-3Z(G)。将重组质粒pGEM-3Z(G)进行双向测序。G基 因序列及所推导的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
2、转移载体pVL1393(G)的构建
将1.6中所制备的质粒pGEM-3Z(G)用BamHI和EcoRI双酶切，用1.2中的方法纯 化G基因片段，与经BamHI和EcoRI双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大 肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393(G)。
3、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制备
按GIBCO公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2NNaOH将pH调至6.22，过滤 除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒 亲本株Bm-NPV-ZJ8感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，3～4天后收集病毒 感染液，离心(5000rpm×10min)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清， 用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH7.5)悬 浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保 温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等 体积的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10 体积的3MNaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA， 5000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中， 放4℃保存备用。
4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)的构建和获得
4.1重组杆状病毒rBmNPV(G)的构建
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养 基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg 家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2μg重组转移质粒pVL1393(G)DNA和5μl 脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中 进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养 4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)的筛选和纯化
接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共 转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小 时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预 热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm 封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上 步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)。
4.3重组病毒rBmNPV(G)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清 液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(G)。
4.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上 清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混 匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引 物为：
5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3’
5’-AGAATTCTCACAGTCTGATCTCACC-3’
取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、 58℃1min、72℃1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析， 结果证明获得了重组病毒。
5、G基因在家蚕蛹和蚕体中高效表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕 鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后 选择平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105rBmNPV(G)，4-5天后收集 发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。从OD值测定实验结果来 看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的10倍以上，而对照Bm-NPV- ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
6、狂犬病毒G抗原的收集
由于狂犬病毒G蛋白是一种膜蛋白，纯化困难。因此分别将上述5中所收获的蚕血淋 巴经超声波破碎，离心去细胞碎片，然后经辐照获得无菌抗原，进一步用层析法等方法纯 化G抗原。
7、动物免疫实验及病毒攻击保护实验
将收集纯化的无菌抗原与等体积油佐剂混合试制疫苗，在小白鼠进行上进行动物试 验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫10只小白鼠，另设5只小白鼠不注射任何东西为对 照组。一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得90％ 的保护，而对照组全部发病。
将初步纯化的狂犬病毒G抗原用等体积的浓度为30.5％脂肪酸(该脂肪酸由以下体积 百分比的各组分组成：棕榈酸7％、油酸20.5％、3％硬脂酸、余量为水)混合，经超声波 乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内 攻击，结果口服试验组获得80％的保护，而对照组全部发病。
本实施例所制备的抗原无论注射还是口服，动物100％都产生保护性抗体。
实施例2狂犬病抗原N蛋白的制备、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实验
1、狂犬病病毒N基因的克隆和序列分析
设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出狂犬病病毒N基因(SEQ ID NO：3)。
所设计的扩增N基因的引物为：
pVL-N上游5′ATCTAGAAACATGGATGCCGACAAGATT 3′
XbaI
pVL-N下游5′AGCGGCCGCTTATGAGTCATTCGAATACGT 3′
Not I
从狂犬病病毒感染致死的小白鼠脑组织中提取总RNA。将提取的总RNA用PVL-N 上游引物在AMV反转录酶的作用下，42℃反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板， 用特异性引物进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：
表2PCR反应条件
PCR反应过程：94℃变性10min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，共30个循 环。最后延伸反应10min。
2、转移载体pVL1393(N)的构建
将1中扩增得到的N按实施例1中1.2的方法纯化，用XbaI和NotI双酶切后，与经 XbaI和NotI双酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重 组转移载体pVL1393(N)。将重组质粒pVL1393(N)进行双向测序。N基因序列及所推 导的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)的构建和获得
3.1、重组杆状病毒rBmNPV(N)的构建
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养 基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg 家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2μg重组转移质粒pVL1393(N)DNA和5μl 脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶 中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养 4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。
3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)的筛选和纯化
接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共 转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小 时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热 的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm 封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上 步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)。
3.3重组病毒rBmNPV(N)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(N)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清 液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(N)。
3.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上 清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混 匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引 物为：
5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3’
5′AGCGGCCGCTTATGAGTCATTCGAATACGT 3′
取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、 55℃1min、72℃1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析， 结果证明获得了重组病毒。
4、N基因在家蚕蚕体和蛹体中表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕 鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后 选择平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹或家蚕接种约1.0×105rBmNPV(N)，4-5天后收 集发病蚕蛹和蚕血，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。从OD值测定实验结果来 看，其表达量达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的100倍以上，而对照Bm-NPV- ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
5、抗原纯化
称取Sephadex干凝胶，溶胀处理后装于玻璃色谱柱中，以洗脱液(5mmol/LTris溶液， 0.1mol/LNaCl，pH 8.0)洗至基线稳定。分别将4所收获的蚕血淋巴经超声波破碎，离心去 细胞碎片。取上述样品上样，取适量洗脱液，流速0.3ml/min，以5min/管收集蛋白洗脱液， 收集至第一峰下降，得纯化抗原。
6、动物免疫实验及病毒攻击保护实验
将收集的纯化抗原与等体积油佐剂混合试制疫苗，在小白鼠进行上进行动物试验。 0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫10只小白鼠，另设5只小白鼠不注射任何东西为对照组。 一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得70％的保护， 而对照组全部发病。
将初步纯化的狂犬病毒N抗原用等体积的浓度为25％的脂肪酸(该脂肪酸由以下体积 百分比的各组分组成：棕榈酸5％、油酸18％、2％硬脂酸、余量为水)混合，经超声波 乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内 攻击，结果口服试验组获得50％的保护，而对照组全部发病。
本实施例所制备的抗原无论注射还是口服的动物80-90％都产生保护性抗体。
实施例3狂犬病毒G和N抗原的联合表达、纯化及动物免疫实验及病毒攻击保护实 验
1、狂犬病毒G-IRES-N组和基因的克隆和序列分析
设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出狂犬病病毒G基因，N基因。
所设计的扩增G、N基因的扩增引物同前。
在G基因和N基因之间连接的一段IRES序列，参照立克次体病毒Cricket Paralysis Virus的IRES(内部核糖体进入位点，Chain A，Structure Of Ribosome-Bound Cricket Paralysis Virus Ires Rna.参见序列SEQ ID NO6)序列由本实验室自行人工合成，在其 5′端和3′端分别添加XbaI和BglII酶切位点。
从狂犬病病毒感染致死的小白鼠脑组织中提取总RNA。将提取的总RNA分别用 pVL-G和pVL-N的上游引物在AMV反转录酶的作用下，42℃反转录制备cDNA。以获得 的扩增G基因和N基因的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增条件同前。
2、转移载体pVL1393(G-IRES-N)的构建
按实施例1中1.2的方法纯化所获得G基因、实施例2中2.1的方法纯化1所获得 N基因和合成IRES片段，经酶切后，与杆状病毒转移载体pVL1393连接，然后转化大肠 杆菌TG1，筛选得到重组转移载pVL1393(G-IRES-N)。将重组质粒pVL1393(G-IRES-N) 进行双向测序。G-IRES-N基因序列见SEQ ID NO：5。
3、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)的构建和获得
3.1重组杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)的构建
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培 养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg 家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA，2μg重组转移质粒pVL1393(G-IRES-N)DNA 和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到 培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃ 恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。
3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)的筛选和纯化
接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共 转染上清进行不同浓度稀释，取1 ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1 小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃ 预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm 封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上 步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)。
3.3重组病毒rBmNPV(G-IRES-N)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(G-IRES-N)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后 收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(G-IRES-N)。
3.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上 清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混 匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引 物为：
5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3’
5′AGCGGCCGCTTATGAGTCATTCGAATACGT 3′
取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、 55℃1min、72℃1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析， 结果证明获得了重组病毒。
4、G-IRES-N基因在家蚕蛹体中表达
本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕 鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后 选择平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕接种约1.0×105rBmNPV(G-IRES-N)，4-5天后收 集发病蚕蛹，-20℃冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。从OD值测定实验结果来看，其 表达的G抗原和N抗原均达到阳性对照传统细胞苗病毒抗原表达水平的15倍和50倍以上，而 对照Bm-NPV-ZJ8感染的蚕血淋巴中未检测到抗原表达。
5、抗原收集
由于狂犬病毒G蛋白是一种膜蛋白，纯化困难。因此分别将上述4中所收获的蚕血淋 巴经超声波破碎，离心去细胞碎片，然后经辐照获得无菌抗原。联合表达的G和N蛋白的 纯化分别参见上述的G和N蛋白的纯化部分。
6、动物免疫实验及病毒攻击保护实验
将收集和初步纯化的无菌抗原与等体积油性完全佐剂混合试制疫苗，在小白鼠上进行 动物试验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫10只小白鼠，另设5只小白鼠不注射任何东 西为对照组。一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得 100％的保护，而对照组全部发病。
将初步纯化的狂犬病毒G和N抗原用等体积的浓度为30.5％的脂肪酸(该脂肪酸由以 下体积百分比的各组分组成：棕榈酸7％、油酸20.5％、3％硬脂酸、余量为水)混合，经 超声波乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，一个月后，用致死性狂犬病毒CVS标准攻毒株 经脑内攻击，结果口服试验组获得100％的保护，而对照组全部发病。
可见，本实施例所制备的抗原无论注射还是口服的动物100％都产生高滴度的保护性 抗体。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所中国农业科学院生物技术研究所
<120>狂犬病毒抗原的制备方法
<130>KLPI0786
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1575
<212>DNA
<213>Rabies Virus
<400>1
atggttcctc aggttctttt gtttgtactc cttctgggtt tttcgttgtg tttcgggaag 60
ttccccattt acacgatacc agacgaactt ggtccctgga gccctattga catacaccat 120
ctcagctgtc caaataacct ggttgtggag gatgaaggat gtaccaacct gtccgagttc 180
tcctacatgg aactcaaagt gggatacatc tcagccatca aagtgaacgg gttcacttgc 240
acaggtgttg tgacagaggc agagacctac accaactttg ttggttatgt cacaaccaca 300
ttcaagagaa agcatttccg ccccacccca gacgcatgta gagccgcgta taactggaag 360
atggccggtg accccagata tgaagagtcc ctacacaatc cataccccga ctaccactgg 420
cttcgaactg taagaaccac caaagagtcc ctcattatca tatccccaag tgtgacagat 480
ttggacccat atgacaaatc ccttcactca agggtcttcc ctggcggaaa gtgctcagga 540
ataacggtgt cctctaccta ctgctcaact aaccatgatt acaccatttg gatgcccgag 600
aatccgagac caaggacacc ttgtgacatt tttaccaata gcagagggaa gagagcatcc 660
aacgggaaca agacttgcgg ctctgtggat gaaagaggcc tgtataagtc tctaaaagga 720
gcatgcaggc tcaagttatg tggagttctt ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc 780
gcgatgcaaa catcagatga gaccaaatgg tgccctccag atcagttggt gaatttgcac 840
gactttcgct cagacgagat tgagcatctc gttgtggagg agttagtcaa gaaaagagag 900
gaatgtctgg atgcattaga gtccatcatg accaccaagt cagtaagttt cagacgtctc 960
agtcacctga gaaaacttgt cccagggttt ggaaaagcat ataccatatt caacaaaacc 1020
ttgatggagg ctgatgctca ctacaagtca gtccggacct ggaatgagat catcccctca 1080
aaagggtgtt tgaaagttgg aggaaggtgc catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat 1140
ggtataatat tagggcctga cgaccatgtc ctaatcccag agatgcaatc atccctcctc 1200
cagcaacata tggagttgtt ggaatcttca gttatccccc tgatgcaccc cctggcagac 1260
ccttctacag ttttcaaaga aggtgatgag gctgaggatt ttgttgaagt tcacctcccc 1320
gatgtgtaca aacagatctc aggggttgac ctgggtctcc cgaactgggg aaagtatgta 1380
ttgatgactg caggggccat gattggcctg gtgttgatat tttccctaat gacatggtgc 1440
agaagagcca atcgaccaga atcgaaacaa cgcagttttg gagggacagg ggggaatgtg 1500
tcagtcactt cccaaagcgg aaaagtcata ccttcatggg aatcatataa gagtggaggt 1560
gagatcagac tgtga 1575
<210>2
<211>524
<212>PRT
<213>Rabies Virus
<400>2
Met Val Pro Gln Val Leu Leu Phe Val Leu Leu Leu Gly Phe Ser Leu
1 5 10 15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Glu Leu Gly Pro
20 25 30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35 40 45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys
65 70 75 80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85 90 95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
100 105 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115 120 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val
130 135 140
Arg Thr Thr Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp
145 150 155 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly
165 170 175
Lys Cys Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
180 185 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys
195 200 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Asn Lys
210 215 220
Thr Cys Gly Ser Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225 230 235 240
Ala Cys Arg Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245 250 255
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro
260 265 270
Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu
275 280 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290 295 300
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305 310 315 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325 330 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
340 345 350
Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly
355 360 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370 375 380
Gly Pro Asp Asp His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385 390 395 400
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His
405 410 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu
420 425 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly
435 440 445
Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Met Thr Ala
450 455 460
Gly Ala Met Ile Gly Leu Val Leu Ile Phe Ser Leu Met Thr Trp Cys
465 470 475 480
Arg Arg Ala Asn Arg Pro Glu Ser Lys Gln Arg Ser Phe Gly Gly Thr
485 490 495
Gly Gly Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys Val Ile Pro Ser
500 505 510
Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Ile Arg Leu
515 520
<210>3
<211>1353
<212>DNA
<213>Rabies Virus
<400>3
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attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgccatca aggatttgaa aaagccttgt 120
atcaccctag ggaaagcccc cgacttgaac aaagcataca aatcagtttt atcaggcatg 180
aatgccgcca aacttgatcc ggatgatgta tgctcctact tggcagcagc aatgcagttc 240
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gtcggtcttc tcctgagtct gtacaggttg agcaaaatat caggacagaa cactggtaac 480
tataagacaa acattgcaga taggatagag cagattttcg agacagcacc ttttgttaag 540
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ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgttcg agccagggca agagacagct 840
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<210>4
<211>450
<212>PRT
<213>Rabies Virus
<400>4
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
Leu Asp Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65 70 75 80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Leu Ile
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Asp Arg Ile Thr Pro Asn Ser Leu Val Glu Ile Lys
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
165 170 175
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180 185 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
195 200 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
210 215 220
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Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
245 250 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
260 265 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
275 280 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
290 295 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305 310 315 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
325 330 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
340 345 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
355 360 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Ser Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
370 375 380
Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385 390 395 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu
405 410 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
420 425 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Asn
435 440 445
Asp Ser
450
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<211>3172
<212>DNA
<213>artifical sequence
<400>5
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<212> DNA
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