技术领域
本发明属于植物组织培养及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种籼稻高效再生及遗 传转化的方法。本发明适用于籼稻成熟胚或幼胚的愈伤组织诱导与再生，以及通过农杆菌介 导外源基因的转化。
背景技术
水稻是全球最重要的粮食作物之一，籼稻是我国主要的栽培类型。农杆菌介导的遗传转 化，稳定性好，且载体容纳的外源DNA片段较大，成为水稻转基因的最优选择。该方法通 过将目的基因片段插入农杆菌质粒上，然后让愈伤组织与农杆菌共培养，从而由载体将目的 基因转移并整合到水稻基因组中。其基本程序包括构建转化载体，建立受体再生体系，导入 目的基因，筛选抗性愈伤组织及获得分化的再生转基因植株等。
通过转基因技术改良水稻品种已有二十多年的历史，但转化成功的报道主要集中在粳稻 上，籼稻的再生及遗传转化难度相对较大。在最新的相关研究中(Lin YJ,Zhang Q等，Opt imizing the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice，Plant Cell Rep.,2005,23:540～547；Sivakumar P.等，High frequency plant regeneration from mature seed of elite,recalcitrant Malaysian Indica rice(Oryza sativa L.)CV.MR219,Acta Biological Hungarica,2010,61(3):313～321；Wani S.H.等，An efficient and reproducible method for regeneration of whole plants from mature seeds of a high yielding Indica rice (Oryza sativa L.)variety PAU201,New Biotechnol.,2011,28(4):418～422)，籼稻遗传转化 仍然存在转化频率低和基因型限制的技术瓶颈。
目前，有关籼稻的转基因研究中，只有部分籼稻品种能够成功获得转基因植株。大部分 籼稻较难分化，其转化周期较长，转化效率较低，甚至有些籼稻品种无法转化成功。其原因 主要是缺乏籼稻通用的高效再生体系与遗传转化方法。针对籼稻再生及遗传转化的现状，我 们详细研究了培养基的有机物成分、培养温度、激素配比、抑菌抗生素的种类与浓度等对籼 稻愈伤组织诱导、继代增殖和外源基因转化的影响，通过转化方法的改进获得本发明，建立 了一种籼稻高效再生及遗传转化的新方法。
发明内容
本发明针对籼稻现有遗传转化技术的不足，是在于提供了一种籼稻高效再生及遗传转化 的方法，建立了籼稻再生与转化的操作流程，筛选简便，效率较高。提高了籼稻遗传转化的 效率，对3个籼稻代表性品种如9311、M5274（籼型两系恢复系）、E09-2076（籼型三系保 持系）进行了转化，转化率均在25%以上。转化过程中的培养条件除了共培养、第一次筛 选阶段为26℃外，其余均为32～34℃高温条件。
本发明通过以下技术方案实现：
一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，它包括以下步骤：
（1）愈伤组织的诱导：
以籼稻成熟胚或幼胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡1min，再用0.1%质量比的 氯化汞浸泡10～12min，无菌水洗涤4～5次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在 32-34℃下暗培养20-30天，诱导愈伤组织；
（2）愈伤组织的继代增殖：
从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养基， 置于32～34℃暗培养条件下，继代培养10～15天；
（3）愈伤组织的预培养：
将生长旺盛、颗粒直径2～3mm的淡黄色愈伤组织块接种于籼稻愈伤组织的预培养培 养基上，32～34℃暗培养3～5天；
（4）农杆菌介导的胚性愈伤转化：
将YEB平板上生长的农杆菌刮到含有乙酰丁香酮的悬菌培养基里，在菌液吸光度为O D600=0.1～0.5的范围内进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆 菌工作菌液中，室温（20－25℃，下同）浸泡10～20min；
（5）愈伤组织与农杆菌的共培养：
将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干30～60min， 然后将愈伤组织颗粒挑到籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基上，26℃下暗培养2～3天；
（6）抗性愈伤组织的筛选：
将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含300～500mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡 10～20min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26℃下暗培养1 0～15天；第二次筛选为32～34℃下暗培养15～20天，直到长出所需的抗性愈伤组织；
（7）抗性愈伤组织的分化：
将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于32～34℃下2000Lux光照培养15～ 30天，再生绿苗；
（8）再生苗的生根：
将4cm以上的再生苗转入生根培养基，32～34℃,2000Lux光照培养15～30天，获得 完整的生根转基因植株。
在本发明中，所述的诱导培养基组分为：以MS为基本培养基，添加2.5mg/L 2，4-D， 800mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶， PH为5.8～6.0。
所述的愈伤继代增殖培养基的组分如下：以MS为基本培养基，添加2.0～3.5mg/L 2， 4-D，0.05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺，300～50 0mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶，PH为5.8～6.0。
所述的籼稻愈伤组织的预培养培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加2. 0～3.5mg/L 2，4-D，0.05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨 酰胺，300～500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5g/L植物凝胶，100～200uM 的乙酰丁香酮，PH为5.6。
所述的农杆菌的悬菌培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加2.0～3.5mg/L 2，4-D，0.05～0.30mg/L KT，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，100～200uM的乙酰丁香酮，P H为5.6。
所述的籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基， 添加2.0～3.5mg/L 2，4-D，0.05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg /L谷氨酰胺，300～500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5g/L植物凝胶，100～2 00uM的乙酰丁香酮，PH为5.6。
所述的筛选培养基的组分如下：以MS为基本培养基，添加2.0～3.5mg/L 2，4-D，0. 05～0.30mg/L KT，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺，300～500mg/L脯 氨酸，30g/L蔗糖，3.0g/L植物凝胶，25～60mg/L潮霉素，300～500mg/L特美汀，PH为 5.8～6.0；第一次筛选培养基的潮霉素浓度为25～40mg/L，第二次筛选培养基的潮霉素浓度 为40～60mg/L。
所述的分化培养基的组分如下：以MS为基本培养基，添加1.5～2.5mg/L BA，0.5～1. 5mg/L KT，0.3～0.8mg/L NAA，500～800mg/L水解酪蛋白，300～500mg/L谷氨酰胺， 30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶，PH5.8-6.0。
所述的再生苗的生根培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加1.0mg/L NA A，0.2mg/L IBA，30g/L蔗糖，0.2g/L活性炭，6.0g/L琼脂，pH6.0。
本发明的优点在于：
本发明具用具有广泛代表性，对3个籼稻代表性品种如9311、M5274（籼型两系恢复 系）、E09-2076（籼型三系保持系）进行了转化，效率较高，均在25%以上。转化过程中的 培养条件除了共培养、第一次筛选阶段为26℃外，其余均为32～34℃高温条件，愈伤组织 生长速度快，转化周期短（见表1）。以特美汀作为抑菌剂，抑菌效果好，避免了共培养过 程中农杆菌的过度生长对愈伤组织的负面影响（见表2）。优化后的激素配比利于愈伤组织 的分化成苗，提高了转化效率（见表3）。本发明方法在籼稻转基因研究和分子育种中具有 较好的实用性和高效性。
表1不同培养温度对籼稻M5274愈伤继代的影响
表2不同抗生素对籼稻M5274转化愈伤的抑菌效果比较
表3不同籼稻品种的再生和转化效率
附图说明
图1为一种M5274成熟胚诱导愈伤示意图。
诱导率高，愈伤呈淡黄色球状。
图2为一种M5274胚性愈伤增殖示意图。
愈伤生长速度快，呈黄色，无褐化。
图3为一种M5274胚性愈伤分化示意图。
愈伤分化率较高。
图4为一种M5274愈伤预培养示意图。
愈伤呈黄色，坚硬，轻微褐化。
图5为一种M5274转化愈伤初次筛选示意图。
部分呈淡黄色的愈伤生长正常，部分愈伤在筛选的压力下完全褐化。
图6为一种M5274转化愈伤二次筛选示意图。
初次筛选中生长正常的淡黄色愈伤在二次筛选时，抗性愈伤生长迅速，其余愈伤几乎不 生长。
图7为一种M5274抗性愈伤分化示意图。
愈伤分化出较多绿色芽点。
图8为一种M5274再生阳性植株示意图。
植株生长健壮，生根良好。
具体实施方式
实施例1：
1．愈伤组织的诱导：
以籼稻品种M5274成熟胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡1min，再用0.1%质 量比的氯化汞浸泡12min，无菌水洗涤5次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在3 3℃下暗培养25天，诱导愈伤组织。
2．愈伤组织的继代增殖：
从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代培养基，置于 33℃暗培养条件下，继代培养12天。
3．愈伤组织的预培养：
将生长旺盛、颗粒直径2～3mm的淡黄色愈伤组织块接种于预培养培养基上，33℃暗 培养4天。
4．农杆菌介导的胚性愈伤转化：
所用菌株为根癌农杆菌菌株EHA105、质粒PCAMBIA1301，含潮霉素抗性基因。将YEB 平板上生长的农杆菌刮到含有100uM的乙酰丁香酮的农杆菌悬浮培养基里，取吸光度为O D600=0.3的工作菌液进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆菌 工作菌液中，室温浸泡15min。
5．愈伤组织与农杆菌的共培养：
将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干45min，然后 将愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，26℃下暗培养2天。
6．抗性愈伤组织的筛选：
将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含400mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡15mi n，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26℃下暗培养12天；第 二次筛选为33℃下暗培养20天，长出所需的抗性愈伤组织。
7．抗性愈伤组织的分化：
将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于33℃下2000Lux光照培养25天，再 生绿苗。
8．再生苗的生根：
将4cm以上的再生苗转入生根培养基，33℃,2000Lux光照培养25天，获得完整的生 根转基因植株。(参见附图h)
在实施例1中，本发明人对M5274愈伤组织进行转化，将458个转化愈伤进行潮霉素 抗性筛选，并对再生植株进行PCR、Southern等分子检测，最终得到了161个阳性转化植株， 其转化效率达到了35.2%。
实施例2：
1．愈伤组织的诱导：
以籼稻品种E09-2076幼胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡1min，再用0.1%质 量比的氯化汞浸泡10min，无菌水洗涤4次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在3 3℃下暗培养22天，诱导愈伤组织。
2．愈伤组织的继代增殖：
从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代培养基，置于 33℃暗培养条件下，继代培养14天。
3．愈伤组织的预培养：
将生长旺盛、颗粒直径2～3mm的淡黄色愈伤组织块接种于预培养培养基上，33℃暗 培养5天。
4．农杆菌介导的胚性愈伤转化：
所用菌株为根癌农杆菌菌株EHA105、质粒PCAMBIA1301，含潮霉素抗性基因。将YEB平 板上生长的农杆菌刮到含有200uM的乙酰丁香酮的农杆菌悬浮培养基里，取吸光度为OD600=0.4的工作菌液进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆菌工 作菌液中，室温浸泡12min。
5．愈伤组织与农杆菌的共培养：
将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干50min，然后 将愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，26℃下暗培养3天。
6．抗性愈伤组织的筛选：
将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含400mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡15mi n，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26℃下暗培养15天；第 二次筛选为33℃下暗培养22天，长出所需的抗性愈伤组织。
7．抗性愈伤组织的分化：
将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于33℃下2000Lux光照培养30天，再 生绿苗。
8．再生苗的生根：
将4cm以上的再生苗转入生根培养基，33℃，2000Lux光照培养20天，获得完整的生 根转基因植株。
在实施例2中，本发明人对E09-2076愈伤组织进行转化，将375个转化愈伤进行潮霉 素抗性筛选，并对再生植株进行PCR、Southern等分子检测，最终得到了124个阳性转化植 株，其转化效率达到了33.1%。
除了以上籼稻两系恢复系M5274、籼稻保持系E09-2076外，本发明人还采用本发明方 法对其它籼稻品种如9311等进行了转化实验，均得到了阳性转基因植株，而且转化效率在 25%以上。这些研究结果更进一步证明了本发明方法的可靠性和稳定性。