纤维素酶分离提纯方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102876647 B (45)授权公告日 2014.02.12 CN 102876647 B (21)申请号 201210391781.2 (22)申请日 2012.10.16 C12N 9/42(2006.01) C12R 1/885(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (73)专利权人 熊鹏 地址 223005 江苏省淮安市经济开发区海口 路 9 号留学生创业园 (72)发明人 熊鹏 贺建龙 周玉珍 (74)专利代理机构 淮安市科翔专利商标事务所 32110 代理人 韩晓斌 CN 1654642 A,2005.08.17, 全文 . CN 。

2、1327051 A,2001.12.19, 全文 . CN 102071179 A,2011.05.25, 全文 . 胡学智 . 国内外工业酶制剂发酵及下游工程 概况 .四川制糖发酵 .1990,( 第 3 期 ),36-44. 胡学智 . 国内外工业酶制剂发酵及下游工 程概况 （续二） .四川制糖发酵 .1991,( 第 1 期 ),40-50. 胡学智 . 国内外工业酶制剂发酵及下游工 程概况 （续一） .四川制糖发酵 .1990,( 第 4 期 ),41-50. (54) 发明名称 纤维素酶分离提纯方法 (57) 摘要 本发明公开了一种纤维素酶分离提纯方法， 真菌液体深层发酵纤维素酶发酵。

3、液经过板框过滤 除去发酵液中的大颗粒物质及菌丝， 将纤维素酶 板框滤液储存在滤液储罐中， 为了避免酶活损失 保持低温状态， 纤维素酶板框滤液经过超滤膜浓 缩后与保护剂乳糖和二氧化硅进行混合， 搅拌均 匀， 混合纤维素酶物料经过除菌膜设备过滤掉杂 菌， 除菌纤维素酶料液经过喷雾干燥过程得到纤 维素酶粉状成品。本发明分离提纯的纤维素酶粉 状成品解决了纤维素酶发酵液后道提取过程中产 生杂菌致使纤维素酶大量损失的问题， 并且在使 用喷雾保护剂后， 喷雾酶活收率提高了 18%， 整个 提纯工艺纤维素酶收率提高了 23%， 降低了生产 成本。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 罗霄 权利要。

4、求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 102876647 B CN 102876647 B 1/1 页 2 1. 纤维素酶分离提纯方法， 其特征是该纤维素酶的分离提纯方法包括以下步骤 ： （1）纤维素酶发酵液板框压滤 ： 纤维素酶发酵液为液体深层发酵法生产的纤维素 酶发酵液， FPA 酶活为 20U/ml50U/ml， 发酵液通过板框压滤除去发酵液中的大颗粒物 质及菌丝， 滤布目数为 720， 压滤速率 6 吨 / 小时 ； 其中， 纤维素酶发酵液是由里氏木霉 (Trichoderma ree。

5、si)、 黑曲霉 (Aspergillus niger) 真菌作为生产菌种直接发酵所得 ; （2）纤维素酶板框滤液低温保存 ： 纤维素酶板框滤液储罐用 4冷却水进行低温 15保存 ； （3） 纤维素酶板框滤液超滤浓缩 ： 低温保存后的纤维素酶板框滤液经过 30KD 超滤膜浓 缩至 600800U/ml ； （4） 纤维素酶超滤浓缩液喷雾干燥前处理 ： 纤维素酶超滤浓缩液与其质量 0.2% 乳糖 和其质量 0.5% 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀得混合纤维素酶物料， 混合纤维素酶物料经过 0.2um 除菌膜设备过滤掉杂菌 ； （5） 喷雾干燥制纤维素酶粉状产品 ： 对喷雾干燥前处理过的纤维素酶物料。

6、进行喷雾干 燥， 喷雾干燥的入口温度为 130-150， 出口温度 50-80， 气流的流速为 1-20m/s， 干燥时 间为 1s-10s。 权 利 要 求 书 CN 102876647 B 2 1/4 页 3 纤维素酶分离提纯方法 技术领域 0001 本发明属于酶技术领域， 具体地说， 涉及一种纤维素酶分离提纯方法。 技术背景 0002 纤维素是由吡喃葡萄糖通过 -1,4- 糖苷键连接而成的高聚多糖分子。纤维素酶 具备水解木质纤维素成糖的能力， 这使得其具有广泛的应用前景。 纤维素酶由三类组成 ： 内 切葡聚糖酶 (EG) ； 外切葡聚糖酶 (CBH) ； - 葡萄糖苷酶 (BG)。内切葡。

7、聚糖酶 (EG) 作用于 不溶性纤维素的表面， 破坏其晶体结构， 将内部的纤维素链暴露出来使其易于水解 ； 外切葡 聚糖酶 (CBH) 将暴露出来的纤维素链水解为 2 4 个单位的寡糖 ； - 葡萄糖苷酶 (BG) 最 终将其降解为葡萄糖单糖。纤维素酶水解纤维素能力是通过多种酶的协同作用发挥的， 因 此纤维素酶整体酶的效果不仅取决于各个酶的自身酶活， 同时取决于协同作用中酶的种类 及酶之间的比例。 只有各种类之间的酶活比列达到一个最优的配比才能在最小的酶投入量 下获得最优的酶水解效果。目前纤维素酶几乎都由微生物发酵提纯制备获得， 但是在提纯 纤维素酶的工艺过程中， 由于膜过滤浓缩步骤的时间过长。

8、导致纤维素酶酶活失活、 杂菌滋 生等现象出现 ； 同时， 喷雾干燥步骤中的最佳保护剂及其量的选择都对纤维素酶酶活影响 较大。 发明内容 0003 本发明的目的在于 ： 提供一种纤维素酶分离提纯方法， 方法简单， 操作容易， 收率 高， 成本低。 0004 本发明的技术解决方案是该纤维素酶的分离提纯方法包括以下步骤 ： 0005 （1） 纤维素酶发酵液板框压滤 ： 纤维素酶发酵液为液体深层发酵法生产的纤维素 酶发酵液， 发酵液通过板框压滤除去发酵液中的大颗粒物质及菌丝， 滤布目数为 720， 压滤 速率 6 吨 / 小时 ； 0006 （2） 纤维素酶板框滤液低温保存 ： 纤维素酶板框滤液储罐用。

9、 4冷却水进行低温 15保存 ； 0007 （3） 纤维素酶板框滤液超滤浓缩 ： 低温保存后的纤维素酶板框滤液经过 30KD 超滤 膜浓缩至 600800U/ml ； 0008 （4） 纤维素酶超滤浓缩液喷雾干燥前处理 ： 纤维素酶超滤浓缩液与其质量 0.2% 乳 糖和其质量 0.5% 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀得混合纤维素酶物料， 混合纤维素酶物料经 过 0.2um 除菌膜设备过滤掉杂菌 ； 0009 （5） 喷雾干燥制纤维素酶粉状产品 ： 对喷雾干燥前处理过的纤维素酶物料进行喷 雾干燥， 喷雾干燥的入口温度为 130-150， 出口温度 50-80， 气流的流速为 1-20m/s， 干 。

10、燥时间为 1s-10s。 0010 其中， 本发明的纤维素酶发酵液是以里氏木霉 (Trichoderma reesi)、 黑曲霉 (Aspergillus niger) 真菌作为生产菌种， 直接发酵所得。 说 明 书 CN 102876647 B 3 2/4 页 4 0011 本发明的特征效果如下 ： 0012 1. 在纤维素酶液膜浓缩的前道工序中增加了低温保存工序， 较好地解决了纤维素 酶在膜浓缩过程中因为耗时较长而导致的酶失活现象。 0013 2. 纤维素酶浓缩液喷雾前处理加入乳糖和二氧化硅保护剂， 酶活收率大幅度提 高。 0014 3. 在喷雾干燥前利用除菌膜除杂菌工序解决了喷雾后的纤维。

11、素酶粉状成品菌落 数偏高的现象， 使其应用领域扩展到食品和饲料领域。 具体实施方式 0015 下面结合具体的实施例， 进一步详细地描述本发明。 本领域技术人员应当理解， 这 些实施例只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0016 实施例 1 ： 利用里氏木霉发酵生产纤维素酶， 500L 发酵罐装液量 400L 发酵 6 天结 束 ； 测定其中纤维素酶的 FPA 酶活为 46.2U/ml， 测定方法为中华人民共和国轻工行业标准 QB 2583-2003 ； 板框过滤除去发酵液中的大颗粒物质及菌丝得到发酵液 380L， 滤液 FPA 酶 活45.8U/ml ； 板框滤液经过泵。

12、移入低温储罐用4冷却水对其循环冷， 低于15保存 ； 板框 滤液经过 30KD 超滤膜浓缩至 800U/ml， 耗时 3 天， 浓缩液体积为 19.5L ； 往浓缩液加入 39g （0.2%， w/v） 乳糖和 97.5g（0.5%， w/v） 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀， 混合物料经过孔径为 0.2um 的 PALL 除菌设备过滤掉杂菌 ； 除菌后的纤维素酶酶液进行喷雾干燥， 喷雾干燥的入 口温度为130， 出口温度50， 气流的流速为1m/s， 干燥时间为10s ； 喷雾干燥得到成品纤 维素酶酶粉 14.3kg， FPA 酶活 1033U/g， 成品经包装入库。下表为各步收率。 0017。

13、 0018 实施例 2 ： 利用里氏木霉发酵生产纤维素酶， 500L 发酵罐装液量 400L 发酵 6 天结 束 ； 测定其中纤维素酶的 FPA 酶活为 46.2U/ml， 测定方法为中华人民共和国轻工行业标准 QB 2583-2003 ； 板框过滤除去发酵液中的大颗粒物质及菌丝得到发酵液 380L， 滤液 FPA 酶 活45.8U/ml ； 板框滤液经过泵移入低温储罐用4冷却水对其循环冷， 低于15保存 ； 板框 滤液经过 30KD 超滤膜浓缩至 700U/ml， 耗时 3 天， 浓缩液体积为 19.5L ； 往浓缩液加入 39g （0.2%， w/v） 乳糖和 97.5g（0.5%， w/。

14、v） 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀， 混合物料经过孔径为 0.2um 的 PALL 除菌设备过滤掉杂菌 ； 除菌后的纤维素酶酶液进行喷雾干燥， 喷雾干燥的入 口温度为140， 出口温度65， 气流的流速为10m/s， 干燥时间为5s ； 喷雾干燥得到成品纤 维素酶酶粉 14.2kg， FPA 酶活 1033U/g， 成品经包装入库。 0019 实施例 3 ： 利用里氏木霉发酵生产纤维素酶， 500L 发酵罐装液量 400L 发酵 6 天结 束 ； 测定其中纤维素酶的 FPA 酶活为 46.2U/ml， 测定方法为中华人民共和国轻工行业标准 QB 2583-2003 ； 板框过滤除去发酵液中的大。

15、颗粒物质及菌丝得到发酵液 380L， 滤液 FPA 酶 活45.8U/ml ； 板框滤液经过泵移入低温储罐用4冷却水对其循环冷， 低于15保存 ； 板框 说 明 书 CN 102876647 B 4 3/4 页 5 滤液经过 30KD 超滤膜浓缩至 600U/ml， 耗时 3 天， 浓缩液体积为 19.5L ； 往浓缩液加入 39g （0.2%， w/v） 乳糖和 97.5g（0.5%， w/v） 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀， 混合物料经过孔径为 0.2um 的 PALL 除菌设备过滤掉杂菌 ； 除菌后的纤维素酶酶液进行喷雾干燥， 喷雾干燥的入 口温度为150， 出口温度80， 气流的流速为。

16、20m/s， 干燥时间为1s ； 喷雾干燥得到成品纤 维素酶酶粉 14.1kg， FPA 酶活 1033U/g， 成品经包装入库。 0020 实施例 4 ： 利用黑曲霉发酵生产纤维素酶， 500L 发酵罐装液量 400L 发酵 6 天结 束 ； 测定其中纤维素酶的 FPA 酶活为 28.3U/ml， 测定方法为中华人民共和国轻工行业标准 QB 2583-2003 ； 板框过滤除去发酵液中的大颗粒物质及菌丝得到发酵液 385L， 滤液 FPA 酶 活28.8U/ml ； 板框滤液经过泵移入低温储罐用4冷却水对其循环冷， 低于15保存 ； 板框 滤液经过 30KD 超滤膜浓缩至 800U/ml， 。

17、耗时 3 天， 浓缩液体积为 16.5L ； 往浓缩液加入 33g （0.2%， w/v） 乳糖和 82.5g（0.5%， w/v） 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀， 混合物料经过孔径为 0.2um 的 PALL 除菌设备过滤掉杂菌 ； 除菌后的纤维素酶酶液进行喷雾干燥， 喷雾干燥的入 口温度为150， 出口温度80， 气流的流速为1m/s， 干燥时间为10s ； 喷雾干燥得到成品纤 维素酶酶粉 9.4kg， FPA 酶活 998U/g， 成品经包装入库。下表为各步收率。 0021 0022 实施例 5 ： 利用黑曲霉发酵生产纤维素酶， 500L 发酵罐装液量 400L 发酵 6 天结 束 ； 。

18、测定其中纤维素酶的 FPA 酶活为 28.3U/ml， 测定方法为中华人民共和国轻工行业标准 QB 2583-2003 ； 板框过滤除去发酵液中的大颗粒物质及菌丝得到发酵液 385L， 滤液 FPA 酶 活28.8U/ml ； 板框滤液经过泵移入低温储罐用4冷却水对其循环冷， 低于15保存 ； 板框 滤液经过 30KD 超滤膜浓缩至 600U/ml， 耗时 3 天， 浓缩液体积为 16.5L ； 往浓缩液加入 33g （0.2%， w/v） 乳糖和 82.5g（0.5%， w/v） 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀， 混合物料经过孔径为 0.2um 的 PALL 除菌设备过滤掉杂菌 ； 除菌后的纤。

19、维素酶酶液进行喷雾干燥， 喷雾干燥的入 口温度为130， 出口温度50， 气流的流速为20m/s， 干燥时间为1s ； 喷雾干燥得到成品纤 维素酶酶粉 9.3kg， FPA 酶活 998U/g， 成品经包装入库。 0023 实施例 6 ： 利用黑曲霉发酵生产纤维素酶， 500L 发酵罐装液量 400L 发酵 6 天结 束 ； 测定其中纤维素酶的 FPA 酶活为 28.3U/ml， 测定方法为中华人民共和国轻工行业标准 QB 2583-2003 ； 板框过滤除去发酵液中的大颗粒物质及菌丝得到发酵液 385L， 滤液 FPA 酶 活28.8U/ml ； 板框滤液经过泵移入低温储罐用4冷却水对其循环。

20、冷， 低于15保存 ； 板框 滤液经过 30KD 超滤膜浓缩至 700U/ml， 耗时 3 天， 浓缩液体积为 16.5L ； 往浓缩液加入 33g （0.2%， w/v） 乳糖和 82.5g（0.5%， w/v） 二氧化硅进行混合， 搅拌均匀， 混合物料经过孔径为 0.2um 的 PALL 除菌设备过滤掉杂菌 ； 除菌后的纤维素酶酶液进行喷雾干燥， 喷雾干燥的入 口温度为140， 出口温度65， 气流的流速为10m/s， 干燥时间为5s ； 喷雾干燥得到成品纤 维素酶酶粉 9.2kg， FPA 酶活 998U/g， 成品经包装入库。 0024 实验例 7 ： 将实施例 1-6 处理后的纤维素。

21、酶粉用于生物质废料小麦秸秆酶解后进 行发酵生产纤维质酒精 ； 在蒸汽爆破炉中预处理秸秆， 蒸汽压力 20kgf/cm2保持 3 分钟后爆 说 明 书 CN 102876647 B 5 4/4 页 6 破 ； 往 250L 发酵罐里加入预处理后的秸秆 30kg 和水， 混合配制成 20%（w/v） 的溶液 150L， 加入 225g 纤维素酶酶粉 （1000U/g） 后 60 度反应 2 小时后加入酵母进行酒精发酵 ； 发酵 4 天后结束， 酒精浓度达到 46g/L。 0025 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明 基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此， 在不 偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102876647 B 6 。