技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域中的基因克隆技术，具体涉及一种家蝇抗 菌肽基因及其筛选克隆方法。
背景技术
家蝇抗菌肽是一类由结构基因编码的小分子肽类物质，是构成其自身免疫体 系的重要组分，其分子量小，热稳定性、水溶性好，抗原性低等特点，具有广谱 的抗细菌、抗病毒、抑肿瘤细胞、原虫等多种生物活性，且对耐药菌株也有明显 的杀伤作用，作用的机理也非常独特。主要作用于病原体细胞膜而起作用，因此 不易产生耐药性，且对正常真核细胞几乎无作用，近年研究发现还具有清除氧自 由基、抗辐射、提高机体免疫、促进伤口愈合等功能；特别是对耐药菌株和癌细 胞的杀伤作用更为引人关注，人们期望通过基因工程方法能开发出新型肽类药 物，或者将其转入动植物体内，使其抗病性能得到增强、在食品行业中期望可作 为绿色防腐剂、饲料加工业作无害添加剂及农业中开发成无公害农药等产品。
传统研究家蝇抗菌肽多采用化学方法从其血淋巴中提取纯化，但因其血淋巴 成分复杂，分离纯化较困难，且直接提取成本高、产率低，效益上很不经济。若 用基因工程方法生产抗菌肽是较理想途径，而基因源是其首要前提和关键。
国外有关家蝇抗菌肽的研究少有报道，国内学者采用分离纯化方法发现其体 内存在有多种高活性的抗菌物质，在其它昆虫体内也是如此，如从双翅目果蝇 (Drosophila)体内已发现了7种不同类型的抗菌肽，鳞翅目家蚕(Bombyxmori) 体内也发现了8种不同的抗菌肽；到目前为止从家蝇体内还只克隆到了 Cecropin、Attacin、Defensin三个抗菌肽基因，这与传统分离研究所发现的抗 菌活性物质数量明显不符，证明其体内可能还有其它抗菌肽基因未被发现。从已 克隆到的这三个基因来看，发现与其它昆虫同类抗菌肽基因存在很大的同源性， 在其编码区同源性最高，且存在保守的结构域。
家蝇从幼虫到成虫常生活在垃圾堆、禽畜粪便等有多种病原菌孳生的环境 中，携带有害病原微生物约60多种，能在人、畜中通过机械传播多种疾病，而 自身并不染病，且不具有高等动物那样高度专一的免疫体系，亦缺乏B、T淋巴 细胞系统，也无免疫球蛋白和补体的存在，仅依赖于其独特的天然免疫系统抵抗 各种微生物的感染，抗菌肽在其中起着主要的作用。该作用是否是因各抗菌肽协 同所产生的合力所致还是每一抗菌肽作用于不同病原微生物所产生的结果还不 很清楚。因此，为了全面揭示家蝇抗菌肽在其免疫防御中的作用，给下一步研究 其在体内的时相及空间分布的表达模式奠定基础，也为今后用基因工程方法研究 其抗菌肽提供基因源，有必要对其抗菌肽相关基因进行筛选。
随着后基因组时代的到来，基因序列数据、蛋白质及其相关信息等均以指数 的速度增长，其中生物信息学(bioinformatics)在研究基因与蛋白质的表达与 功能、各功能基因的发现与识别等方面发挥着极其重要的作用，并已广泛渗透到 生命科学的各个研究领域，成为生命科学研究者一门不可缺少的工具。基因芯片 技术将大量生物分子作为探针用点样仪有序地点印在特制玻片、硅片等支持物表 面，组成密集的二维分子阵列。按照碱基互补配对原理，在固相支持物上通过原 位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量特定DNA探针以显微打 印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的 检测分析来得出样品的遗传信息即基因序列及表达的信息。
近年来随着核酸合成技术的进步，使得人工合成长链寡核苷酸做探针点样制 备基因芯片已成现实，且人工合成oligo探针简单直接，所构建的微阵列具有更 好的特异性和较均一的Tm值等优点，可提高芯片杂交时的稳定性和可重复性； 研究表明长度为50～70bp的寡核苷酸探针足以代表一个基因，且其灵敏度和特 异性两方面都最佳，因此可以采用人工合成长度为50bp的寡核苷酸探针来构建 微阵列，作为高特异性探针来筛选家蝇抗菌肽相关基因。
综上所述，有必要对家蝇抗菌肽相关基因进行筛选克隆，而且倾向于采用人 工合成oligo探针、直接点样法制备好的芯片与已标记的待测家蝇生物样品中靶 分子杂交，达到筛选目的。但是，现有的技术对生物样品的mRNA质量控制不好， 影响了对芯片进行杂交的结果影响和限制了这一领域相关技术的发展及应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的家蝇抗菌肽基因，选择经诱导的家蝇三龄 期幼虫，利用基因芯片技术筛选克隆得到一种新的新的家蝇抗菌肽基因，并提供 其序列。
本发明另一个目的是提供所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，从探针的设 计、杂交和洗片条件的精确限制而确定的基因芯片技术，以保证得到较好、较忠 实的杂交效果，达到发明目的。
本发明的技术方案是提供一种家蝇抗菌肽基因，其抗菌肽基因序列全长 460bp，从57bp～356bp、起始密码子为ATG、终止密码子为TAA、含300bp的区 域编码99个氨基酸，基因序列表如SEQ ID N0：1，及附图3，附图4。
本发明同时提供了所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，包括以下步骤：
(1)采用基因芯片技术筛选出家蝇相关基因；
(2)设计简并引物，获取同源片断；
(3)行RT-PCR扩增出基因片段；
(4)以全长文库做模板，结合文库通用引物行特异性PCR扩增出该抗菌肽 基因的全长序列。
其中，步骤(1)包括以下步骤：
(1)设计探针，将探针点印在芯片上构建寡核苷酸探针微阵列，打印好的 芯片经紫外交联处理后放暗盒中保存备用；
(2)芯片预杂交处理；
(3)提取和纯化家蝇脂肪体总RNA，逆转录成cDNA并标记上荧光标记物Cy3， 与构建的寡核苷酸探针微阵列芯片杂交；
(4)经洗片、扫描处理后进行数据分析。
所述提取和纯化家蝇脂肪体总RNA，选取的家蝇是经过诱导的家蝇三龄 期幼虫，取家蝇三龄期幼虫，用昆虫针蘸取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液， 从腹部进行刺针，再放回饲养24小时后收集。
为获取同源片断，本发明设计简并引物为：
上游简并引物A1：5′-GHGGHWSBCCHAARGATGG-3′19bp
下游简并引物A2：5′-RTTDCCRTADGGDCCDCC-3′18bp
采用RT-PCR方法扩增出基因片段包括目的基因cDNA的3′端克隆和目 的基因cDNA 5′端克隆，目的基因cDNA的3′端克隆引物为
上游引物B1：5′CAA TGT AAA TGC CGA TGT C 3′(19bp)
下游引物p2：5/ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC 3/(21bp)
目的基因cDNA 5′端克隆引物为
上游引物P1：5/ CTC CGA GAT CTG GAC GAG C 3/(19bp)
下游引物B2：5′TTA CAT TGC CTT AAA AAT CAC CT 3′(23bp)
本发明采用基因芯片技术筛选出家蝇相关基因的实验中，所述探针设计是在 GenBank数据库中获取昆虫抗菌肽基因序列，分析其编码区和保守结构域，用 Array Designer 2.0生物学软件据其保守结构域设计。所述芯片预杂交处理是 在杂交缸中倒入液面高度与芯片同高的预杂交缓冲液，小心放入芯片，置摇床上 于室温缓慢摇晃20-30分钟后取出甩干，并用气罐轻轻吹干表面至整个玻片完全 干燥。采用诱导后的新鲜三龄期家蝇幼虫脂肪体作提取物，器具经去RNA酶处理， 研磨时加入液氮和TRIZOL试剂进行充分裂解，直至完全匀浆，采用氯仿抽提， 乙醇洗涤，并采用纯化柱对总RNA进行纯化。将纯化、标记好的cDNA抽干，加 入4×杂交缓冲液、甲酰胺、灭菌水至总体积30μl，混匀后短暂离心，95℃水 浴5分钟，立即冰上放置1分钟，振荡混匀后短暂离心，将之铺在预杂交过的芯 片阵列上，轻轻盖上盖玻片，放入杂交盒内，于37℃下杂交16小时。取出玻片 放于片夹上，将放入盛有去离子水的染色缸中，让盖玻片垂直并自然滑落；取出 片夹，迅速放入另一个盛有0.1％SSC洗脱液I的染色缸中，置摇床上于室温缓 慢摇晃20分钟；取出片夹，再重复洗涤一次后取出玻片甩干，并用气罐轻轻吹 干表面直至玻片完全干燥。杂交芯片检测分析采用Generation III array scanner扫描仪扫描芯片，Imagequant 5.0扫描图像显示软件与Array Vision 6.0扫描图像分析软件将图像转化为基于荧光强度的数字信号，对数据进行合 并，用MIDAS芯片数据分析软件对数据进行分析和有效筛选，并以如下条件作为 判断阳性的标准：以阴性对照点的杂交信号数值为参照，只有杂交信号大于所有 空白对照点的平均信号强度加上3倍标准差的基因点数据才被认为是有效数据。
设计高特异性和高灵敏度的杂交探针是制备高质量基因芯片的关键，本发明 选取已知基因的保守域为设计目标，用Array Designer 2.0生物学软件的批量 BLAST功能对设计出的探针进行相互间同源性比较和筛选，避免探针相互之间的 交叉同源性，保证杂交信号的准确性和忠实性，大大减少非特异性杂交；同时对 探针的长度、Tm、GC含量、自身二聚体、发夹结构的自由能等进行了限制，保 证在相同的杂交和洗片条件下得到较好、较忠实的杂交效果；同时，限制探针内 部的发夹结构长度不超过6bp，保证探针内部不会形成稳定的二级结构而影响杂 交的效率和检测的准确度。
人工合成oligo探针简单直接，所构建的微阵列具有更好的特异性和较均一 的Tm值等优点，可提高芯片杂交时的稳定性和可重复性；本发明采用人工合成 长度为50bp的oligo探针来构建微阵列，作为高特异性探针来筛选家蝇抗菌肽 相关基因。
mRNA质量对芯片进行杂交的结果至关重要，其质量要求包括：①完整性，本 发明采用新鲜的三龄幼虫脂肪体作提取物，器具均经去RNA酶处理，研磨时加入 液氮和TRIZOL试剂进行充分裂解，直至完全匀浆，并尽量减少RNA的降解。② 纯净性，采用氯仿多次抽提，乙醇洗涤，尽可能将蛋白质去除干净；本申请中采 用纯化柱对总RNA进行纯化，以去除5sRNA、rRNA及基因组DNA的影响。同时， 昆虫抗菌肽的产生是其在外界环境、生物因素等作用下进行免疫反应的生物效 应，通常在免疫后的一段时间内抗菌蛋白的表达大大增加，因此在提取RNA之前 对其进行了诱导，使其体内有丰富的抗菌肽mRNA产生，以确保杂交时模板的丰 度。
为了保证杂交的可靠性和消除实验中的非特异性杂交信号，本发明连续采用 两次重复实验，结果所有阳性对照信号清晰，阴性对照和空白对照为阴性，说明 整个实验的质量得到了较好的控制，忠实性较可靠。
本发明的有益效果是：
(1)提供了一种全新的家蝇抗菌肽基因序列，填补了本领域空白，为进一 步通过基因工程生产家蝇抗菌肽提供了新的基因源，将给社会带来一定的经济效 益和社会效益。
(2)提供了完整的家蝇抗菌肽基因芯片技术筛选方法和克隆方法，简单易 行，具有快捷、低成本等优点，可适合对其它物种进行新基因克隆。
(3)为家蝇抗菌肽的开发与应用打下了基础，并提供了有力的技术支持。
附图说明
图1从诱导24小时后的家蝇三龄期幼虫脂肪体中提取到总RNA电泳图
图2基因芯片杂交后扫描结果
图3家蝇新抗菌肽基因cDNA序列的拼接过程示意图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1基因芯片探针设计
1材料与方法
1.1材料NCBI开发的免费生物信息学检索软件、生物学探针设计软件 Array Designer 2.0、GenBank数据库中部分昆虫抗菌肽基因序列，其序列号分 别为：M55432、AF368906、AY431779、NM079063、X15851、AMU15956、L34403、 L76300、AB104817、AB191477、AB128064、AB128065、AF442147、AY423049、NM 001011617、AF233589、AY533675、S79612、AB006915、AB100428、AY232301、 AY611631、AY847955、AB014092、U30289、D49415、D49929、AB094343、NM079848、 AF322252、AF334181、AI297596、AF334182、NM079020、NM079177、NM139546、 AY333924、AY338359、AY351398、AY351402、NM168020、AB059626、AY351397、 AJ544540、AY433717、AY440356、AY189807、AY432799、AF466602、AY388563、 X91060、NM079028、NM001011616、AY333923、NM001011638、NM001011642、 AF442148、NM001011613、X72576、AB190866、AF233590、AY232303、AB190363、 AB190864、AM293324、DQ666495、AM293319、AB011246、AB182995、AY515322、 AB220992、AF453868、AY529704、AY232302、M23661、AY130768、E01229、M18873、 M25612、L76300、J04053、S80571、AB021307、AF487907、NM001011607、X02007、 D13744、AY431999、AY642897、AY642908、D17670、U21482、AB117641、AY945211、 AF453824、AY238440、AY829857、AF054616、D13797、AF467987、AY221108、 AY223516、AB081620、X75595、AY278991、NM001011582、AB076385、AY945212、 AF005384、AB186416、DQ180321、AY440486、AJ237664、DQ323126、DQ308606、 DQ308607、DQ308608、DQ308609、DQ311192、DQ377066、CK594686、CK594687、 AY440570、AY693973、DQ007317、NM057481
1.2方法从GenBank数据库获取目的全长序列，分析其基因组成。
用NCBI中相关服务器对各基因的全长进行分析，找出其编码区，分析出各 自的保守序列，以此作为设计oligo探针的备选序列；用Array Designer 2.0 生物学软件对所选序列设计特异性oligo探针。为减少非特异性杂交，保证芯片 杂交的敏感度和精确度，探针设计遵循以下原则：①探针的Tm值接近一恒定值， 波动幅度为5℃；②每一探针内部重复碱基数连续不超过5个以上；③G+C含量 为40～60％；④探针分子内部互补碱基数少于6bp；⑤每条探针均经BLAST比较， 探针相互间序列的相似性小于40％。
1.3以M55432为例来进行探针设计
1.3.1序列的获得与分析
按登陆号(M55432)在GenBank数据库中获取该基因序列，用NCBI中相关 服务器对序列进行分析，发现该基因mRNA全长466bp，其中25～345位为其编 码区，共编码106个氨基酸，25～93为信号肽区，94～342为成熟肽区；用其中 CDD软件进一步分析其保守序列，作为设计oligo探针的备选序列。
1.3.2 oligo探针的设计
根据上述oligo探针的设计原则，用Array Designer 2.0生物学软件对分 析出的被选序列进行探针设计。所设探针结果如表1：
表1
Length GC％ Tm Hairpin dG Hairpin Bond Dimer dG Dimer Bond Run/Repeat Length 50 50 74.8 -1.7 3 -2.9 4 3 Probe Sequence CAACTCAGAACCGAGCTGGAAAGTGGGAAGCACCTACACCTACAGATTTC
1.3.3将探针进行BLAST分析
对该探针用NCBI中BLAST软件进行BLASTn比较，部分结果如表2：
Sequences producing significant alignments Score(bits) E(Value) AY071667.1 Drosophila melanogaster RH02253 full length cDNA 99.6 6e-19 AF019033.1 Drosophila melanogaster Z22 diptericin(Dipt)gene，complete cds 99.6 6e-19 AF019032.1 Drosophila melanogaster Z18 diptericin(Dipt)gene，complete cds 99.6 6e-19 Z11728.1 D.melanogaster gene for 99.6 6e-19
prediptericin AF019023.1 Drosophi la melanogaster B137 diptericin(Dipt)gene，complete cds 99.6 2e-16 AF019035.1 Drosophi la mauritiana M31 diptericin(Dipt)gene，complete cds 91.7 2e-16 AF532001.1 Drosophila yakuba Dpt mRNA， partial cds 63.9 3e-08 AY786316.1 Gallus gallus adiponectin gene， complete cds 36.2 7.7
从比较结果可看出：除备选序列外，与探针高度同源的基因序列均未被选入。 据此，在以后的比较结果中，若所设探针与所选基因序列，所设本探针序列除外， 相互之间存在高度同源性，该基因序列将被剔除，这样可避免探针与非目的基因 相互之间的交叉同源性杂交。
2结果
根据此olligo探针的设计原则，在GenBank数据库中获取部分昆虫抗菌肽基 因序列，用NCBI中相关软件分析出各自的保守序列，用Array Designer 2.0 生物学软件共设计出长度为50bp、Tm为70-75℃、GC含量为40-60％的oligo 探针372条。为下一步构建oligo探针微阵列对家蝇抗菌肽相关基因进行筛选打 下了基础。
研究表明长度为50～70bp的oligo探针足以代表一个基因，且其灵敏度和 特异性两方面都最佳。本发明中，我们对探针的长度、Tm、GC含量等进行了限 制，选择Tm值接近、长度均为50bp的寡核苷酸作为筛选探针。探针的Tm值介 于70-75℃，GC含量介于45-54％，这样在芯片杂交时可保证在相同的杂交和洗 片条件下得到较好、较忠实的杂交效果。限制探针内部的发夹结构长度不超过 5bp，以保证探针内部不会形成稳定的二级结构而影响杂交的效率和检测的准确 度。
实施例2基因芯片筛选家蝇抗菌肽相关基因
一、材料
1.样本与菌种来源家蝇(广东株)由广东省疾病预防控制中心提供，大肠 杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本实验室保存。
2.主要试剂、设备及分析软件RNeasy mini kit、PCR Purification kit (QIAGEN，Inc.)，CyScribe cDNA labeling kit(Amersham Pharmacia Biotech， Ltd)，其他常用化学试剂为分析纯；寡核苷酸探针序列由上海生工生物工程技 术服务有限公司合成，基因芯片系深圳微芯生物科技有限责任公司生产，台式微 型离心机、5810R冷冻桌面离心机Eppendorf，Ltd，芯片点样仪III、芯片扫 描仪III Amersham Pharmacia Biotech，Ltd，恒温杂交箱Shellab，Ltd，电 泳设备Bio-Rad，Ltd，DU520紫外分光光度计Beckman Coulter，Ltd，凝胶成 像仪Vilber，Ltd，紫外交联仪Viber Lourmat，France，扫描图像显示软件 Amersham Pharmacia Biotech，Ltd、图像分析用软件Imaging Research，Ltd.、 数据分析软件Chipscreen Biosciences，Ltd.，NCBI开发的免费生物信息学软 件及基因芯片探针设计软件Array Designer 2.0，GenBank数据库。
二、方法
1.探针设计及微阵列的构建
在GenBank数据库中获取昆虫抗菌肽基因序列，其序列号分别为：AMU15956、 L34403、L76300、AB104817、AB191477、AB128064、AB128065、AF442147、AY423049、 NM001011617、AF233589、AY533675、S79612、AB006915、AB100428、AY232301、 AY611631、AY847955、AB014092、U30289、D49415、D49929、AB094343、NM079848、 AF322252、AF334181、AI297596、AF368906、AY431779、M55432、NM079063、X15851、 AF334182、NM079020、NM079177、NM139546、AY333924、AY338359、AY351398、 AY351402、NM168020、AB059626、AY351397、AJ544540、AY433717、AY440356、 AY189807、AY432799、AF466602、AY388563、X91060、NM079028、NM001011616、 AY333923、NM001011638、NM001011642、AF442148、NM001011613、X72576、 AB190866、AF233590、AY232303、AB190363、AB190864、AM293324、DQ666495、 AM293319、AB011246、AB182995、AY515322、AB220992、AF453868、AY529704、 AY232302、M23661、AY130768、E01229、M18873、M25612、L76300、J04053、S80571、 AB021307、AF487907、NM001011607、X02007、D13744、AY431999、AY642897、 AY642908、D17670、U21482、AB117641、AY945211、AF453824、AY238440、AY829857、 AF054616、D13797、AF467987、AY221108、AY223516、AB081620、X75595、AY278991、 NM001011582、AB076385、AY945212、AF005384、AB186416、DQ180321、AY440486、 AJ237664、DQ323126、DQ308606、DQ308607、DQ308608、DQ308609、DQ311192、 DQ377066、CK594686、CK594687、AY440570、AY693973、DQ007317、NM057481
用http://www.ncbi.nlm.nih.gov上相关服务器分析出编码区和保守结构 域，用Array Designer 2.0生物学软件据其保守结构域设计特异性oligo探针， 并遵循以下原则：①探针的Tm值接近一恒定值，上下波动5℃；②每个探针重 复碱基连续不超过6个；③G+C含量为40％～60％；④探针分子内部互补碱基少 于6bp；⑤经BLAST比较，探针相互间序列的相似性小于40％，据此设计长50bp、 Tm值为65～70℃的高度特异性探针372条，部分探针序列如下：
1、tctacgataagaatggaatgacaggagacgcctatggtggactaaacatt
2、gcaggattcgagtttgggaaagaatataagaatggtttcatcaaaggaca
3、ttgtggttaagcggagtttaggtggtgtgatttcaggagcaaagaaagtt
4、caacaggcagaagatttggtagagggagtacaccttgaagagactttgta
5、ctgcaatcaaatatgttttccgagacttggaagctgttactacaacacat
6、aattgtcagattgttatttaccgctggaaaccaacccttattgcaacgag
7、cgtatcactggaacaacgcactcatggactgtgaaagagctatctaccat
8、taattggtttagtatcaaaaggaacgtgtgtacttgtaaagacagtgtgc
9、caacgtgtaaagtgatctcgaagggtgcgtcaatgtgcaaagtactattc
10、atgcagttggtgaggccgatcccttcgatataacaaaactcaatataaaa
同时以家蝇管家基因GAPDH(序列号：DQ133074)、Hex-L，序列号：AF502983， 片段及其一个抗菌肽基因Cecropin，序列号：EF175878，作为阳性对照，以植 物拟南芥基因组，序列号：AM236861，中一个基因片段作为阴性对照(对照探针 也同样遵循上述原则)，以磷酸盐缓冲液为空白对照。探针分别溶解于PH8.0磷 酸盐缓冲液中，用芯片点样仪III有序地点印在购回的预制好的芯片上，每一探 针重复点样三次，每一芯片设计12个独立的小矩阵，每个小矩阵由4行16列组 成；打印好的芯片经紫外交联等处理后放暗盒中保存备用。
2.诱导方法
取家蝇三龄期幼虫，用昆虫针蘸取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液，金 黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液混合比例采用1∶1的比例。从腹部进行刺针， 再放回饲养24小时后收集作为提取总RNA的材料。
3.总RNA的提取及质量鉴定
随机取上述诱导后的三龄期幼虫适量(约100mg)，用DEPC处理水清洗后滤 干，解剖出脂肪体组织，置于经去RNA酶处理后的研磨器中，加入适量液氮、 TRIZOL溶液充分研磨，按照QIAGEN公司提供的RNAeasy Mini Kit操作说明抽 提和纯化其总RNA，用分光光度法检测其量和纯度、1.1％甲醛变性琼脂糖凝胶 电泳检测其完整性。
4.逆转录PCR及cDNA荧光标记
取总RNA20ug，Oligo(dT)18primer 1ul，加Nuclease-free water至10ul， 70℃变性5分钟，冰上冷却5分钟后再加入5×Buffer 4ul、0.1M DTT 2ul、dNTP mix 1ul、dye-dCTP 1ul、Ribonuclease Inhibitor 1ul、RT 1ul，42℃反应2 小时后用0.5M NaOH调pH值为中性，再按QIAquick PCR Purification Kit操 作说明对产物进行纯化。
5.预杂交
将200～250毫升预杂交缓冲液倒入杂交缸中，预杂交缓冲液的组成成份为 4XSSC+0.1％SDS+1％BSA(牛血清白蛋白)，配方为常规的标准配方。液面高度与杂 交芯片同高，小心取出芯片放杂交缸中，置摇床上于室温缓慢摇晃20～30分钟 后取出甩干，并用气罐轻轻吹干表面至整个玻片完全干燥。
6.杂交
将纯化、标记好的cDNA抽干，加入4×杂交缓冲液、甲酰胺各7.5μl，加 灭菌水至总体积30μl，混匀后短暂离心，95℃水浴5分钟，立即冰上放置1 分钟，振荡混匀后短暂离心，将之铺在预杂交过的芯片阵列上，轻轻盖上盖玻片， 放入杂交盒内，于37℃下杂交16小时。
7.洗片
取出玻片放于片夹上，将放入盛有去离子水的染色缸中，让盖玻片垂直并自 然滑落；取出片夹，迅速放入另一个盛有200～250毫升洗脱液I(0.1％SSC)的 染色缸中，置摇床上于室温缓慢摇晃20分钟；取出片夹，再重复洗涤一次后取 出玻片甩干，并用气罐轻轻吹干表面直至玻片完全干燥。
8.杂交芯片检测分析
用Generation III array scanner扫描仪扫描芯片，用Imagequant 5.0扫 描图像显示软件与Array Vision 6.0扫描图像分析软件将图像转化为基于荧光 强度的数字信号，对数据进行合并，用MIDAS芯片数据分析软件对数据进行分析 和有效筛选，并以如下条件作为判断阳性的标准：以阴性对照点的杂交信号数值 为参照，只有杂交信号大于所有空白对照点的平均信号强度加上3倍标准差的基 因点数据才被认为是有效数据。
实验结果
一、总RNA的提取
从诱导24小时后的家蝇三龄期幼虫脂肪体中提取到总RNA258ug，RNA浓度 为12.9μg/μl，吸光度A260/A280为1.97，说明总RNA的量和纯度较高；电泳 显示28s和18s条带均清晰，说明所提取的总RNA完整性较好，适于作基因芯片 检测，电泳图见图1。
二、基因芯片杂交与结果分析
用逆转录PCR标记技术对诱导后家蝇三龄幼虫脂肪体总RNA反转录成cDNA 并进行Cy3荧光素标记，与所构建的oligo探针微阵列杂交，经扫描仪扫描，所 有阳性对照信号清晰，阴性对照和空白对照为阴性，说明实验无污染且检测体系 正常，从而证实了实验的可靠性，结果见图2；杂交结果经MIDAS等软件进一步 分析和统计学处理，对杂交信号的可靠性进行有效的分步筛选，在两次重复实验 中均检测到有效杂交信号的基因点有15个，不包括阳性对照基因，其中一个有 效杂交信号点所对应的基因，登录号：J04053，在家蝇抗菌肽基因中已有相关报 道，其编码区氨基酸序列与家蝇Defensin，登录号：EF175879相同，其余有效 杂交信号点所对应的基因在家蝇中尚未发现相关研究。
实施例3经基因芯片筛选出的一个家蝇新抗菌肽基因的克隆分析
本实施例按以下步骤实施：
(1)采用基因芯片技术筛选出家蝇相关基因；
(2)设计简并引物，获取同源片断；
(3)行RT-PCR扩增出基因片段；
(4)以全长文库做模板，结合文库通用引物行特异性PCR扩增出该抗菌肽 基因的全长序列。
步骤(1)同实施例1，这里不再赘述。其他步骤具体实施如下
一、同源片断的获取
1.简并PCR引物的设计
在前述经基因芯片筛选到的家蝇抗菌肽相关基因中，选取其中一个阳性杂交 信号点所对应的昆虫抗菌肽基因Diptericin，在GenBank数据库中获取到刺舌 蝇(Glossina morsitans morsitans)，登陆号：AF368906，黑腹果蝇(Drosphila melanogaster)，登陆号：M55432，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，登陆 号：NM_079063，新陆原伏蝇(Protophormia terraenovae)，登陆号：X15851， 等昆虫抗菌肽Diptericin基因的氨基酸序列，查找出各自的保守氨基酸序列并 进行排序，根据所标出的保守氨基酸序列，如序列中黑体字部分所示，同时参考 家蝇对密码子的偏好性，用生物学软件primer premier 5.0和Oligo6设计了 一对简并引物A1与A2。
刺舌蝇(AF368906)
GGGSPKDGYNVNVDVRKNVWVSQNGRHSIDATGGYSQHLGGPYGNSRP
黑腹果蝇(NM079063)
GGGSPKQGFDLSLNGRAPVWQSPNGRHSFDATGSYAQHLGGPYGNSRP
新陆原伏蝇(X15851)
GGGNRKDGFGVSVDAHQKVWTSDNGRHSIGVTPGYSQHLGGPYGNSRP
黑腹果蝇(M55432)
GGGQSGDGFGFAVQGHQKVWTSDNGRHEIGLNGGYGQHLGGPYGNSEP
上游简并引物A1：5′-GHGGHWSBCCHAARGATGG-3′19bp degeneracy：648
下游简并引物A2：5′-RTTDCCRTADGGDCCDCC-3′ 18bp degeneracy：64
其中：H：A/C/T；W：A/T；S：C/G；B：C/G/T；R：A/G；D：A/G/T；
2.cDNA第一链合成
在一放置于冰上预冷的灭菌0.5mlEP管中加入：
总RNA 3(μl)
Oligo(dT)Primer15 1(μl)
DEPC水 7(μl)
混匀，稍离心，72℃水浴变性5分钟，立即冰上冷却2分钟，稍离心，再向 反应管中加入如下成分：
5×First-Strand Buffer 4(μl)
DTT(0.1M) 2(μl)
dNTP Mix(10mM) 1(μl)
Rnasin(50U/ul) 1(μl)
Rtase M-MLV(200U/ul) 1(μl)
混匀，稍离心，42℃水浴反应1小时后立即冰浴5分钟，终止合成反应，至 此，cDNA第一链合成已完成。如不立即使用，可将第一链合成物于-20℃保存。
3.PCR扩增反应
①PCR体系构建：(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+15mM) 2.5(μl)
dNTPs(2.5mM) 2(μl)
A1(25uM) 1(μl)
A2(25uM) 1(μl)
cDNA模板 2.5(μl)
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25(μl)
用灭菌去离子水补足至25μl
②用手指轻弹管底，使反应液充分混匀，稍离心。
③将反应管放进预热至95℃的PCR仪，按如下参数进行PCR反应：
95℃预变性2分钟，95℃变性1分钟，46℃退火3分钟，72℃延伸1分钟， 进行5个循环；95℃变性1分钟，49℃退火2分钟，72℃延伸1分钟，进行10 个循环；95℃变性1分钟，52℃退火90秒，72℃延伸1分钟，进行20个循环， 再72℃延伸10分钟，终止反应。
④PCR产物检测
取25μl PCR产物和6μl的600bpDNA Marker，用2.0％琼脂糖凝胶电泳 检测扩增效果。
4.目的基因片段的回收和T-A克隆
①PCR产物的回收与纯化
采用安徽优晶生物工程有限公司的H.Q凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯 化，具体操作如下：
PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开， 然后在紫外灯下用干净的手术刀片将目的DNA从琼脂糖凝胶上切下，置于 1.5ml EP管中，每100mg琼脂糖凝胶约加入400μl的Binding Buffer置于 65℃水浴中10min，至胶完全溶化。注：在判定DNA片段的位置和切胶时，紫 外光照射的时间尽可能短，以防DNA受到损伤。
B.将吸附柱套入2ml收集管中，将溶化的胶溶液转移到吸附柱中，室温 放置2min，10000g室温离心1min；
C.弃废液，加入750μl Washing Solution，室温放置2min，10000g 室温离心1min；
D.再重复步骤③一次；
E.取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱放入同一个收集管中， 10000g，室温离心1min；
F.将吸附柱放入一个干净的1.5ml Ep管中，在吸附膜中央加30μl65 ℃预热的灭菌去离子水，室温放置2min后10000g室温离心1min；
G.离心管中的液体即为纯化了的DNA，可立即使用或-20℃保存备用；
②感受态细胞的制备
A.从-80℃冻存管中取出少量E.coli DH5α(约2ul)甘油菌于2ml LB培 养基中，37℃240g振摇过夜；
B.用接种环蘸取少许DH5a菌液，于LB固体平板上划线，37℃孵箱倒置培 养过夜；
C.挑取一单菌落接种于3ml LB液体培养基中，于37℃240g振摇培养过夜；
D.取0.2ml过夜培养菌液接种于20ml新鲜LB培养基中，37℃，240g振 摇培养2～3小时，待OD600值达0.3～0.4时冰浴30分钟；
E.将上述菌液分装到经灭菌处理过的1.5mlEP管中，4000g 4℃离心10 分钟；
F.弃培养基，将EP管倒置于滤纸上吸干最后的残留液体，加入400μl100 mmol/L冰预冷的CaCl2溶液(5∶1)，轻轻吹匀，使菌液完全悬浮，再冰浴30min；
G.于4000×g，4℃离心10分钟，弃培养基，再加200ul冰预冷的0.1mol/L 的CaCL2，轻轻重悬菌体，于4℃冰箱放置12～16小时即可使用，如不立即使 用，加甘油至15％的浓度，冻存于-80℃备用。
③连接反应
将上述纯化回收目的DNA片段与PMD20-T载体进行连接反应，具体操作如下：
PCR纯化产物4μl，PMD20-Tvector 1μl，Solution I 5μl， 使反应液充分混匀后稍离心，置16℃反应30min。
④连接产物的转化
A.预先制备LB/IPTG/X-gal/AMP培养基平板(蓝白斑筛选培养基平板)和LB 固体培养基琼脂平板；无菌条件下取20μl连接产物加入到200ul DH5a感受态 细胞中，轻轻吹匀，同时以不含连接产物的DH5α感受态细胞作为阴性对照，以 载体所配备的control Insert基因片段作阳性对照，冰浴30min，42℃热激 45s，立即冰浴1min后迅速加入LB培养液0.8ml，于37℃240×g空气振摇 1h；分别吸取200μl的转化菌液、阴、阳性对照菌液涂布于LB/IPTG/X-gal/AMP 琼脂平板上，放37℃培养箱正置1h左右后倒置培养12～16h至单菌落形成。
⑤重组体的鉴定
A.双酶切法鉴定
a.重组质粒的微量制备
从各重组子转化的平板中分别挑取12个单菌落接种于3ml含Amp(50μg/ml) 的LB液体培养基中，37℃260rmp振摇培养12～16小时(过夜)，次日按照安徽 优晶生物工程有限公司的质粒微量提取试剂盒的说明进行，所提取质粒用0.8％ 琼脂糖凝胶电泳进行检测，具体操作过程如下：
(1)将振摇培养过夜的菌液分装至1.5mlEP管中，于室温下10000×g离 心1min以沉淀菌种，去培养基，往沉淀中加入250ul的ZL-I/RnaseA混合液， 漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；
(2)往重悬混合液中加入250ul的ZL-II液，轻轻翻转试管4-6次混合溶 液，以获得一澄清裂解液(注：避免剧烈混合裂解液，以防染色体DNA断裂而使 得到的质粒纯度降低)；往上述混合液中加入350ul的ZL-III缓冲液，并温和地 上下颠倒EP管数次，直至形成白色絮状沉淀，于室温下10000×g离心10min；
(3)取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱装在一个2ml收集管上备用。小心 吸取上清并将其转置于柱子内，确保转置柱内内的上清没有细胞杂质沉淀，于室 温下10000×g离心1min，使裂解液完全流过柱子；
(4)弃去离心甩出液，加入500ul的ZL缓冲液到柱子上，于室温下10000 ×g离心1min洗涤柱子，确保除出残余的蛋白质已得到高质量的DNA；
(5)弃去离心甩出液，加入720ul用乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子， 于室温下10000×g离心1min，弃去甩出液；
(6)重复步骤6一次；
(7)于室温下10000×g离心空柱1min以甩干柱子基质；
(8)把柱子置于一干净的1.5ml的lEP管中，直接加入50～100ul的灭菌 去离子水到柱子基质上，于室温下10000×g离心1min以洗脱出DNA；
(9)甩出液即为所提取质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，对所提取的质粒 进行检测。
b.重组质粒的双酶切
使用限制性内切酶Hind III和EcoR I对重组质粒进行双酶切鉴定，双酶切体 系(20μl)如下：
10×M Buffer 2.0μl
Hind III内切酶(15U/μl) 1.0μl
EcoR I内切酶(15U/μl) 1.0μl
重组质粒DNA 16μl
使反应液充分混匀后稍离心，37℃水浴反应1小时，2.0％琼脂糖凝胶电泳 检测。
B.PCR法鉴定
以含目的基因Diptericin片断的PMD20-Diptericin重组质粒20倍稀释液 为模板，在0.2ml的PCR小管中加入以下成分，同时设置空白对照。PCR扩增 反应体系如下：
PCR体系构建：(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+15mM) 2.5(μl)
dNTPs(2.5mM) 2(μl)
载体通用上游引物(20uM) 1(μl)
载体通用下游引物(20uM) 1(μl)
稀释后的重组质粒模板 1(μl)
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25(μl)
用灭菌去离子水补足至 25μl
使反应液充分混匀，稍离心，将反应管放进预热至94℃的PCR仪，按如下 参数进行PCR反应：
94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共 进行32个循环，再72℃延伸10分钟，4终止反应。产物以1.8％的琼脂糖凝胶 电泳检测。
5.同源片段的序列测定及分析
(1)将含目的基因片段的T-A克隆阳性重组子甘油菌委托上海博亚生物技 术有限公司进行测序测定；获得131bpcDNA序列。
(2)登陆NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用Blastn程序 对基因片段序列进行同源性分析。
二.目的基因cDNA的3′端克隆
结合家蝇幼虫脂肪体全长cDNA文库载体上的下游引物，从上述克隆到的同 源片断中设计一条特异性上游引物，以cDNA文库为模板，PCR扩增目的基因cDNA 序列的3′端，经T-A克隆、重组子鉴定后挑取含目的基因片段的阳性重组子甘 油菌委托上海博亚生物技术有限公司进行测序测定
PCR特异性引物设计
根据cDNA文库载体λTripEX×2上的下游引物p2，从所克隆到的同源片段 中设计出一条特异性上游引物B1，组成一对特异性PCR引物用于扩增目的基因 cDNA序列的3′端，引物序列如下：
上游引物B1：5′CAA TGT AAA TGC CGA TGT C 3′(19bp)
下游引物p2：5/TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC 3/(21bp)
家蝇幼虫总RNA提取及其脂肪体全长cDNA文库的构建
文库模板的制备
a从-80℃冻存管中取出少量E.coli XL1-Blue菌液(约5μl)于2mlLB/tet 培养基中，37℃240rmp空气浴振摇过夜；
b超净工作台内用无菌接种环蘸取菌液接种在LB/tet培养板上(不含 MgSO4)，37℃培养过夜；
c用无菌接种环从上述培养板中挑取单菌落接种到LB/MgSO4/tet琼脂平板 上，37℃培养过夜。用封口膜封好放4℃可保存两周，该培养板可用于新克隆接 种；
d每隔两周需准备一个新的工作板，以保证新克隆来源；
e从工作板中挑取单菌落接种到15ml LB/MgSO4/0.2％麦芽糖液体培养基 中，140rpm，37℃空气浴振摇，过夜培养，OD值达到2.0；
f 5000rpm室温离心5分钟，弃上清，加入7.5ml 10mM MgSO4重悬菌体；
g准备10个90-mm LB/MgSO4平板，室温放置(最好为37℃)1小时左右 备用；
h从-80℃冻存管中取出包装好的扩增文库液2μl，用1×λ噬菌体缓冲液 稀释20倍；
i取2μl稀释后的文库液加λ到300μl经MgSO4重悬的E.coli XL1-Blue 中，37℃水浴10～20分钟，让噬菌体充分吸附；
j加入3.0ml冷却至48℃的顶层琼脂，迅速混匀，铺在预先准备好的90-mm LB/MgSO4平板上；
k室温冷却10分钟左右，待上层琼脂凝固后，放37℃培养箱中倒置培养6～ 18小时，过夜；
l将培养皿取出放入4℃冰箱中，冷却30分钟，加入3ml1×λ噬菌体缓冲 液，4℃，50rmp振摇过夜；
m收集裂解液，4℃，7000rmp离心1分钟；
n吸取上清，加入2ml 20％PEG，混匀，室温放置1-2小时；
o室温下，14000rmp离心15分钟，弃上清，加入1ml灭菌去离子水溶 解沉淀；
p煮沸5分钟使噬菌体变性，然后冰浴5分钟，-20℃保存备用。
PCR扩增
PCR体系构建：(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+15mM)2.5(μl)
dNTPs(2.5mM) 2(μl)
B1(20uM) 1(μl)
P2(20uM) 1(μl)
文库模板 5(μl)
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25(μl)
用灭菌去离子水补足至 25μl
将反应液充分混匀，稍离心，将反应管放进预热至95℃的PCR仪，按如下 参数进行PCR反应：
95℃预变性3分钟，95℃变性50秒，50℃退火1分钟，72℃延伸90秒，共 进行35个循环，再72℃延伸10分钟，4℃终止反应。产物以1.8％的琼脂糖凝 胶电泳检测。
PCR产物的回收与纯化
采用安徽优晶生物工程有限公司的H.Q凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯 化，具体操作如下：
PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开， 然后在紫外灯下用干净的手术刀片将目的DNA从琼脂糖凝胶上切下，置于 1.5ml EP管中，每100mg琼脂糖凝胶约加入400μl的Binding Buffer，置 于65℃水浴中10min，至胶完全溶化。注：在判定DNA片段的位置和切胶时， 紫外光照射的时间尽可能短，以防DNA受到损伤。将吸附柱套入2ml收集管中， 将溶化的胶溶液转移到吸附柱中，室温放置2min，10000g室温离心1min； 弃废液，加入750μl Washing Solution，室温放置2min，10000g室温 离心1min；
④再重复步骤③一次；
⑤取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱放入同一个收集管中， 10000g，室温离心1min；
⑥将吸附柱放入一个干净的1.5ml Ep管中，在吸附膜中央加30μl 65 ℃预热的灭菌去离子水，室温放置2min后10000g室温离心1min，Ep管 中所得液体即为纯化了的DNA。
6.连接反应及连接产物的转化
将上述纯化回收的目的DNA片段与PMD20-T载体进行连接反应，操作步骤按 说明书进行，具体操作如下：
①连接反应，反应体系如下：
PCR纯化产物 4μl
PMD20-Tvector 1μl
Solution I 5μl
使反应液充分混匀后稍离心，置16℃反应30min。
②连接产物的转化
A.预先铺制LB/IPTG/X-gal/AMP培养基平板(蓝白斑筛选培养基平板)和LB 固体培养基琼脂平板；
B.无菌条件下取20μl连接产物加入到200ul DH 5a感受态细胞中，轻轻 吹匀，同时以不含连接产物的DH5a感受态细胞作为阴性对照，以载体所配备的 control Insert基因片段作阳性对照，冰浴30min，42℃热激45s，立即冰浴 1min后迅速加入LB培养液0.8ml，于37℃240×g空气振摇1h；
C.分别吸取200μl的转化菌液、阴、阳性对照菌液涂布于 LB/IPTG/X-gal/AMP琼脂平板上，放37℃培养箱正置1h左右后倒置培养12～16 h至单菌落形成。
7.重组体的鉴定
①双酶切法鉴定
A.重组质粒的微量制备
从各重组子转化的平板中分别挑取12个单菌落接种于3ml含Amp(50μg/ml) 的LB液体培养基中，37℃260rmp振摇培养过夜，次日按照安徽优晶生物工程 有限公司的质粒微量提取试剂盒的说明进行，所提取质粒用0.8％琼脂糖凝胶电 泳进行检测；
B.重组质粒的双酶切
使用限制性内切酶Hind III和EcoR I对重组质粒进行双酶切鉴定，双酶切体 系(20μl)如下：
10×M Buffer 2.0μl
Hind III内切酶(15U/μl) 1.0μl
EcoR I内切酶(15U/μl) 1.0μl
重组质粒DNA 14μl
灭菌去离子水 2μl
使反应液充分混匀后稍离心，37℃2水浴反应1小时，1.8％琼脂糖凝胶电泳 检测。
PCR法鉴定
将含目的基因片断的PMD20-T重组质粒作20倍稀释，以稀释液为模板，在 0.2ml的PCR小管中加入以下成分，同时设置空白对照。PCR扩增反应体系如下：
PCR体系构建：(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+15mM) 2.5(μl)
dNTPs(2.5mM) 2(μl)
载体上游引物(20uM) 1(μl)
载体下游引物(20uM) 1(μl)
稀释后的重组质粒模板 1(μl)
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25(μl)
用灭菌去离子水补足至 25μl
使反应液充分混匀，稍离心，将反应管放进预热至94℃的PCR仪，按如下 参数进行PCR反应：
94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共 进行32个循环，再72℃延伸10分钟，4终止反应。产物以1.8％的琼脂糖凝胶 电泳检测。
8.序列测定
将鉴定后的含目的基因片段的阳性重组子甘油菌委托上海博亚生物技术有 限公司进行测序测定。获得366bpcDNA序列。
三、目的基因cDNA 5′端克隆
结合家蝇幼虫脂肪体全长cDNA文库载体上的上游引物，从上述克隆到的3 ′端cDNA序列中设计一条特异性下游引物，以cDNA文库为模板，PCR扩增目 的基因cDNA序列的5′端，经T-A克隆、重组子鉴定后挑取含目的基因片段的 阳性重组子甘油菌委托上海博亚生物技术有限公司进行测序测定。
1.PCR特异性引物设计
根据文库载体λTripEX×2上的上游引物P1，从克隆到的3′cDNA序列中设 计出一条特异性下游引物B2，组成一对特异性PCR引物用于扩增目的基因的5 ′端，引物序列如下：
上游引物P1：5/ CTC CGA GAT CTG GAC GAG C 3/(19bp)
下游引物B2：5′TTA CAT TGC CTT AAA AAT CAC CT 3′(23bp)
2.PCR扩增
PCR体系构建：(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+15mM) 2.5(μl)
dNTPs(2.5mM) 2(μl)
P1(20uM) 1(μl)
B2(20uM) 1(μl)
文库模板 5(μl)
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25(μl)
用灭菌去离子水补足至 25μl
将反应液充分混匀，稍离心，将反应管放进预热至95℃的PCR仪，按如下 参数进行PCR反应：
94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸3分钟， 共进行35个循环，再72℃延伸10分钟，4℃终止反应。产物以1.8％的琼脂糖 凝胶电泳检测。
3.PCR产物的回收与纯化
采用安徽优晶生物工程有限公司的H.Q凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯 化，方法同前。
4.连接反应及连接产物的转化
将上述纯化回收的目的DNA片段与PMD20-T载体进行连接反应，操作过程按 说明书进行，具体操作如下：
①连接反应，反应体系如下：
PCR纯化产物 4μl
PMD20-Tvector 1μl
Solution I 5μl
使反应液充分混匀后稍离心，置16℃反应30min。
②连接产物的转化
A.预制LB/IPTG/X-gal/AMP培养基平板(蓝白斑筛选培养基平板)和LB琼脂 平板；
B.无菌条件下取20μl连接产物加入到200ul DH 5a感受态细胞中，轻轻 吹匀，同时以不含连接产物的DH5a感受态细胞作为阴性对照，以载体所配备的 control Insert基因片段作阳性对照，冰浴30min，42℃热激45s，立即冰浴 1min后迅速加入LB培养液0.8ml，于37℃240×g空气振摇1h；
C.分别吸取200μl的转化菌液、阴、阳性对照菌液涂布于 LB/IPTG/X-gal/AMP琼脂平板上，放37℃培养箱正置1h左右后倒置培养12～16 h至单菌落形成。
5.重组体的鉴定
①双酶切法鉴定
A.重组质粒的微量制备
从各重组子转化的平板中分别挑取12个单菌落接种于3ml含Amp(50μg/ml) 的LB液体培养基中，37℃260rmp振摇培养过夜，次日按照安徽优晶生物工程 有限公司的质粒微量提取试剂盒的说明进行，所提取质粒用0.8％琼脂糖凝胶电 泳进行检测；
B.重组质粒的双酶切
使用限制性内切酶Hind III和EcoRI对重组质粒进行双酶切鉴定，双酶切体 系(20μl)如下：
10×M Buffer 2.0μl
Hind III内切酶(15U/μl) 1.0μl
EcoR I内切酶(15U/μl) 1.0μl
重组质粒DNA 14μl
灭菌去离子水 2μl
使反应液充分混匀后稍离心，37℃水浴反应1小时，1.8％琼脂糖凝胶电泳 检测。
PCR法鉴定
将含目的基因片断的PMD20-T重组质粒作20倍稀释，以稀释液为模板，在 0.2ml的PCR小管中加入以下成分，同时设置空白对照。PCR扩增反应体系如下：
PCR体系构建：(25μl体系)
10×PCR Buffer(Mg2+15mM) 2.5(μl)
dNTPs(2.5mM) 2(μl)
载体上游引物(20uM) 1(μl)
载体下游引物(20uM) 1(μl)
稀释后的重组质粒模板 1(μl)
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25(μl)
用灭菌去离子水补足至 25μl
使反应液充分混匀，稍离心，将反应管放进预热至94℃的PCR仪，按如下 参数进行PCR反应：
94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共 进行32个循环，再72℃延伸10分钟，4终止反应。产物以1.8％的琼脂糖凝胶 电泳检测。
序列测定
将鉴定后的含目的基因片段的阳性重组子甘油菌委托上海博亚生物技术有 限公司进行测序测定。获得457bpcDNA序列。
四、家蝇新抗菌肽基因cDNA序列的拼接
将克隆到的3′端与5′端cDNA片段进行拼接，去除文库载体上的固有序列 和两片段的重叠区，拼接到一460bp的家蝇新抗菌肽基因的cDNA序列，见序列 表1，从57bp～356bp、起始密码子为ATG、终止密码子为TAA、含300bp的区域 编码99个氨基酸，见序列表2。具体拼接过程见图3。
五、基因的应用研究cDNA序列的生物信息学分析
登陆NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用Blastn、CDD等相 关程序对cDNA序列进行初步的生物信息学分析。
登陆NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用Blastn程序对该 cDNA序列进行比对，结果显示该序列与双翅目Glossina morsitans morsitans (刺舌蝇)、双翅目Drosophila pseudoobscura(新陆原伏蝇)抗菌肽基因 Diptericin的同源性较高，Score值分别为61.9bits、50.1bits，一致性 (identities)分别为80％、91％；ORF Finder分析，含有4个可能的ORF，其 中最大的ORF位于57bp～356bp，含300bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA， 编码99个氨基酸，保守结构域搜索，结果显示所克隆到的序列属于Attacin家 族。
运用NCBI的Blastp程序对该cDNA序列推导的氨基酸序列进行同源性比 较，结果显示该序列与舌刺蝇Diptericin氨基酸序列同源性为77％、与新陆原 伏蝇Diptericin氨基酸序列同源性为51％、与果蝇Diptericin氨基酸序列同源 性为59％。
SEQUENCE LISTING
<110>广东药学院
<120>家蝇抗菌肽基因及其筛选克隆方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>460
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(57)..(356)
<400>1
cggccgggga cagtttccaa acacatttcg caacagcaac aacttatctc actaaa atg 59
Met
1
aaa tat ctt tgg gcc att gtt ctc ttg tgt gct ctg agt gca gtt ttt 107
Lys Tyr Leu Trp Ala Ile Val Leu Leu Cys Ala Leu Ser Ala Val Phe
5 10 15
gtg gtt gcc gat gat aag tca cag ccg ccc cca cca caa atc aag gac 155
Val Val Ala Asp Asp Lys Ser Gln Pro Pro Pro Pro Gln Ile Lys Asp
20 25 30
ccc caa gtt cgt gtc gat gtg gga ggc tct ccc aag gat ggt tac aat 203
Pro Gln Val Arg Val Asp Val Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Tyr Ash
35 40 45
gta aat gcc gat gtc cgt aaa aat att tgg acc agt gac aat ggc aga 251
Val Ash Ala Asp Val Arg Lys Ash Ile Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg
50 55 60 65
cat tcg ttt gat gcc act gca ggt tat agc cag cac ttg ggt gga ccc 299
His Ser Phe Asp Ala Thr Ala Gly Tyr Ser Gln His Leu Gly Gly Pro
70 75 80
tat ggc aat agt cgt cct gat tac cgt ggt ggt ggc agt tat acc tac 347
Tyr Gly Asn Ser Arg Pro Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr
85 90 95
aga tgg taa aggtgatttt taaggcaatg taaattgtgt atttttttaa 396
Arg Trp
taataaagaa ataaagatta aaatttaaaa aagaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 456
aaaa 460
<210>2
<211>99
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Lys Tyr Leu Trp Ala Ile Val Leu Leu Cys Ala Leu Ser Ala Val
1 5 10 15
Phe Val Val Ala Asp Asp Lys Ser Gln Pro Pro Pro Pro Gln Ile Lys
20 25 30
Asp Pro Gln Val Arg Val Asp Val Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Tyr
35 40 45
Asn Val Asn Ala Asp Val Arg Lys Asn Ile Trp Thr Ser Asp Asn Gly
50 55 60
Arg His Ser Phe Asp Ala Thr Ala Gly Tyr Ser Gln His Leu Gly Gly
65 70 75 80
Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Ser Tyr Thr
85 90 95
Tyr Arg Trp