一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811269851.0 (22)申请日 2018.10.29 (71)申请人 福建省农业科学院食用菌研究所 （福建省蘑菇菌种研究推广站） 地址 350014 福建省福州市晋安区前横路 95弄10号 (72)发明人 蔡志欣陈美元廖剑华郭仲杰 卢园萍施肖堃王泽生 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.。

2、01) (54)发明名称 一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR 鉴定方法 (57)摘要 本发明属于食用菌分子标记辅助育种领域， 具体涉及一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR- PCR鉴定方法。 该方法利用SSR分子标记对双孢蘑 菇国内主栽品种As2796、 W192、 福蘑38和A15进行 PCR特异扩增， 产生特异性图谱。 本发明的方法不 用冗杂的农艺性状出菇对比试验， 特异性的扩增 图谱能够鉴别区分双孢蘑菇国内的主栽品种， 该 方法耗时短， 操作简便， 特异性强， 该方法可以在 双孢蘑菇菌种生产中快速地鉴别国内的4个双孢 蘑菇主栽品种， 避免了同种异名和同名异种现象 的发生， 提高。

3、了双孢蘑菇的生产效率。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 109207625 A 2019.01.15 CN 109207625 A 1.一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定引物， 其特征在于： 所述引物序列为： Scaf4_1k11F： 5 -CAATCACAATCCCTCCAAGC-3 ， Scaf4_1k11R： 5 -AAACGAATTAGGAACGGTGG-3 。 2.根据权利要求1所述的一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定引物， 其特征 在于： 所述双孢蘑菇4个主栽品种为品种As2796、 W192、 福蘑38和A15。 3.利用权利要。

4、求1所述引物用于区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方法， 其特 征在于： 利用权利要求1中所述的特异引物对Scaf4_1k11F和Scaf4_1k11R对双孢蘑菇主栽 品种As2796、 W192、 福蘑38和A15的基因组DNA进行SSR-PCR扩增， 其特异性地扩增图谱为： As2796扩增出1004bp的产物； W192扩增出801bp的产物； 福蘑38扩增出1004bp 和801bp的产 物； A15扩增出1004bp、 801bp和252bp的产物。 4.根据权利要求3所述的一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方法， 其特征 在于： 所述SSR-PCR扩增的条件。

5、为： 94预变性5min； 94变性30s， 56退火30s， 72延伸 1min， 扩增35个循环； 72延伸10min， 4保存。 5.根据权利要求3所述的一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方法， 其特征 在于： 所述SSR-PCR扩增的反应体系为： 模板DNA 30ng， 引物Scaf4_1k11F 30ng， 引物Scaf4_ 1k11R 30ng， dNTPs 0.1 mmol/L， MgCl2 2.5 mmol/L， Taq DNA聚合酶 1 U， 1PCR缓冲液10 L， 用ddH2O将总体积补至20L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109207625 A 2。

6、 一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方法 技术领域 0001 本发明属于食用菌分子标记辅助育种领域， 一种区分双孢蘑菇4个主栽品种 As2796、 W192、 福蘑38和A15的SSR-PCR鉴定方法。 背景技术 0002 简单序列重复(simple sequence repeat, SSR) ,又称微卫星DNA， 是以2-6个碱 基为重复基元的串联重复序列， 广泛存在于高等生物的基因组中。 在众多的分子标记方法 中， 基于基因组的SSR标记具有特异位点众多、 共显性、 复等位、 分布广泛等特点， 目前已成 为构建连锁遗传图谱、 研究群体遗传学、 绘制品种指纹图谱、 筛选个体特异。

7、谱带以及分子标 记辅助育种等的理想工具。 0003 双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界上栽培最为广泛的食用菌, 具有非常重要 的经济价值。 在中国， 双孢蘑菇也广泛种植， 据2016年官方统计全国双孢蘑菇年产量338万 吨， 占世界总产量的60%以上， 目前已成为农业中的新兴支撑产业。 由于我国各地区的生产 力发展不平衡， 种植双孢蘑菇的生产方式也是呈现出多样化， 有全套引进荷兰模式的全机 械化的工厂化种植方式， 也有经过改良的适合中国本土国情的国内机械化生产方式， 还有 数量众多的以个体农户为主的小生产作坊。 目前， 流通于国内的双孢蘑菇主栽品种有 As2796、 W192。

8、、 福蘑38和A15， 根据国家食用菌产业技术体系双孢蘑菇品种改良岗位调研结 果， 上述4个主栽品种使用比例占90%以上。 其中As2796出菇潮次多， 耐粗放管理， 较适合小 生产作坊种植； W192和福蘑38产量高， 质量较好， 出菇较集中， 适合改良式的中国工厂化种 植； A15产量高， 质量中等， 出菇集中， 适合荷兰模式的全机械化的工厂化种植方式。 由于不 同的种植方式要求与之相适应的品种种性和栽培管理粗放性也不同， 所以在双孢蘑菇生产 过程中对菌种真实性的要求非常高。 但是由于双孢蘑菇可以无性繁殖， 部分农户和企业种 植户经常通过组织分离， 不规范地扩繁和保种， 造成了生产经营和管。

9、理流通的过程中经常 出现了同种异名和同名异种的现象， 所以非常有必要对国内的主栽品种建立一套快速鉴别 的方法。 0004 2013年到2016年期间我所承担了国家科技支撑计划项目子课题 “双孢蘑菇新品种 培育及制种关键技术研究” ， 通过SSR分子标记技术对国内外的双孢蘑菇栽培菌株进行遗传 多态性分析并建立遗传亲缘关系图谱。 近期， 我们在该课题的研究基础上经多次实验探索， 开发获得了一组鉴别双孢蘑菇As2796、 W192、 福蘑38和A15的SSR-PCR鉴定方法， 利用该分子 标记能在菌株的菌丝阶段进行快速地鉴别， 无需通过出菇根据农艺性状来判定， 省时省力， 这对双孢蘑菇生产过程中菌种。

10、或品种的真实性鉴定有着重要的意义。 发明内容 0005 本发明基于分子标记技术， 提供一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方 法。 0006 本发明的一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方法， 是利用SSR分子标 说明书 1/4 页 3 CN 109207625 A 3 记对国内双孢蘑菇主栽品种As2796、 W192、 福蘑38和A15进行PCR扩增。 0007 利用特异引物对国内双孢蘑菇主栽品种的基因组DNA进行SSR-PCR， 不同的品种能 扩增出特异性的图谱带型产物， 所述特异引物的核昔酸序列为： Scaf4_1k11F： 5 -CAATCACAATCCCTCC。

11、AAGC-3 ， Scaf4_1k11R： 5 -AAACGAATTAGGAACGGTGG-3 ； 利用上述的特异引物对Scaf4_1k11F和Scaf4_1k11R对双孢蘑菇As2796、 W192、 福蘑38 和A15菌株的基因组DNA进行SSR-PCR扩增， 其特异性地扩增图谱为菌株As2796能扩增出 1004bp的产物； 菌株W192能扩增出801bp的产物； 菌株福蘑38能扩增出1004bp 和801bp的产 物； 菌株A15能扩增出1004bp、 801bp和252bp的产物。 0008 所述的SSR-PCR扩增条件为： 94预变性5min； 94变性30s， 56退火30s， 。

12、72延 伸1min， 扩增35个循环； 72延伸10min， 4保存。 0009 反应体系为： 模板DNA 30ng， 引物Scaf4_1k11F 30ng， 引物Scaf4_1k11R 30ng， dNTPs 0.1 mmol/L， MgCl2 2.5 mmol/L， Taq DNA聚合酶 1 U， PCR缓冲液10L， 用ddH2O将总 体积补至20L。 0010 本发明的优点在于： 本发明的方法用于特异性地鉴别国内双孢蘑菇主栽品种， 该 方法耗时短， 操作简便， 特异性强， 鉴定准确且省时省力。 根据特异性扩增产物带型来鉴别， 产物带型只含有1004bp条带产物的为菌株As2796， 只。

13、含有801bp条带产物的为菌株W192， 含 有1004bp和801bp条带产物的为菌株福蘑38， 含有1004bp、 801bp和252bp条带产物的为菌株 A15。 应用本发明的方法， 鉴别国内双孢蘑菇主栽品种只需1天的试验时间即可鉴定， 而通过 常规农艺学出菇鉴定方法， 需要耗时45-60天， 且无法快速准确鉴定。 附图说明 0011 图1为4个国内双孢蘑菇主栽品种的SSR-PCR扩增产物图谱。 泳道1-4为表1中编号 1-4的菌株； M： DL10000 DNA Markers。 具体实施方式 0012 实施例1 1、 Taq DNA聚合酶、 PCR缓冲液、 MgCl2 、 dNTPs。

14、购自厦门泰京生物有限公司， 引物委托生 工生物工程(上海)股份有限公司合成， PCR产物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司 测序。 0013 所述特异引物的核昔酸序列为： Scaf4_1k11F： 5 -CAATCACAATCCCTCCAAGC-3 ， Scaf4_1k11R： 5 -AAACGAATTAGGAACGGTGG-3 ； 2、 4个双孢蘑菇国内主栽品种保藏于福建省农业科学院食用菌研究所遗传育种研究 室， 其菌株编号和菌株名称参见 （表一） 3、 双孢蘑菇DNA提取与电泳 双孢蘑菇DNA提取与DNA电泳按照文献陈美元， 廖剑华， 李洪荣， 郭仲杰， 卢政辉， 蔡丹 凤， 王泽生.。

15、 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析J. 中国农学通报， 2009， (04)： 149-156.。 说明书 2/4 页 4 CN 109207625 A 4 0014 4、 SSR-PCR反应体系与条件 反应体系为： 模板DNA 30ng， 引物Scaf4_1k11F 30ng， 引物Scaf4_1k11R 30ng， dNTPs 0.1 mmol/L， MgCl2 2.5 mmol/L， Taq DNA聚合酶 1 U， PCR缓冲液1， 用ddH2O将总体积补 至20L。 扩增条件为： 94预变性5min； 94变性30s， 56退火30s， 72延伸1min， 扩增35 个循环；。

16、 72延伸10min， 4保存。 PCR产物电泳按照文献陈美元， 廖剑华， 王波， 李洪荣， 卢政辉， 郭仲杰， 蔡丹凤， 王泽生. 中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析 J. 食用菌学报， 2009， (01)： 11-16.。 0015 5、 结果分析 SSR -PCR检测结果如图1， 1-4号为4个国内双孢蘑菇主栽品种As2796、 W192、 福蘑38和 A15， 其中产物带型只含有1004bp条带产物的为菌株As2796， 只含有801bp条带产物的为菌 株W192， 含有1004bp和801bp条带产物的为菌株福蘑38， 产物带型中含有1004bp、 801bp和 2。

17、52bp条带产物的为菌株A15。 检出阳性率100%。 可见， 该组引物及其扩增的PCR产物带型可 以对国内4个双孢蘑菇主栽品种进行有效地区分和鉴定。 0016 表1： 图1中的4个菌株编号及菌株名称 表1 供试菌株编号及来源 6、 该发明中特异PCR扩增产物的序列 （1004bp） 及引物所在位置 5 -AAACGAATTAGGAACGGTGGTTGACAATGCAAGTTTAAATCGGATTTGGATTTTTTGCTGCGATGGAAG GGGACTTGTACCATCCGAAGCGGCCCGGCTATTTCAAACAGATTAACGAATAATGTGCAGTGAATAGCATGTGAAA。

18、 AAGTAGATATCAATCAAAAGCAGATATATAAGTACAGGTAGGAATGACTGTAGTTTCACCAATAAGAAAATAAGTC AGCTAAGGCTACAAATTGTCAATGGGATGGAGAGAGTGTCATACCGGATATATATACATAGTACTACACAGGATTG ACCGAGGTTTGGGAAGATGGATATCGTTTTGACCTGCTCGATTCTATCCATGGGTCCGTCAGAGGTGAAGATAAGT GACTACCAAATGACATGCAAAGGGTAAAGTCGACTATGATTGCAAAGCGAAGGAGCGAGGAGTAATGG。

19、AAAGAAAG AAGGAAGAAGGAAGGAATCAAGGAATCAAGGAATCAAGGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGACAACAGACAACAGAAA GCAAGAGGAGAAATACCGGTACGAGTGGGGACAGGATCAATTTCGTACACTTCACAGTCCCATCCTTTCTGCTAAC 说明书 3/4 页 5 CN 109207625 A 5 GTCCGATCACCATTTATACCGTAGACATTGTTTGGTGTCGCATTGCTTGCTCCGTGGAATGCTTGGCCTCCTCCAG CAGCTCTGTCTCCACGACGAGTGCGTCCAGG。

20、GCCGCCACCATTTCTCCTGCTGAGGTTGGTGTTCAAACCCTCTAT CTCGACTGCGGTCCTGACCTTGAGGCCCTCTATCGCGATCCCGTTCTCGATTCCTCTCTCTCCCGCTCTCCTTATC ATGTTCACGATCCATATCCTTCTCCCATCCGCGCCCAGATTCGGTGGGTAATGGGTGCTCATTATCAACGTCCATT TTGGACGAGCGATTTCCTTTGTTGGCATCATGCCCTCCACGAACGTCTTTTGTCACTACGTTTTGGGTGATTGTCA CCGCGCTTGGAGGATTGTGATTG。

21、-3 。 0017 7、 该发明中特异PCR扩增产物的序列 （801bp） 及引物所在位置 5 -AAACGAATTAGGAACGGTGGCCATGGAAGTCGGAACCCGCTAAGGAGTGTGTAACAACTCACCTGCCGA ATGAACTAGCCCTGAAAATGGATGGCGCTTAAGCGTGATACCCATACCTCGCCGTCAGTGTTAAGGTGATGCGCTG ACGAGTAGGCAGGCGTGGAGGTCAGTGAAGAAGCCTTGGCAGTGATGCTGGGTGAAACGGCCTCTAGTGCAGATCT TGGTGGTAGTAGCAAATATTCAAGTGA。

22、GAACCTTGAAGACTGAAGTGGAGAAAGGTTCCATGGTAACAGCAGTTGG ACATGGGTCAGTCGATCCTAAGAGATAGGGAAGCTCCGTTTCAAAGTGTGCGATTCTTCGCACCGCCTATCGAAAG GGAATCCGGTTAAAATCCCGGAACCAGGATGTGGATCTTTAACGGCAACGTAACTGAACTTGGAGACGTTGGCAGG GGCCCCGGGAAGAGTTATCTTTTCTCCTTAACAGTCTACCACCCTGAAATCAGATTGTCTGGAGCTAGGGTTCAAT GACTGGTAGAGCACAACAC。

23、CTCTGTTGTGTCCGGTGCGTTCCTGACAGCCCTTGAAAATCCAAGGGAATGGATAAT TTTCACACCTGGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCTCTAGTTGATAGAACAATGTAGAT AAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTAAGGGTTGGGGTGTGTCGGGCCTTGG CTGGAAGCCTCGGGACCCAGCTGGGGACTGCTTGGAGGGATTGTGATT-3 。 0018 8、 该发明中特异PCR扩增产物的序列 （252bp） 及引。

24、物所在位置 5 -AAACGAATTAGGAACGGTGGTCCGCCTCCCCGCATTCATCAGCTACTTGAAGGACTTCCGGAACTCAGC TCCCCCAGACAAGCAATAGAGAACCCTCATTTGCTGAAAGGCCGCAGCTTGTCTGACGGAACATTGATTTACACCC CCCCCCCTGCTACGGTGGATCGAAGAGTGTAAACGAGGACAAATTGGGCGCACTCGAGTCCTCGGACGAGGAAGCG CATTCATTGAAGGCTTGGAGGGATTGTGATT-3 。 0019 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利。

25、范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 4/4 页 6 CN 109207625 A 6 SEQUENCE LISTING 福建省农业科学院食用菌研究所 （福建省蘑菇菌种研究推广站） 一种区分双孢蘑菇4个主栽品种的SSR-PCR鉴定方法 5 5 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 caatcacaat ccctccaagc 20 2 20 DNA 人工序列 2 aaacgaatta ggaacggtgg 20 3 1004 DNA 人工序列 3 aaacgaatta ggaacggtgg ttgacaatgc aagtttaaat 。

26、cggatttgga ttttttgctg 60 cgatggaagg ggacttgtac catccgaagc ggcccggcta tttcaaacag attaacgaat 120 aatgtgcagt gaatagcatg tgaaaaagta gatatcaatc aaaagcagat atataagtac 180 aggtaggaat gactgtagtt tcaccaataa gaaaataagt cagctaaggc tacaaattgt 240 caatgggatg gagagagtgt cataccggat atatatacat agtactacac aggattgacc。

27、 300 gaggtttggg aagatggata tcgttttgac ctgctcgatt ctatccatgg gtccgtcaga 360 ggtgaagata agtgactacc aaatgacatg caaagggtaa agtcgactat gattgcaaag 420 cgaaggagcg aggagtaatg gaaagaaaga aggaagaagg aaggaatcaa ggaatcaagg 480 aatcaaggaa agaaagaaag aaagaaagac aacagacaac agaaagcaag aggagaaata 540 ccggtacgag tggg。

28、gacagg atcaatttcg tacacttcac agtcccatcc tttctgctaa 600 cgtccgatca ccatttatac cgtagacatt gtttggtgtc gcattgcttg ctccgtggaa 660 tgcttggcct cctccagcag ctctgtctcc acgacgagtg cgtccagggc cgccaccatt 720 tctcctgctg aggttggtgt tcaaaccctc tatctcgact gcggtcctga ccttgaggcc 780 ctctatcgcg atcccgttct cgattcctct ct。

29、ctcccgct ctccttatca tgttcacgat 840 ccatatcctt ctcccatccg cgcccagatt cggtgggtaa tgggtgctca ttatcaacgt 900 序列表 1/2 页 7 CN 109207625 A 7 ccattttgga cgagcgattt cctttgttgg catcatgccc tccacgaacg tcttttgtca 960 ctacgttttg ggtgattgtc accgcgcttg gaggattgtg attg 1004 4 801 DNA 人工序列 4 aaacgaatta ggaacggtgg cca。

30、tggaagt cggaacccgc taaggagtgt gtaacaactc 60 acctgccgaa tgaactagcc ctgaaaatgg atggcgctta agcgtgatac ccatacctcg 120 ccgtcagtgt taaggtgatg cgctgacgag taggcaggcg tggaggtcag tgaagaagcc 180 ttggcagtga tgctgggtga aacggcctct agtgcagatc ttggtggtag tagcaaatat 240 tcaagtgaga accttgaaga ctgaagtgga gaaaggttcc at。

31、ggtaacag cagttggaca 300 tgggtcagtc gatcctaaga gatagggaag ctccgtttca aagtgtgcga ttcttcgcac 360 cgcctatcga aagggaatcc ggttaaaatc ccggaaccag gatgtggatc tttaacggca 420 acgtaactga acttggagac gttggcaggg gccccgggaa gagttatctt ttctccttaa 480 cagtctacca ccctgaaatc agattgtctg gagctagggt tcaatgactg gtagagcaca 。

32、540 acacctctgt tgtgtccggt gcgttcctga cagcccttga aaatccaagg gaatggataa 600 ttttcacacc tggtcgtact cataaccgca gcaggtctcc aaggtgaaca gcctctagtt 660 gatagaacaa tgtagataag ggaagtcggc aaaatagatc cgtaacttcg ggaaaaggat 720 tggctctaag ggttggggtg tgtcgggcct tggctggaag cctcgggacc cagctgggga 780 ctgcttggag ggatt。

33、gtgat t 801 5 252 DNA 人工序列 5 aaacgaatta ggaacggtgg tccgcctccc cgcattcatc agctacttga aggacttccg 60 gaactcagct cccccagaca agcaatagag aaccctcatt tgctgaaagg ccgcagcttg 120 tctgacggaa cattgattta cacccccccc cctgctacgg tggatcgaag agtgtaaacg 180 aggacaaatt gggcgcactc gagtcctcgg acgaggaagc gcattcattg aaggcttgga 240 gggattgtga tt 252 序列表 2/2 页 8 CN 109207625 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 109207625 A 9 。