在先申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119，本申请要求2008年10月21日提交的美国临 时专利申请第61/107,306号的优先权，通过引用将该临时专利申请整体 并入本文。
技术领域
本发明涉及志贺氏菌(Shigella spp.)的新型蛋白抗原，所述蛋白抗 原还存在于大肠杆菌(Escherichia coli)肠侵袭性菌株上，本发明还涉及 将这些抗原用于开发疫苗的方法，所述疫苗针对志贺氏菌种和血清型所 引起的志贺氏菌病及肠侵袭性大肠杆菌(EIECs)细菌所引起的疾病。本 发明还涉及所述新型抗原和相应抗体在志贺氏菌病诊断和志贺氏菌细菌 鉴定中的用途。
背景技术
志贺氏菌是通过感染结肠上皮细胞引起人的杆菌性痢疾的革兰氏阴 性细菌病原体。志贺氏菌主要感染肠上皮细胞(IECs)。志贺氏菌表达提 供用于传递效应子的机制的数种蛋白，所述效应子诱导通过噬菌作用进 入宿主细胞的细菌性摄取。为实现效应子的注入，志贺氏菌利用III型分 泌(TTS)系统诱导它们进入上皮细胞，触发受感染巨噬细胞的凋亡。
包括痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(S.flexneri)、 鲍氏志贺氏菌(S.boydii)和宋内志贺氏菌(S.sonnei)的志贺氏菌的细 菌引起人的志贺氏菌病，该疾病的特征在于破坏结肠上皮，造成每年1 百万人死亡，大多数为发展中国家的儿童。
痢疾志贺氏菌有15种血清型，弗氏志贺氏菌中鉴定了14种血清型 和亚型，鲍氏志贺氏菌有20种血清型，宋内志贺氏菌内存在单一血清型， 不过它们的流行率并不是平均分布的。宋内志贺氏菌是在工业化国家最 为流行并在一些拉美国家越发流行的志贺氏菌。1型痢疾志贺氏菌能够产 生志贺毒素，所述志贺毒素能造成高发病率和高死亡率。弗氏志贺氏菌 在发展中国家的地方性区域最为流行。世界卫生组织(WHO)将抗志贺 氏菌病的疫苗的开发视作发展中国家的首要问题。
尽管有可能利用抗生素控制并治疗志贺氏菌病的爆发，但是抗生素 的高成本以及抗生素抗性的志贺氏菌种的持续出现(其甚至对最新的抗 生素产生抗性)提高了对有效疫苗的需求，以帮助控制全世界发展中地 区的志贺氏菌病及相关的肠侵袭性大肠杆菌疾病(12)。
为建立成功的感染，志贺氏菌精妙地调节宿主的免疫应答，尤其是 那些导致炎症的应答。与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)不 同，志贺氏菌无法侵袭极化的肠上皮细胞的顶极(apical pole)。相反，志 贺氏菌需要多形核白细胞(PMN)的游出(transmigration)以破坏上皮 屏障，促进经上皮细胞基底外侧极(basolateral pole)的细胞侵袭(26)。 由天然免疫系统的细胞推动的宿主炎症应答将PMN吸引至炎症部位。因 此，志贺氏菌的细胞侵袭需要在感染早期触发炎症。抵达细胞胞内区隔 的细菌生长并在细胞间扩散，免受宿主的免疫防御。然而，受感染的上 皮细胞在炎症过程中发挥了重要作用，它既是检测细菌侵袭的哨兵，也 是介体(mediator)(特别是引发并调控粘膜炎症的细胞因子和趋化因子) 的主要来源。上皮细胞对细菌的识别主要经细胞质分子Nod1/CARD4在 胞内发生，Nod1/CARD4感应微生物基序肽聚糖(8)。Nod1的活化诱导 其它促炎症信号通路，所述促炎症信号通路包括引起趋化因子(如白介 素8(IL-8))表达的NF-κB和c-Jun N-端激酶(JNK)。因而，触发过度 的炎症对志贺氏菌在宿主中的生存有害。
天然志贺氏菌感染赋予了免疫力，提供针对随后的同源毒力志贺氏 菌感染的防护(5)。这种人类特有的疾病通过受感染患者的粪-口途径直 接传播或通过受污染的食物和水间接传播。它是高接触性的感染，能够 利用少至100个微生物进行传播(6)。流行病学研究和志愿者研究已经 揭示，针对志贺氏菌的保护性免疫力是针对LPS或O-特异性抗原，因此 涉及血清型。许多方法被用于志贺氏菌疫苗，包括应用活的减毒志贺氏 菌(16，22)；灭活的志贺氏菌全细菌(18)；以及缀合至载体(carrier) (如蛋白体(24)、破伤风类毒素(25)和核糖体(31))的志贺氏菌脂 多糖(LPS)或O-多糖。尽管已进行了多年的广泛研究，但仍未有针对 所述志贺氏菌种的有效且廉价的疫苗。
使用志贺氏菌减毒菌株用作活的口服疫苗引起的保护性功效已得到 证实。遗传上良好表征的侵袭性志贺氏菌疫苗的临床试验结果是有前景 的。在志愿者试验中，经口服给药的CVD1208、SC602、WRSS1和WRSd1 侯选疫苗是安全且具有免疫原性的，并且就SC602而言，已证明它能抗 痢疾(11，16，17，33)。CVD1208的临床试验证明，可以通过将sen和set 基因从疫苗菌株中清除来减轻由某些活的志贺氏菌疫苗引起的轻微发热 和腹泻症状。将一种血清型中的成功策略复制至其它血清型是正在进行 的研究领域，但最终会需要使用不同血清型志贺氏菌菌株的多价混合物， 所述多价混合物能够抵御大多数志贺氏菌(21)。最近在6个亚洲国家进 行的多中心志贺氏菌腹泻研究表明，从患者分离的志贺氏菌种的相对分 布在不同国家和地点各不相同。此外，弗氏志贺氏菌血清型的分布在地 点间及甚至在年份间是高度不均匀的。志贺氏菌种和血清型的不均匀分 布提示，需要多价的或交叉保护性的志贺氏菌疫苗，以在全世界范围预 防志贺氏菌病(35)。旨在提供广谱覆盖的疫苗会需要包括所有重要的志 贺氏菌血清型(21)。为解决这一难题，已提倡基于应用“五价制剂”的 疫苗策略，所述“五价制剂”包括弗氏志贺氏菌2a、弗氏志贺氏菌3a 和弗氏志贺氏菌6这些菌株以及减毒的宋内志贺氏菌菌株和痢疾志贺氏 菌1菌株(Noriega等人，1994)。或者，可以将复杂结构的应用视作针对 最常见的志贺氏菌种和血清型所造成的感染的疫苗接种方法，所述复杂 结构由志贺氏菌的血清型特异性抗原和交叉反应抗原(如灭活的全细菌 或活的减毒全细菌)组成。已提出鼻内给药的Invaplex，目前处于沃尔 特里德陆军研究所(Walter Reed Army Institute of Research，WRAIR)的I 期试验阶段，所述Invaplex为来自志贺氏菌水提取物的纯化复合物，所 述纯化复合物由Ipa蛋白和LPS组成(23)。
因而，需要有效的疫苗以帮助控制世界发展中地区的志贺氏菌和相 关的肠侵袭性大肠杆菌疾病。
发明内容
在某些实施方式中，本发明涉及用于使哺乳动物针对志贺氏菌产生 免疫的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含对引发针对志贺氏菌的免疫应 答有效量的志贺氏菌及药学上可接受的载体(carrier)或稀释剂，所述志 贺氏菌来自于由IcsP2蛋白和SigA2蛋白组成的组。在某些实施方式中， 所述志贺氏菌IcsP2蛋白和SigA2蛋白与其它蛋白化学缀合或基因融合。
在另外的实施方式中，本发明涉及用于使哺乳动物针对志贺氏菌产 生免疫的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含对引发针对志贺氏菌的免疫 应答有效量的志贺氏菌IcsP2及药学上可接受的载体或稀释剂。
在其它另外的实施方式中，本发明涉及用于使哺乳动物针对志贺氏 菌产生免疫的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含对引发针对志贺氏菌的 免疫应答有效量的志贺氏菌SigA2及药学上可接受的载体或稀释剂。
在其它另外的实施方式中，本发明涉及用于使哺乳动物针对志贺氏 菌产生免疫的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括一定量的化学缀合或基 因融合的IcsP2和SigA2。
在某些实施方式中，所述疫苗组合物还包含佐剂。
在某些实施方式中，所述佐剂是乳状液的油相，所述乳状液选自于 由油包水乳状液和双油乳状液(double oil emulsion)组成的组。
在另外的实施方式中，本发明涉及分离的多肽，所述多肽包括如序 列编号2所示的氨基酸序列(代表志贺氏菌IcsP2)。
在另外的实施方式中，本发明涉及分离的多肽，所述多肽包括如序 列编号4所示的氨基酸序列(代表SigA2)。
在另外的实施方式中，本发明涉及分离的核酸序列，所述核酸序列 编码志贺氏菌IcsP2多肽。
在另外的实施方式中，本发明涉及分离的核酸序列，所述核酸序列 编码SigA2多肽。
在另外的实施方式中，本发明涉及分离的核酸序列，所述核酸序列 编码志贺氏菌IcsP2多肽和SigA2多肽。
在另外的实施方式中，本发明涉及包含权利要求8、9或10的核酸 序列的载体(vector)。在另外的实施方式中，本发明涉及利用本文所述 的任意载体转染的宿主细胞。
在另外的实施方式中，本发明涉及产生志贺氏菌IcsP2多肽和SigA2 多肽的方法，所述方法包括在适于蛋白表达的条件下，培养本文所述的 任意宿主细胞，并从所培养后的细胞收集所述多肽。
在另外的实施方式中，本发明涉及免疫原性组合物，所述免疫原性 组合物包括a)志贺氏菌IcsP2和SigA2；以及b)佐剂，其中，联用的a) 和b)的量有效地引发针对志贺氏菌的免疫应答。
在另外的实施方式中，本发明涉及治疗患有或易患病原体感染的哺 乳动物的方法，所述方法包括给予有效量的本文所述的疫苗组合物。在 某些实施方式中，所述疫苗组合物的有效量为约10微克至约2毫克。
在另外的实施方式中，本发明涉及调节哺乳动物免疫应答的方法， 所述方法包括给予有效量的本文所述的任意一种疫苗组合物。在某些实 施方式中，所述疫苗组合物的有效量为约10微克至约2毫克。
在另外的实施方式中，本发明涉及与志贺氏菌IcsP2多肽特异结合 的抗体。
在另外的实施方式中，本发明涉及与SigA2多肽特异结合的抗体。 在某些实施方式中，所述抗体还包含标记。在另外的实施方式中，所述 标记选自于由酶、蛋白、肽、抗原、抗体、凝集素、碳水化合物、生物 素、亲和素、放射性同位素、毒素和重金属组成的组。在另外的实施方 式中，所述抗体是人源化抗体。在另外的实施方式中，所述抗体是CDR 移植抗体。在另外的实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在另外的实施 方式中，所述抗体是抗体片段。在另外的实施方式中，所述抗体是单克 隆抗体。在另外的实施方式中，所述抗体是多克隆抗体。
在另外的实施方式中，本发明涉及含糖的缀合物分子，所述糖包含 志贺氏菌细菌的O抗原，且所述糖共价结合到志贺氏菌IcsP2或SigA2 蛋白。
在另外的实施方式中，本发明涉及含糖的缀合物分子，所述糖包含 志贺氏菌细菌的O抗原，且所述糖共价结合到本文所述的多肽。
在另外的实施方式中，本发明涉及用于使哺乳动物针对志贺氏菌病 产生免疫的疫苗，所述疫苗包含本文所述的缀合物分子。
在另外的实施方式中，本发明涉及含有糖的缀合物分子，所述糖来 自与志贺氏菌属无关的细菌，且所述糖共价结合到志贺氏菌IcsP2或 SigA2蛋白。
在另外的实施方式中，本发明涉及含有糖的缀合物分子，所述糖来 自与志贺氏菌属无关的细菌，且所述糖共价结合到本文所述的多肽。
在另外的实施方式中，本发明涉及用于使哺乳动物针对志贺氏菌病 和伤寒病产生免疫的疫苗，所述疫苗包含本文所述的缀合物分子。
附图说明
图1显示受IcsP2蛋白免疫接种保护的动物免受弗氏志贺氏菌2a对 肺的攻击。该结果还显示受弗氏志贺氏菌减毒活疫苗菌株(SC602)的鼻 内给药保护的小鼠免受攻击。
图2显示受IcsP2粘膜免疫接种保护的小鼠免受弗氏志贺氏菌不同血 清型诱导的肺炎。
图3显示受IcsP2粘膜免疫接种保护的小鼠免受1型痢疾志贺氏菌诱 导的肺炎。
图4显示SigA2的粘膜免疫接种防止弗氏志贺氏菌2a(2457T)攻击， 但不防止弗氏志贺氏菌5a(M90T)攻击。
图5显示与CT佐剂一起给予的SigA2或IcsP2的粘膜给药诱导了血 清抗体应答。
图6A-B是说明SigA2免疫接种的动物在脾(图6A)和肺(图6B) 中均主要出现IgA-ASC和IgG-ASC应答的图。
图7是说明SigA2的全身(腹膜内(i.p.))免疫接种和粘膜(鼻内(i.n.)) 免疫接种诱导了肺和血清中的抗体应答的图。
图8显示了针对SigA2蛋白产生的小鼠抗血清对志贺氏菌菌株中 SigA2蛋白的识别。
图9显示SigA2的测试抗血清抑制了弗氏志贺氏菌诱导的菌斑形成。
图10是显示sigA基因和icsP基因在志贺氏菌的各血清型中的存在 的凝胶照片。
图11A-D显示抗SigA2的抗体抑制了弗氏志贺氏菌2a引起的角膜结 膜炎。
图12显示了IcsP2片段的DNA序列及其在全长IcsP序列内的位置。 该IcsP2片段提取自弗氏志贺氏菌2a 2457T菌株全长基因组序列的全长 iscP基因。
图13显示SigA2片段的DNA序列及其在全长SigA序列内的位置。 该SigA2片段提取自弗氏志贺氏菌2a 2457T菌株全长基因组序列的全长 sigA基因。
具体实施方式
本发明涉及在抗志贺氏菌感染的疫苗组合物中作为候选蛋白抗原的 IcsP和SigA的鉴定。更具体地，本发明涉及志贺氏菌IcsP和SigA的特 定多肽部分或片段，所述多肽部分或片段能够诱导针对毒力志贺氏菌细 菌引起的感染的保护性免疫应答。下文将所述特定多肽分别称作IcsP2和 SigA2。IcsP2对所有志贺氏菌是常见的，并且还存在于EIEC上。SigA2 存在于弗氏志贺氏菌2a菌株上以及鲍氏志贺氏菌菌株和宋内志贺氏菌菌 株上。
本发明涉及鉴定为与志贺氏菌表面结合的和/或由志贺氏菌分泌的蛋 白抗原IcsP2和SigA2，所述蛋白抗原IcsP2和SigA2对于包括弗氏志贺 氏菌、宋内志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌在内的志贺氏菌类 型和种是常见的，并能够在作为疫苗给予时，防止志贺氏菌病和其它肠 道感染。此外，本发明涉及在志贺氏菌种和EIEC间也常见的特定的所述 抗原。本发明还涉及针对这些抗原所产生的抗体的用途及DNA探针在志 贺氏菌和EIEC感染诊断中的用途。
抗原鉴定和所述抗原的表征
可获得志贺氏菌的全基因组序列，所述志贺氏菌包括：弗氏志贺氏 菌2a菌株2457T(37)和Sf301(15)；弗氏志贺氏菌5b菌株Sf8401(20)； 痢疾志贺氏菌1菌株Sd197；鲍氏志贺氏菌血清型4菌株Sb227和宋内志 贺氏菌菌株Ss046(38，39)。除所述志贺氏菌菌株的全基因组序列外，还 可以获得来自多种志贺氏菌的毒力质粒的全核苷酸序列(3，14)。
IcsP
志贺氏菌在宿主细胞胞质内的运动依赖于该细菌将宿主细胞肌动蛋 白募集至其表面而形成肌动蛋白尾的能力，所述肌动蛋白尾将该细菌从 一个细胞推动至另一个细胞(2)。肌动蛋白尾的组装由单一细菌蛋白IcsA 介导，所述IcsA存在于细菌一极的外表面，而肌动蛋白的组装发生在该 极(27)。所述IcsA蛋白集中于细菌的成熟极(old pole)，且所述IcsA 蛋白对肌动蛋白的组装而言是必要且充分的(9)。icsA基因位于志贺氏 菌毒力质粒上，由于它是细菌运动所必需的，因而在所有血清型和种中 均存在(38)。所述IcsA蛋白由2个域组成：α-域(53-758位的残基)含 有肌动蛋白组装的决定簇，α-域从细菌表面延伸至胞外环境，而β-域 (759-1102位的残基)嵌入外膜(32)。
外膜蛋白酶IcsP将IcsA从细菌表面缓慢切割下来(7)。志贺氏菌的 大(230-kb)毒力质粒上的单顺反子操纵子编码IcsP(3)。IcsP的缺失导 致表面IcsA的分布改变，使得极帽(polar cap)维持，一些IcsA沿细菌 侧壁分布。这个327个氨基酸的多肽的氨基酸序列与大肠杆菌蛋白酶 OmpP和OmpT都具有58％的序列一致性，与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)蛋白酶E前体PrtA具有42％的序列一致性，并与鼠疫耶 氏菌(Yersinia pestis)纤维蛋白溶酶前体Pla具有40％的序列一致性(29)。
SigA
sigA基因位于弗氏志贺氏菌2a染色体DNA的毒力岛(pathogenicity island)上。虽然sigA被认为仅存在于弗氏志贺氏菌血清型2a中，但在 鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌中也报道过sigA的存在(38)。序列分析表 明sigA编码139kDa的蛋白，该蛋白属于自主转运蛋白的SPATE(肠杆 菌科(Enterobacteriaceae)丝氨酸蛋白酶自主转运蛋白)亚家族(1)。与 肠聚集性大肠杆菌自主转运蛋白Pet(肠毒性的细胞病变性蛋白酶)相比， SigA蛋白的氨基酸一致性是58％(1)。与野生型志贺氏菌相比，SigA突 变细菌表现出积液的减少，但是所述突变体细菌仍然能够诱导大量积液， 暗示SigA仅是弗氏志贺氏菌2a产生的多种肠毒素中的一种。
倘若所述抗原确实是保护性的，这对志贺氏菌的大部分(如果不是 所有)种和血清型中常见的新抗原的鉴定会是理想的。基因组学和蛋白 组学对于发现新的疫苗靶标和开发有效疫苗的能力具有显著影响，一些 志贺氏菌的表面蛋白被认定为可能的志贺氏菌病候选疫苗(13，19，36)。
本发明还涉及目的志贺氏菌蛋白的克隆、表达和纯化。所纯化的蛋 白用于免疫和评价三种动物模型中的保护性免疫力，所述三种动物模型 为：1)小鼠肺炎模型；2)豚鼠角膜结膜炎模型和3)豚鼠结肠炎模型(所 述模型记载于10，28，30)。
在某些实施方式中，本发明提供了用于筛选志贺氏菌常见蛋白抗原 的方法，本发明所使用的方法可用于粘膜病原体的蛋白抗原的筛选。
在某些实施方式中，本发明提供了用于产生所述志贺氏菌IcsP2多肽 和SigA2多肽的特异性抗体及用于制备特异性地针对所述常见抗原的相 应的DNA探针的方法。所述抗体和DNA探针可以用于对表达所述常见 抗原或相应基因的细菌进行检测及用于志贺氏菌和EIEC所引起的杆菌 性痢疾的诊断。治疗性抗体还可以用于治疗患有急性杆菌性痢疾的患者， 所述急性杆菌性痢疾由表达相应蛋白抗原的细菌引起。
杆菌性痢疾的诊断
除志贺氏菌之外，大肠杆菌的某些菌株能够引起痢疾。当前，已公 认的引起人肠胃炎的致泻性大肠杆菌(enterovirulent E.coli)(总称为EEC 组)有4种。大肠杆菌是人和其它灵长类中正常肠内菌群的一部分。少 数大肠杆菌菌株能够通过数种不同机制引起人类的疾病。这其中便有肠 侵袭性(EIEC)菌株。何种食物能够携有这些能够引起杆菌性痢疾的病 原性肠侵袭性(EIEC)菌株还是未知的。肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)可 以产生称作杆菌性痢疾的疾病。引起该综合症的EIEC菌株与志贺氏菌密 切相关。摄入EIEC后，该生物体侵袭肠上皮细胞，导致轻型痢疾，其常 被误认为是志贺氏菌种引起的痢疾。该疾病的特征在于受感染个体的粪 便中出现血和粘液。由于必须从粪便中分离该细菌，而志贺氏菌和EIEC 的感染剂量被认为是少至10-100个生物体，因此，志贺氏菌和EIEC感 染的诊断相对困难。
来自受感染个体粪便的生物体的培养以及证实组织培养物或适当动 物模型中分离物的侵袭性，对于该生物体所引起的痢疾的诊断是必需的。 然而，这样的方法麻烦且耗时。
Echeverria P.等人记载道，“(…)通过在选择培养基上培养粪便标本 并借助种特异性抗血清检测分离物的凝集，经典地鉴定了四个志贺氏菌 种(痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌)。DNA 探针已经用于鉴定不在抗血清中凝集的乳糖发酵和非乳糖发酵的EIEC 和志贺氏菌分离物。如果可利用具有志贺氏菌抗血清的、有能力的细菌 学实验室，那么所述DNA探针对于志贺氏菌的鉴定不是必需的。与EIEC 感染相关的临床疾病与志贺氏菌病相似。然而，与患有志贺氏菌病的儿 童相比，患有EIEC感染的儿童大便潜血(36％对82％)及每个高倍视野 中多于10个粪便白细胞(36％对67％)的情况较少。目前，标准的细菌 学方法及对大肠杆菌分离物与志贺氏菌/EIEC探针杂交的测试是诊断由 这些肠病原体造成的感染的最灵敏的手段。在不能利用细菌学实验室的 情况下，鉴定志贺氏菌和EIEC感染的更为快速的方法涉及免疫学测定 法”(40)，Rev.Infect.Dis.1991三月-四月；13增补4：S220-5)。
本发明部分涉及这样的发现，即EIEC也表达IcsP2，且IcsP2的序 列与志贺氏菌IcsP2高度同源，但不与致泻性大肠杆菌(EEC)的其它3 类基因高度同源。因此，本发明的一个方面涉及作为针对EIEC的保护性 试剂的IcsP2，还涉及针对志贺氏菌IcsP2的DNA探针和特异性抗体，所 述DNA探针和特异性抗体能够用于志贺氏菌和EIEC引起的痢疾的诊断。
在一种实施方式中，本发明所公开的志贺氏菌多肽抗原与药学上可 接受的稀释剂一起给药。可以通过注射(皮下、皮内、肌内)或使用粘 贴片(adhesive patch)局部施用至皮肤上来给予这样的制剂。或者，使 用药学上可接受的媒介(vehicle)，通过粘膜途径(口服途径、含服(buccal) 途径、舌下途径、滴鼻剂、气雾剂、直肠途径)给予所述疫苗。还可以 将所述抗原与佐剂混合以增强随后发生的免疫应答。所述佐剂的实例非 限制性地是铝盐、免疫刺激复合物(ISCOM)、基于皂角苷的佐剂、水包 油型和油包水型乳状液、Toll样受体配体(如胞壁酰二肽)、大肠杆菌LPS、 由非甲基化DNA组成的寡核苷酸、多聚I:C、脂磷壁酸、肽聚糖。肠毒 素和它们的佐剂活性衍生物，如霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素、百 日咳毒素、志贺毒素和类似物。
在本发明的另一种实施方式中，在非毒力或减毒细菌中克隆和表达 所公开的抗原，减毒细菌被用作载体(vectors)，所述载体包含能够起始 mRNA合成的DNA启动子元件，所述启动子元件与含有编码志贺氏菌 IcsP和SigA的基因之一或两者的开放阅读框可操作地连接。所得的一种 或多种蛋白被输出并在细菌表面和/或周质被组装。随后，这样的非毒力 或减毒细菌可以用作口服或粘膜疫苗。细菌载体的实例为本领域已知， 如大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、杆菌(Bacillus spp.)、梭状芽胞杆菌(Clostridium spp.)、单增 李斯特菌(Listerium monocytogenes)、分支杆菌(Mycobacterium spp.)、 乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、格氏链球菌 (Streptococcus gordonii)。在另一种实施方式中，在已装配有合适启动子 的志贺氏菌非毒力菌株或突变体菌株中过表达IcsP和SigA抗原。随后， 表达IcsP抗原或SigA抗原或表达这两者的细菌可以用作抗志贺氏菌病的 活疫苗。或者，可以用福尔马林或通过加热使所述过表达菌株失活，而 所得细菌可以用作灭活疫苗。本发明另外的实施方式是用于转化志贺氏 菌种的载体，所述载体导致异源抗原的周质表达。该表达不大可能改变 口服后的志贺氏菌的天然组织向性(结肠上皮)或不大可能显著降低菌 株的侵袭性。合适的志贺氏菌种包括宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、弗 氏志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌的减毒活疫苗菌株。示例性的转化的志贺氏 菌菌株包括志贺氏菌疫苗菌株，例如弗氏志贺氏菌2a(SC608(3098))、 弗氏志贺氏菌2a(SC608(cfaAE))、弗氏志贺氏菌2a(SC608(pCFAI)) 和弗氏志贺氏菌2a(SC608(pCFAI/LTB))。这些菌株的特征在于在icsA 和基因iucA中具有缺失，icsA是使志贺氏菌能够在宿主上皮细胞的胞内 和胞间扩散的基因，而基因iucA在细菌的铁获取中发挥作用。这些转化 的志贺氏菌菌株适用于免疫原性组合物，特别是口服或粘膜给药的疫苗。 用作载体系统的其它细菌已有记载，并在本领域中是公知的：
·出于包括开发活疫苗在内的多种目的，将沙门氏菌和大肠杆菌细 菌表面蛋白用作外源抗原表位的载体或媒介(美国专利第5,348,867号， 发明人Georgiou，George，Francisco，Joseph A，Earhart，Charles F.)。
·携带编码信号序列的表达盒的乳酸杆菌，其中，生物学上的活性 多肽与异源羧基末端靶区域连接(WO/2005/012491， PCT/US2004/002460)发明人：CHANG，Chia-Hwa，LIU，Xiaowen等人)。
·细菌表面蛋白表达：Smit，John；和Nina Agabian；″Cloning of the Major Protein of the Caulobacter crescentus Periodic Surface Layer： Detection and Characterization of the Cloned Peptide by Protein Expression Assays″(1984)J.Bacteriol.160，1137-1145.美国专利第5,500,353号。
·重组多肽在宿主细胞中的区隔化。(PCT/EP00/00686，美国专利第 6,610,517号，发明人Werner Lubitz)。
·蛋白的酵母细胞表面展示及其用途(美国专利第6,423,538号) Wittrup，K.Dane等人)。
·重组分支杆菌、特别是重组牛分支杆菌BCG，其表达编码目的产 物(蛋白或多肽)的异源DNA(美国专利第5,591,632号)O′Donnell，Michael A.等人)。
·革兰氏阳性细菌在重组蛋白表达中的用途(美国专利第5,821,088 号)Darzins，Aldis等人Gianni Pozzi等人，″Delivery and Expression of a Heterologous Antigen on the Surface of Streptococci″，Infection and Immunity(May 1992)60：1902-1907。
·杆菌中的表达和分泌方法(美国专利第5,032,510号)-S.Kovacevic 等人。
用于将IcsP多肽和/或SigA多肽导入哺乳动物细胞、组织、器官或 生物体的载体还包括装配有合适的启动子元件的减毒病毒，所述启动子 元件控制编码IcsP和/或SigA的转基因的表达，所述载体可以被制备并 用于产生IcsP和/或SigA。可以用于表达IcsP和/或SigA的病毒载体的 实例包括但不限于腺病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒(sindbis virus) 载体、西门利克森林病毒(Semliki Forrest virus)、痘病毒、乳头状瘤病 毒、逆转录病毒或慢病毒。其它用于表达IcsP和/或SigA的载体包括病 毒样颗粒(VLP)和噬菌体。
另外，IcsP和SigA可以被合并到包含选择基因、酵母序列和编码IcsP 和/或SigA的多核苷酸的重组表达载体中，其中，所述多核苷酸与酵母启 动子可操作地连接，所述载体用于转染产生本发明的IcsP多肽和/或SigA 多肽的酵母细胞。可以为在酵母细胞中表达本发明的蛋白设计本发明的 重组表达载体。本领域公知在酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))中表达蛋白的 方法。
本发明还涉及特异性针对IcsP基因和SigA基因及IcsP2多肽和 SigA2多肽的试剂在诊断性测试设计中的用途。
在本发明的另一种实施方式中，在非毒力或减毒细菌中克隆和表达 所公开的抗原，所述减毒细菌被用作载体，所述载体包含能够起始mRNA 合成的DNA启动子元件，所述启动子元件与含有编码志贺氏菌IcsP和 SigA的基因之一或两者的开放阅读框可操作地连接。所得的一种或多种 蛋白被输出并在细菌表面和/或周质被组装。随后，这样的非毒力或减毒 细菌可以用作口服或粘膜疫苗。在另一种实施方式中，在已装配有合适 启动子的志贺氏菌非毒力菌株或突变体菌株中过表达IcsP和SigA抗原。 随后，表达IcsP抗原或SigA抗原或表达这两者的细菌可以用作抗志贺氏 菌病的活疫苗。或者，可以用福尔马林或通过加热使所述过表达菌株失 活，而所得细菌可以用作灭活疫苗。本发明另外的实施方式是用于转化 志贺氏菌种的载体，所述载体导致异源抗原的周质表达。该表达不大可 能改变口服后的志贺氏菌的天然组织向性(结肠上皮)或不大可能显著 降低菌株的侵袭性。合适的志贺氏菌种包括宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏 菌、弗氏志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌的减毒活疫苗菌株。示例性的转化的 志贺氏菌菌株包括志贺氏菌疫苗菌株，例如弗氏志贺氏菌2a(SC608 (3098))、弗氏志贺氏菌2a(SC608(cfaAE))、弗氏志贺氏菌2a(SC608 (pCFAI))和弗氏志贺氏菌2a(SC608(pCFAI/LTB))。这些菌株的特 征在于在icsA和基因iucA中具有缺失，icsA是使志贺氏菌能够在宿主上 皮细胞的胞内和胞间扩散的基因，而基因iucA在细菌的铁获取中发挥作 用。这些转化的志贺氏菌菌株适用于免疫原性组合物，特别是口服或粘 膜给药的疫苗。用作载体系统的其它细菌已有记载，并在本领域中是公 知的：
·出于包括开发活疫苗在内的多种目的，将沙门氏菌和大肠杆菌细 菌表面蛋白用作外源抗原表位的载体或媒介(美国专利第5,348,867号， 发明人Georgiou，George，Francisco，Joseph A，Earhart，Charles F.)。
·携带编码信号序列的表达盒的乳酸杆菌，其中，所述生物学上的 活性多肽与异源羧基末端靶区域连接(WO/2005/012491， PCT/US2004/002460)发明人：CHANG，Chia-Hwa，LIU，Xiaowen等人)。
·细菌表面蛋白表达：Smit，John；和Nina Agabian；″Cloning of the Major Protein of the Caulobacter crescentus Periodic Surface Layer： Detection and Characterization of the Cloned Peptide by Protein Expression Assays″(1984)J.Bacteriol.160，1137-1145.美国专利第5,500,353号。
·重组多肽在宿主细胞中的区隔化。(PCT/EP00/00686，美国专利第 6,610,517号，发明人Werner Lubitz)。
·蛋白的酵母细胞表面展示及其用途(美国专利第6,423,538号) Wittrup，K.Dane等人)。
·重组分支细菌、特别是重组牛分支杆菌BCG，其表达编码目的产 物(蛋白或多肽)的异源DNA(美国专利第5,591,632号)O′Donnell，Michael A.等人)。
·革兰氏阳性细菌在重组蛋白表达中的用途(美国专利第5,821,088 号)Darzins，Aldis等人Gianni Pozzi等人，″Delivery and Expression of a Heterologous Antigen on the Surface of Streptococci″，Infection and Immunity(May 1992)60：1902-1907
·杆菌中的表达和分泌方法(美国专利第5,032,510号)-S.Kovacevic 等人
本发明还涉及特异性针对IcsP基因和SigA基因及IcsP2多肽和 SigA2多肽的试剂在诊断性测试设计中的用途。
称作聚合酶链式反应(PCR)的基因扩增技术是本领域公知的，并 已将该技术用于志贺氏菌感染的诊断(41)。本发明公开了能够与IcsP2 基因序列和SigA2基因序列结合的特异性引物。所述引物可以用于扩增 临床样品(例如粪便)中存在的细菌中的icsP基因或sigA基因，可以通 过可视化方法、光度计方法、同位素方法或荧光光度计方法检测所扩增 片段。因而，本发明请求保护特异性针对所述IcsP2基因序列和SigA2 基因序列的寡核苷酸引物在志贺氏菌和EIEC引起的痢疾的诊断中的用 途。
本发明还涉及针对SigA2和IcsP2的抗血清的产生。所述抗血清能够 与相应的多肽反应，所述相应的多肽由不同的志贺氏菌种表达。此外， 所述抗血清能够抑制志贺氏菌细菌对HeLa细胞的体外感染，并且在角膜 结膜炎模型中能够使动物免受志贺氏菌所引起的炎症。
本发明还涉及志贺氏菌的IscP2和O多糖抗原的缀合物以及志贺氏 菌的SigA2和O多糖抗原的缀合物。病原体细菌表面上的O-特异性多糖 被认为既是保护性抗原，也是基本的毒力因子。大多数多糖无法在婴儿 以及免疫系统削弱的成人中引发保护性水平的抗多糖抗体，这可以通过 它们与赋予T细胞依赖性质的蛋白的共价连接来克服。该原理导致抗流 感嗜血杆菌b(Haemophilus influenzae b)(Hib)疫苗、抗肺炎球菌肺炎 (pneumococcal pneumonia)疫苗和抗脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)疫苗的构建。缀合物技术向革兰氏阴性细菌的O特异性多 糖的延伸提供了新一代糖缀合物疫苗。最初，Avery和Goebel在J.Exp. Med.50：531(1929)中以及Goebel在J.Exp.Med.50：469-520(1929)中 指出，可以通过将肺炎球菌3型多糖化学结合至载体蛋白来提高它的免 疫原性。该原理已被成功应用于提高其它病原体多糖的免疫原性。将多 糖共价缀合至蛋白载体的方法为本领域所公知，并包括如下方法：
Gu，X.等人，″Synthesis，Characterization，and Immunologic Properties of Detoxified Lipooligosaccharide from Nontypeable Haemophilus influenza Conjugated to Proteins″，Infection and Immunity，64(10)，(1996)pp. 4047-4053.
Gupta，R.等人，″Comparative Immunogenicity of Conjugates Composed of Escherichia coli O111 O-Specific Polysaccharide，Prepared by Treatment with Acetic Acid or Hydrazine，Bound to Tetanus Toxoid by Two Synthetic Schemes″，Infection and Immunity，63(8)，(1995)，pp.2805-2810.
Gupta，R.等人，″Synthesis，Characterization，and Some Immunological Properties of Conjugates Composed of the Detoxified Lipopolysaccharide of Vibrio cholerae O1 Serotype Inaba Bound to Cholera Toxin″，Infection and Immunity，60(8)，(1992)，pp.3201-3208.
Konadu，E.等人，″Investigational Vaccine for Escherichia coli O157： Phase 1 Study of O157 O-Specific Polysaccharide-Pseudomonas aeruginosa Recombinant Exprotein A Conjugates in Adults″，Journal of Infectious Diseases，177，(1998)，pp.383-387.
Konadu，E.等人，″Phase 1 and Phase 2 Studies of Salmonella enterica Serovar Paratyphi A O-Specific Polysaccharide-Tetanus Toxoid Conjugates in Adults，Teenagers，and 2-to 4-Year Old Children in Vietnam″，Infection and Immunity，68(3)，(2000)，pp.1529-1534.
Konadu，E.等人，″Preparation，Characterization，and Immunological Properties in Mice of Escherichia coli O157 O-Specific Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines″，Infection and Immunity，62(11)， (1994)，pp.5048-5054.
Robbins，J.等人，″Polysaccharide-Protein Conjugates：A New Generation of Vaccines″，The Journal of Infectious Diseases，161，(1990)，pp. 821-832.
Taylor，D.等人，″Synthesis，Characterization，and Clinical Evaluation of Conjugate Vaccines Composed of the O-Specific Polysaccharides of Shigella dysenteriae Type 1，Shigella flexneri Type 2a，and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides)Bound to Bacterial Toxoids″，Infection and Immunity，61，(1993)，pp.3678-3687.
WO/1999/003871；美国专利4771127；美国专利5866132。
在另一种实施方式中，本发明涉及缀合物，其中，志贺氏菌O多糖 通过间隔子与IcsP或SigA偶联，以增强多糖的抗原性和免疫原性，所述 缀合物用于诱导对所述蛋白和多糖的免疫应答。
在又一种实施方式中，志贺氏菌IcsP和SigA蛋白可以被化学缀合或 是志贺氏菌IcsP和SigA蛋白与在例如疫苗中用作免疫原的其它蛋白的基 因融合的产物。所述蛋白包括破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素B 亚基、大肠杆菌肠毒素B亚基和鞭毛蛋白。所述蛋白为本领域所公知， 并如以下出版物所指出的，所述蛋白已经在工业和/或研究中广泛用于这 些目的：
SJ McKenzie和JF Halsey，Cholera toxin B subunit as a carrier protein to stimulate a mucosal immune response.The Journal of Immunology，Vol 133，Issue 4 1818-1824；
S.Shah，R.Raghupathy，Om.Singh，G.P.Talwar和A.Sodhi，Prior immunity to a carrier enhances antibody responses to hCG in recipients of an hCG-carrier conjugate vaccine.Vaccine，Volume 17，Issues 23-24，1999， 3116-3123；
LE MOIGNE Vincent；ROBREAU Georges；MAHANA Wahib； Flagellin as a good carrier and potent adjuvant for Th1 response：Study of mice immune response to the p27(Rv2108)Mycobacterium tuberculosis antigen.Molecular immunology 2008，vol.45，No.9，2499-2507；
Camilo Cuadros，Francisco J.Lopez-Hernandez，Ana Lucia Dominguez， Michael McClelland和Joseph Lustgarten.Flagellin Fusion Proteins as Adjuvants or Vaccines Induce Specific Immune Responses.Infection and Immunity，2004年5月，2810-2816，Vol.72，No.5。
在又一种实施方式中，本发明涉及缀合物，其中，另一种肠病原性 细菌多糖(如伤寒沙门菌(Salmonella Typhi)Vi多糖或副伤寒沙门菌 (Salmonella Paratyphi)多糖)通过间隔子共价偶联至IcsP或SigA，所 述缀合物用于诱导对所述蛋白和多糖的免疫应答，并因而用于针对志贺 氏菌病和伤寒(或副伤寒)病的疫苗接种。
本发明还提供在动物中产生抗志贺氏菌IcsP2和SigA2的抗体的方法 以及用于检测已知或疑似患有志贺氏菌病的患者中的志贺氏菌的诊断方 法中的重组多肽。在免疫接种的小鼠和豚鼠血清中存在的所述抗体还可 以在其它动物物种中产生，如马、山羊、兔、猴、牛、驴、仓鼠。分子 生物学和抗体技术(如涉及杂交瘤应用的技术)已使研究人员和临床工 作者能够获得可用于普通诊断和临床程序的高度特异且有效的单克隆抗 体资源。可以通过将用IcsP2或SigA2免疫接种的动物的免疫细胞与合适 的骨髓瘤细胞进行标准融合，来获得所述单克隆抗体。更具体地，可以 利用本发明的核酸、蛋白或肽分子来开发与志贺氏菌IcsP2或SigA2结合 的单克隆抗体或多克隆抗体。为制备本发明的志贺氏菌IcsP2结合抗体或 SigA2结合抗体，可以使用通过培养的连续细胞系产生抗体分子的任何技 术。例如，可以使用Kohler和Milstein(256 Nature 495-497(1975))原创 的杂交瘤技术。另见美国专利第4,376,110号；Ausubel等人，Antibodies：a Laboratory Manual，(Harlow & Lane编著，Cold Spring Harbor Lab.1988)； Current Protocols in Immunology，(Colligan等人编著，Greene Pub.Assoc.& Wiley Interseience N.Y.，1992-1996)。
如美国专利第6,537,809号所记载的，制备高亲和力(affinity)和/ 或高亲合力(avidity)人抗体的另一种有利途径涉及天然人淋巴细胞的体 外抗原致敏(priming)、所得体外抗原致敏的淋巴细胞向免疫受损供体(例 如SCID小鼠)的转移、利用抗原增强免疫受损供体、从所述供体分离分 泌人抗体的B细胞(分泌IgG)以及EBV转化所分离的分泌人抗体的细 胞。
本发明的抗体包括含有部分人抗体和部分小鼠抗体的嵌合抗体，其 中，来自人抗体的恒定区被克隆至来自小鼠的轻链和重链可变区。在一 些情况下，保留70％的人序列。人源化抗体是嵌合抗体，其中，大概90％ 的人抗体框架被保留，并仅与鼠的互补决定区合并。本发明还涉及完全 人源化抗体。
可以使用已知技术提供重组的鼠抗体或嵌合鼠-人抗体或人-人抗体， 所述抗体与志贺氏菌IcsP2或SigA2氨基酸序列所包含的抗原表位结合。 参见，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编著， Wiley Interseience，N.Y.，1987，1992，1993)；Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press 1989)； EP0239400。
本发明的抗志贺氏菌IcsP2和SigA2抗体和/或肽可用于免疫测定法， 所述免疫测定法检测或定量样品中的志贺氏菌IcsP2和SigA2或抗志贺氏 菌IcsP2和SigA2抗体。志贺氏菌IcsP2和SigA2的免疫测定法典型地包 含：在可检测地标记的、本发明的高亲和力(或高亲合力)抗志贺氏菌 IcsP2或SigA2抗体或多肽存在的情况下，孵育临床或生物学样品，所述 抗志贺氏菌IcsP2或SigA2抗体或多肽能够选择性结合IcsP2特异性抗体 或SigA2特异性抗体；检测样品中结合的标记的肽或抗体。本领域公知 多种临床测定程序。参见，例如80年代的免疫测定法(Voller等人编著， University Park，1981)。所述样品包括组织血液、血清和粪便样品、或在 灌肠或口服轻泻剂溶液后采集自结肠直肠道的液体，并进行如下记载的 ELISA分析。
因而，可以将抗志贺氏菌IcsP2抗体或SigA2抗体或志贺氏菌IcsP2 和SigA2多肽固定至硝化纤维素或别的能够固定可溶性蛋白的固相支持 物。随后可以用适当缓冲液清洗所述固相支持物，接着用可检测地标记 的志贺氏菌IcsP2和SigA2特异性肽或抗体处理。然后，可以使用所述缓 冲液第二次清洗所述固相支持物，以除去未结合的肽或抗体。随后可以 通过已知方法步骤检测固相支持物上所结合的标记量。
“固相支持物”或“载体(carrier)”指能够结合肽、抗原或抗体的 任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙 烯、聚氟乙烯(PVDF)、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然纤维素和改性纤 维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖及磁铁矿。为达到本发明目的，所述载体的 性质可以是一定程度上可溶或不可溶的。只要偶联的分子能够与志贺氏 菌IcsP2和SigA2或抗志贺氏菌IcsP2或抗志贺氏菌SigA2抗体结合，所 述支持物材料可以具有实际上任何可能的结构构型。因而，所述支持物 构型可以是球体，如在珠中，或是圆柱体，如在试管内表面或棒的外表 面。或者，所述表面可以是扁平的，诸如薄片、培养皿、试验带等。例 如，支持物可以包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员会知晓许多其它的用 于结合抗体、肽或抗原的适当载体，或者能够借助常规试验来确定。
公知的方法步骤能够确定给定多种的抗志贺氏菌IcsP2和SigA2肽和 /或抗体的结合活性。本领域技术人员能够通过常规试验确定可行和最优 测定条件。
对志贺氏菌IcsP2特异性肽和/或抗体或SigA2特异性肽和/或抗体的 可检测地标记可以通过与酶的连接来完成，所述酶用于酶免疫测定法 (EIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。所连接的酶与暴露的底物反 应，生成可以通过例如分光光度测定手段、荧光光度测定手段或可视手 段检测的化学部分。可用于可检测地标记本发明的志贺氏菌IcsP2特异性 抗体和SigA2特异性抗体的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和 乙酰胆碱酯酶。
通过放射性标记所述志贺氏菌IcsP2特异性抗体和SigA2特异性抗 体，有可能利用放射免疫测定法(RIA)来检测志贺氏菌IcsP2和SigA2。 参见Work等人，LABORATORY TECHNIQUES & BIOCHEMISTRY IN MOLECULAR BIOLOGY(North Holland Publishing Co.，N.Y.(1978)。可以 通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或借助放射自显影术来检测 放射性同位素。特别利于本发明目的的同位素是3H、125I、131I、35S、14C 和125I。
还有可能利用荧光化合物标记志贺氏菌IcsP2特异性抗体和SigA2 特异性抗体。当荧光标记抗体被暴露于适当波长的光时，随后可通过荧 光而检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素、罗 丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
也可以使用发射荧光的金属(如125Eu或其它镧系元素)来可检测地 标记所述志贺氏菌IcsP2特异性抗体和SigA2特异性抗体。可以使用诸如 二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团 来使这些金属连接于志贺氏菌IcsP2特异性抗体和SigA2特异性抗体。
还可以通过偶联至化学发光化合物来可检测地标记所述志贺氏菌 IcsP2特异性抗体和SigA2特异性抗体。随后通过检测化学反应进程中产 生的发光的存在来确定化学发光标记抗体的存在。有用的化学发光标记 化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和 草酸酯。
同样地，可以使用生物发光化合物来标记本发明的志贺氏菌IcsP2特 异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物和SigA2特异性抗体、部分、片 段、多肽或衍生物。生物发光是生物系统中发现的化学发光类型，其中， 催化蛋白提高了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在而确定生物 发光蛋白的存在。重要的用于标记目的的生物发光化合物是荧光素、荧 光素酶和水母发光蛋白。
可以借助闪烁计数器(例如，如果可检测的标记是放射性γ辐射体) 或借助荧光计(例如，如果所述标记是荧光材料)来实现对志贺氏菌IcsP2 特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物和SigA2特异性抗体、部分、 片段、多肽或衍生物的检测。在酶标记的情况下，可以通过使用该酶底 物的比色方法来实现检测。还可以通过底物与类似制备的标准品的酶促 反应程度的视觉对比来实现检测。
为达到本发明的目的，借助以上测定法检测的所述志贺氏菌IcsP2和 SigA2可以存在于生物样品中。可以使用含有志贺氏菌IcsP2或SigA2的 任何样品。例如，所述样品是生物体液，例如血液、血清、尿液、粪便、 组织提取物或匀浆等。然而，本发明不限于仅使用这些样品的测定法， 因为本领域技术人员有可能确定允许使用其它样品的适当条件。
本发明的抗体、片段或衍生物可经改造，以用于又称作“双位点” 或“三明治”测定法的免疫测量法。在典型的免疫测量法中，一定量的 未标记抗体(或抗体片段)与在测试体液中不溶的固体支持物结合，添 加一定量的可检测地标记的可溶性抗体，以允许对固相抗体、抗原和标 记抗体间形成的三元复合物进行检测和/或定量。
典型的免疫测量法包括“正向”测定法，其中，结合至固相的抗体 首先与测试的样品接触，以通过形成二元固相抗体-志贺氏菌IcsP2或 SigA2复合物而从所述样品中提取含志贺氏菌IcsP2的蛋白或SigA2的蛋 白。在适当的孵育期后，清洗固体支持物，以除去包含(如有的话)未 反应的志贺氏菌IcsP2或SigA2的体液样品残余，随后与含有已知量的标 记抗体(作为“报告分子”发挥功能)的溶液接触。在第二孵育期后， 第二次清洗固体支持物，以除去未反应的标记抗体，所述第二孵育期允 许标记抗体与借助未标记抗体结合至固体支持物的志贺氏菌IcsP2或 SigA2复合。此类正向三明治测定法可用于确定志贺氏菌IcsP2和/或 SigA2是否存在，或能够通过比较标记抗体的量度与含有已知量的志贺氏 菌IcsP2和SigA2的标准样品获得的量度来使其定量化。Wide记载了所 述“双位点”或“三明治”测定法，Radioimmune Assay Methods，199-206 (Kirkham编著，Livingstone，Edinburgh，1970)。
志贺氏菌IcsP2和SigA2还可用的其它类型的“三明治”测定法是所 谓的“同时”和“反向”测定法。同时测定法涉及单一孵育步骤，其中， 结合至固相支持物的抗体和标记抗体被同时添加至测试样品中。完成孵 育后，清洗固相支持物，以除去体液样品残余和未复合的标记抗体。随 后，如常规三明治测定法那样，确定与固相支持物结合的标记抗体的存 在。
在“反向”测定法中，采用逐步添加，首先将标记抗体溶液添加至 体液样品中，接着在适当的孵育期后，添加与固相支持物结合的未标记 抗体。在第二次孵育后，以常规方式清洗固相，以清除测试样品残余和 未反应的标记抗体溶液。随后，如“同时”和“正向”测定法那样，测 定与固相支持物结合的标记抗体。在一种实施方式中，可以使用特异性 针对分离抗原表位的本发明的抗体组合，来构建灵敏的三位点免疫放射 计量测定法。
存在大量与本发明相符的本领域技术内的工具和技术，诸如常用于 分子免疫学、细胞免疫学、药理学和微生物学的那些工具和技术。所述 工具和技术详细记载于例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York；Ausubel等人编著(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons，Inc.：Hoboken，NJ；Bonifacino等 人编著(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wiley and Sons，Inc.： Hoboken，NJ；Coligan等人编著(2005)Current Protocols in Immunology， John Wiley and Sons，Inc.：Hoboken，NJ；Coico等人编著(2005)Current Protocols in Microbiology，John Wiley and Sons，Inc.：Hoboken，NJ；Coligan 等人编著(2005)Current Protocols in Protein Science，John Wiley and Sons， Inc.：Hoboken，NJ；以及Enna等人编著(2005)Current Protocols in Pharmacology，John Wiley and Sons，Inc.：Hoboken，NJ。
本说明书中的缩写词对应如下量度单位、技术、性质或化合物： “min”表示分钟，“h”表示小时，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“mM” 表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmole”表示毫摩尔，“kb”表 示千碱基，“bp”表示碱基对，“IU”表示国际单位。
“聚合酶链式反应”缩写成PCR；“反转录酶聚合酶链式反应”缩写 成RT-PCR；“非翻译区”缩写成UTR；“十二烷基硫酸钠”缩写成SDS； “高压液相色谱法”缩写成HPLC。
本文所使用的DNA的“扩增”表示利用聚合酶链式反应(PCR)提 高DNA序列混合物内特定DNA序列的浓度。关于PCR的说明，参见 Saiki等人，Science 1988，239：487。
“多核苷酸”或“核苷酸序列”是核酸(如DNA和RNA)中的一 系列核苷酸碱基(又称“核苷酸”)，表示任何两个以上核苷酸的链。核 苷酸序列通常携带遗传信息，包括细胞机器用以合成蛋白和酶的信息。 这些术语包括双链或单链的基因组和cDNA、RNA、任何合成的和遗传 操控的多核苷酸、以及正义和反义多核苷酸两者(虽然本文仅示出正义 链)。这包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA 杂合体，以及将碱基缀合至氨基酸骨架而形成的“蛋白核酸”(PNA)。 这还包括含有修饰碱基(例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟代尿嘧啶) 的核酸。
本文的核酸可以侧翼连接天然调节(表达控制)序列，或可以与异 源序列结合，所述异源序列包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES) 和其它核糖体结合位点序列、增强子、反应元件、抑制子、信号序列、 多聚腺苷酸化序列、内含子、5’非编码区和3’非编码区等。还可以通过 本领域已知的许多手段来修饰所述核酸。所述修饰的非限制性实例包括 甲基化、“加帽”、用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸和核苷酸 间修饰，诸如例如具有不带电的键的那些修饰(例如，膦酸甲酯、磷酸 三酯、磷酰化物、氨基甲酸酯等)和具有带电的键的那些修饰(例如， 硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可以含有一个或多个另外的共 价连接的部分，诸如例如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L- 赖氨酸等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放 射性金属、铁、氧化性金属等)和烷化剂。可以通过形成甲基磷酸三酯 或乙基磷酸三酯或烷基磷酰化物键而衍生所述多核苷酸。此外，还可以 用能够直接或间接提供可检测信号的标记来修饰本文的多核苷酸。示例 性标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
术语“核酸杂交”指两个单链核酸间的反向平行的氢键键合，其中， A与T(或者，如果是RNA核酸，则为U)配对，C与G配对。在确定 的严谨条件下，当一个核酸分子的至少一条链能与另一个核酸分子的互 补碱基形成氢键时，核酸分子相互之间是“可杂交的”。杂交的严谨性是 通过例如以下条件确定的：(i)进行杂交和/或清洗的温度，和(ii)离子 强度和(iii)杂交变性剂(如甲酰胺)和清洗溶液的浓度，以及其它参数。 杂交要求两条链含有基本互补的序列。然而，取决于杂交的严谨性，可 以容忍某种程度的错配。在“低严谨性”条件下，可以容忍更大百分比 的错配(即不会阻止反向平行杂合体的形成)。参见Molecular Biology of the Cell，Alberts等人，第三版，纽约和伦敦：Garland Publ.，1994，Ch.7。
典型地，高严谨性下两条链的杂交要求序列在其长度的延伸部分具 有高度互补性。高严谨性条件的实例包括：65℃下，在0.5M NaHPO4、 7％SDS、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，随后在68℃下，在 0.1×SSC/0.1％SDS(其中，1×SSC是0.15M NaCl、0.15M柠檬酸钠) 中清洗，或者对于寡核苷酸分子，在约37℃(对于14个核苷酸长的寡聚 物)，在约48℃(对于约17个核苷酸长的寡聚物)，在约55℃(对于20 个核苷酸长的寡聚物)，及在约60℃(对于23个核苷酸长的寡聚物)，在 6×SSC/0.5％焦磷酸钠中清洗。因而，术语“高严谨性杂交”是指溶剂和 温度的组合，其中，只有当两条链的核苷酸序列几乎完全互补时，两条 链才会配对形成“杂交”螺旋(参见Molecular Biology of the Cell，Alberts 等人，第三版，纽约和伦敦：Garland Publ.，1994，Ch.7)。
对于两个序列间发生的杂交，中等或中度严谨性条件(如，例如65℃ 下的2×SSC水溶液；或者，例如，在65℃下，在0.5M NaHPO4、7％SDS、 1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在42℃下，在0.2×SSC/0.1％ SDS中清洗)和低严谨性条件(如，例如55℃下的2×SSC水溶液)需 要相应较低的整体互补性。任何给定的严谨性杂交反应的具体温度和盐 条件取决于靶DNA浓度以及探针的长度及碱基组成，并且通常是在预实 验中凭经验确定的，而这些都是常规的(参见Southern，J.Mol.Biol.1975； 98：503；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二 版，vol.2，ch.9.50，CSH Laboratory Press，1989；Ausubel等人编著，1989， Current Protocols in Molecular Biology，Vol.I，Green Publishing Associates， Inc.和John Wiley & Sons，Inc.，New York，参见p.2.10.3)。
本文所使用的术语“标准杂交条件”指允许具有至少75％序列一致 性的序列杂交的杂交条件。根据具体的实施方式，较高严谨性的杂交条 件可以仅允许具有至少80％序列一致性、至少90％序列一致性、至少95％ 序列一致性或至少99％序列一致性的序列的杂交。
与本发明任何所期望的核酸“杂交”的核酸分子可以具有任何长度。 在一种实施方式中，所述核酸分子的长度为至少10个、至少15个、至 少20个、至少30个、至少40个、至少50个和至少70个核苷酸。在另 一种实施方式中，杂交的核酸分子具有与特定的所期望的核酸大致相同 的长度。
本文所使用的术语“分离的”表示将参比材料从通常发现它的环境 中移出。因而，分离的生物材料可以不含细胞组分(即发现或产生该材 料的细胞的组分)。分离的核酸分子包括，例如，PCR产物、分离的mRNA、 cDNA或限制性片段。分离的核酸分子还包括，例如，插入质粒、粘粒、 人工染色体等中的序列。优选地，将分离的核酸分子从可能发现它的基 因组中切断，更优选地，所述分离的核酸分子不再与非调节序列、非编 码序列、或在基因组内发现该核酸分子时位于其上游或下游的其它基因 相连。分离的蛋白可以与其它蛋白或核酸或两者结合，在细胞内该分离 的蛋白与所述其它蛋白或核酸结合，或者如果该分离的蛋白是膜结合蛋 白，则与细胞膜结合。
“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，所述个体细胞或细胞培 养物可以是或已是一个或多个载体的受体或用于引入多核苷酸分子的受 体。在本发明中，宿主细胞可以是细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵 母细胞。
状态(state)、病症(disorder)或状况(condition)的“治疗 (treating/treatment)”包括：
(1)预防或延缓哺乳动物中进展的所述状态、病症或状况的临床或 亚临床症状的出现，所述哺乳动物可能患有或易患所述状态、病症或状 况，但尚未经历或表现出所述状态、病症或状况的临床或亚临床症状； 或
(2)抑制所述状态、病症或状况，即停止、减少或减缓所述疾病的 进展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状； 或
(3)缓解所述疾病，即引起所述状态、病症或状况或者至少其中一 种临床或亚临床症状的消退。
对治疗受试者的益处在统计学上是显著的，或至少是患者或医师可 察觉的。
“免疫应答”指在宿主中发生对目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体 介导的免疫应答。所述应答通常由产生抗体的受试者、B细胞、辅助T 细胞和/或细胞毒T细胞构成，所述B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒T 细胞特异性针对目的组合物或疫苗中所含的一种或多种抗原。所述免疫 应答还可以包括调节T细胞，所述调节T细胞的活性超越目的生物体， 并可以抑制其它免疫应答或过敏反应。
“治疗有效量”表示当为对状态、病症或状况进行治疗而向哺乳动 物给予化合物、佐剂或疫苗组合物时，足以实现所述治疗的化合物、佐 剂或疫苗组合物的量。所述“治疗有效量”会根据以下因素而变化：所 给予的化合物、细菌或类似物；疾病和其严重性；以及待治疗哺乳动物 的年龄、体重、身体条件和应答性。
“预防有效量”指在必要的剂量下和经必要的时间，有效实现所期 望的预防结果的量。典型地，由于预防剂量是在疾病前或疾病早期用于 受试者，预防有效量会低于治疗有效量。
虽然有可能将本发明提供的组合物本身用于治疗，但是优选将其以 药物制剂的形式进行给药，例如与根据预计的给药途径和标准制药实践 选择的适当的药物赋形剂、稀释剂或载体的混合物的形式进行给药。因 而，一方面，本发明提供药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂包 含至少一种活性组合物或其药学上可接受的衍生物，并联合药学上可接 受的赋形剂、稀释剂和/或载体。就与制剂其它成分的相容性和对其接受 者无害而言，所述赋形剂、稀释剂和/或载体必须是“可接受的”。
本发明的组合物能以在人或牲畜药物使用中的任何方便的给药方式 进行制剂。因此，本发明在其范围内包括药物组合物，所述药物组合物 包含本发明的产物，该产物经改造用于人或牲畜药物。
在优选的实施方式中，以液体口服制剂的形式方便地给予所述药物 组合物。尽管对所述制剂的递送没有物理上的限制，但优选口服递送， 这是因为它简单便利，而且口服制剂容易接纳另外的混合物，如牛奶、 酸奶和婴儿配方奶粉。其它的口服剂型是本领域所公知的，包括片剂、 囊片、胶丸(gelcap)、胶囊剂和医用食品。例如，可使用湿法、干法或 流化床制粒法这些公知的压片技术制备片剂。
借助一种或多种适当的赋形剂、稀释剂和载体，能以方便的方式利 用所述口服制剂。药学上可接受的赋形剂辅助或使应用于生物活性材料 的剂型配制成为可能，药学上可接受的赋形剂包括稀释剂、粘合剂、润 滑剂、助流剂、崩解剂、着色剂和其它成分。所述药物组合物中可以提 供防腐剂、稳定剂、染料、甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、 抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。如果除发 挥赋形剂所期望的功能外，所述赋形剂还是无毒的、摄入时容易忍受并 且不干涉生物活性材料吸收的话，该赋形剂就是药学上可接受的。
用于治疗性用途的可接受的赋形剂、稀释剂和载体为制药领域所公 知，并且记载于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins(A.R.Gennaro编著，2005)。可以根据预计 的给药途径和标准制药实践选择药物赋形剂、稀释剂和载体。
本文所使用的短语“药学上可接受的”是指一般认为是生理学上可 容忍的分子实体和组合物。
“患者”或“受试者”指哺乳动物，包括人和牲畜受试者。
根据疾病性质、患者病史、给药频率、给药方式、宿主对药剂的清 除等，佐剂制剂或含有该佐剂的疫苗组合物的剂量会有很大变化。起始 剂量可以较大，随后采用较小的维持剂量。可以每月或每年偶尔给予所 述剂量，以维持有效的免疫记忆。
术语“载体(carrier)”指与所述化合物一同给予的稀释剂、佐剂、 赋形剂或媒介。所述药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油； 动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻 油等。优选使用水或生理盐水溶液以及水性的葡萄糖和甘油溶液作为载 体，特别是用于可注射溶液的载体。或者，所述载体可以是固体剂型载 体，包括但不限于粘合剂(用于压缩药丸)、助流剂、包封剂、调味剂和 着色剂中的一种或多种。合适的药物载体记载于E.W.Martin的 “Remington′s Pharmaceutical Sciences”。
本发明还包括药物组合物和疫苗。本发明的药物组合物和疫苗组合 物包括至少一种新型志贺氏菌抗原、一种或多种佐剂以及药学上可接受 的载体或赋形剂。如以上Remington一书所记载的，配制药物组合物和 疫苗的方法为本领域普通技术人员所公知。
制剂。本发明的组合物可以包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、 增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。所述组合物包括多种缓冲液成分(例 如Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)的稀释剂、pH的稀释剂和离子强度的稀 释剂；诸如去垢剂和增溶剂(例如吐温80、聚山梨醇酯-80)、抗氧化剂 (例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞(Thimersol)、苯 甲醇)和膨胀物质(例如乳糖、甘露醇)这些添加剂；将所述材料引入 聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸等)制品或引入脂质体。还可以使用 透明质酸。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版， (1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)第1435-1712页，通过引 用将其并入本文。
预期用于本文的是口服固体剂型，所述口服固体剂型概括地记载于 Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990(Mack Publishing Co. Easton PA 18042)第89章，通过引用将其并入本文。固体剂型包括片剂、 胶囊剂、丸剂、锭剂或糖锭、扁囊剂、小丸剂(pellets)、粉剂或颗粒剂。 另外，还可以使用脂质体或类蛋白包囊以配制本组合物(如，例如美国 专利第4,925,673号所报道的类蛋白微球)。可以使用脂质体包囊，并可 以用多种多聚物使脂质体衍生化(例如，美国专利第5,013,556号)。 Marshall，K.在：Modern Pharmaceutics(G.S.Banker和CT.Rhodes编著) 第10章，1979中给出了用于治疗的可能的固体剂型的说明，通过引用将 其并入本文。通常，所述制剂会包含治疗剂以及惰性成分，所述惰性成 分能够抵御胃部环境，并在肠中释放生物活性材料。
预期用于本文的还有用于口服给药的液体剂型，所述液体剂型包括 药学上可接受的乳剂、溶液剂、悬浮剂和糖浆剂，所述液体剂型可以含 有其它组分，包括惰性稀释剂；佐剂、润湿剂、乳化剂和助悬剂；以及 甜味剂、调味剂、着色剂和芳香剂(perfuming agents)。
对于口服制剂，释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠(jejunem) 或回肠)或大肠。本领域技术人员可获得如下制剂，所述制剂例如借助 肠包衣而不会在胃中溶解，但会在十二指肠或肠的其它处释放该材料。 更常见的用作肠包衣的惰性成分的实例为偏苯三酸醋酸纤维素(cellulose acetate trimellitate(CAT))、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、 HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、尤特奇 (Eudragit)L30D、Aquateric、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、尤特奇 L、尤特奇S和虫胶。所述包衣可以用作混合膜。
包衣或包衣混合物还可以用于片剂，其并非意在提供针对胃的保护。 这可以包括糖包衣或使片剂较易吞咽的包衣。胶囊可以由硬壳(诸如明 胶)构成以递送干治疗剂(即粉末)；对于液体形式，可以使用软明胶壳。 扁囊剂的壳材料可以是稠淀粉或其它可食性纸。对于丸剂、糖锭、模印 片剂或研制片剂(tablet triturate)，可以使用湿块化技术(moist massing techniques)。用于胶囊给药的材料制剂还可以是粉末、轻压塞或甚至片剂。 所述治疗剂可以通过压缩制备。
可以利用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可以包括 碳水化合物，尤其是甘露醇、D-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性 葡聚糖和淀粉。某些无机盐还可以用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁 和氯化钠。一些可商购的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、 Emcompress和Avicell。
将所述治疗剂配制为固体剂型时，可以包含崩解剂。用作崩解剂的 材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂Explotab、羧甲淀 粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉 (ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、桔皮、酸性羧甲基纤维素、天然海 棉和膨润土都可以使用。崩解剂还可以是不溶的阳离子交换树脂。粉状 树胶可以用作崩解剂和用作粘合剂，可以包括如琼脂、刺梧桐树胶或黄 芪胶的粉状树胶。褐藻酸及其钠盐也可以用作崩解剂。粘合剂可以用来 将所述治疗剂保持在一起，从而形成硬的片剂，所述粘合剂包含来自天 然产物的物质，诸如阿拉伯树胶、黄芪胶、淀粉和明胶。其它粘合剂包 括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙甲基纤维素(HPMC)均可以用于醇溶液中， 以粒化所述肽(或衍生物)。
制剂中可以包含减摩剂以防止制剂过程中的黏结。润滑剂可用作肽 (或衍生物)和模壁间的层，这些润滑剂可以包括但不限于硬脂酸(包 括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。还可 以使用可溶性润滑剂，诸如月桂烷硫酸钠、月桂烷硫酸镁、多种分子量 的聚乙二醇(Carbowax 4000和6000)。
可添加助流剂，所述助流剂可能提高制剂期间的药物流动特性并在 压制期间帮助重排。所述助流剂可以包括淀粉、滑石、热解硅石和水合 硅铝酸盐。
为促进治疗剂溶解到水环境中，可以添加表面活性剂作为润湿剂。 表面活性剂可以包括阴离子去垢剂，诸如月桂烷硫酸钠、二辛基硫化琥 珀酸钠和二辛基磺酸钠。可以使用阳离子去垢剂，阳离子去垢剂可以包 括苯扎氯胺或苄索氯铵。制剂中可以含有潜在的非离子去垢剂作为表面 活性剂，所述非离子去垢剂是聚桂醇400；聚乙二醇(40)硬脂酸酯；聚 氧乙烯(10)氢化蓖麻油、聚氧乙烯(50)氢化蓖麻油、聚氧乙烯(60) 氢化蓖麻油；单硬脂酸甘油酯；聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨 醇酯-65和聚山梨醇酯-80；蔗糖脂肪酸酯；甲基纤维素和羧甲基纤维素。 所述表面活性剂可以单独或作为不同比例的混合物而存在于蛋白制剂或 衍生物制剂中。
控释口服制剂可用于实施本发明。可以将治疗剂并入惰性基质(例 如树胶)内，所述惰性基质通过扩散或浸出机制使治疗剂释放。所述制 剂中也可以加入缓慢降解基质。一些肠包衣还具有延迟释放作用。另一 种形式的控释借助基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即将所述治 疗剂包封在半透膜中，由于渗透压作用，所述半透膜允许水进入并通过 单个小开口将药剂推出。
可以将其它包衣用于制剂。这些制剂包括可以应用于包衣锅的多种 糖。还可以在膜包衣片剂中提供所述治疗剂，用于这种情况的材料被分 为两组。第一组是非肠溶材料，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基 纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲 基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇。第二组由肠溶材料构成，所述肠溶材 料通常是邻苯二甲酸酯。可以使用混合材料以提供最优膜包衣。膜包衣 可以在包衣锅或在流化床中进行，或通过压缩包衣进行。
在一种实施方式中，将本发明所公开的志贺氏菌多肽抗原与药学上 可接受的稀释剂一起给药。可以通过注射(皮下、皮内、肌内)或使用 粘贴片局部施用至皮肤上来给予这样的制剂。或者，使用药学上可接受 的媒介，通过粘膜途径(口服途径、含服途径、舌下途径、滴鼻剂、气 雾剂、直肠途径)给予所述疫苗。还可以将所述抗原与佐剂混合以增强 随后发生的免疫应答。所述佐剂的实例非限制性地是铝盐、ISCOM、基 于皂角苷的佐剂、水包油型和油包水型乳状液、Toll样受体配体(如胞 壁酰二肽)、大肠杆菌LPS、由非甲基化DNA组成的寡核苷酸、多聚I:C、 脂磷壁酸、肽聚糖。肠毒素和它们的佐剂活性衍生物，诸如霍乱毒素、 大肠杆菌不耐热肠毒素、百日咳毒素、志贺毒素和类似物。
用于肠胃外给药的本发明的制剂包括无菌的水溶液剂或非水溶液 剂、悬浮剂或乳剂。非水溶剂或媒介的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物 油(如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射有机酯(如油酸乙酯)。所述剂 型还可以包含佐剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过例如 以下方式对所述药物组合物灭菌：细菌滤器(bacteria retaining filter)的 过滤、在所述组合物中加入灭菌剂、对所述组合物进行辐照、或加热所 述组合物。还可以在即将使用前用无菌水或其它一些无菌的可注射介质 来制备所述药物组合物。
疫苗。就疫苗而言，常观察到的是，在无佐剂的情况下，单独利用 抗原的初次攻击将无法引发体液或细胞免疫应答。因而，本发明的疫苗 可以包含佐剂，所述佐剂包括但不限于霍乱毒素、具有佐剂性质的片段 和突变体或衍生物；大肠杆菌不耐热肠毒素、具有佐剂性质的片段和突 变体或衍生物；水包油型和油包水型乳状液；Toll样受体配体(如胞壁 酰二肽)；大肠杆菌LPS；由非甲基化DNA组成的寡核苷酸；多聚I:C； 脂磷壁酸；肽聚糖。肠毒素和它们的佐剂活性衍生物，诸如霍乱毒素、 大肠杆菌不耐热肠毒素、百日咳毒素、志贺毒素和类似物。可以使用其 它佐剂，诸如完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂角苷、矿物凝胶(如 氢氧化铝)、表面活性物质(诸如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、 肽、油或烃乳状液、钥孔嘁血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanins)和可 能的有用的人的佐剂，诸如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰 胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙 酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙胺酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn- 丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌 (Corynebacterium parvum)。佐剂可以作为缓释抗原的组织库，还可以作 为非特异性增强免疫应答的淋巴系统活化剂(Hood等人，Immunology，第 二版，1984，Benjamin/Cummings：Menlo Park，California，p.384)。当疫苗 计划用于人受试者时，所述佐剂应当是药学上可接受的。
给药。所述药物组合物或疫苗可以用于口服(固体或液体)、肠胃外 (肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、经皮(被动地或使用离子 电泳或电穿孔)、经粘膜(鼻、阴道、直肠或舌下的)给药，或吸入给药 途径，或使用可生物蚀解的嵌入物，所述药物组合物或疫苗可制剂成适 于各种给药途径的剂型。
在一种优选的实施方式中，通过肺递送进行所述组合物或疫苗的给 药。所述组合物或疫苗在吸入时被递送至哺乳动物的肺，并穿过肺上皮 内层到达血流(参见，例如Adjei等人，Pharmaceutical Research 1990； 7：565-569；Adjei等人，Int.J.Pharmaceutics 1990；63：135-144(醋酸亮丙 瑞林)；Braquet等人，J.Cardiovascular Pharmacology 1989；13(sup5)： 143-146(内皮素-1)；Hubbard等人，(1989)Annals of Internal Medicine，Vol. III，pp.206-212(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等人，J.Clin.Invest.1989；84： 1145-1146(α-1-蛋白酶)；Oswein等人，″Aerosolization of Proteins″，1990； Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone， Colorado(重组人生长激素)；Debs等人，J.Immunol.1988；140：3482-3488 (干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)；和Platz等人的美国专利第5,284,656号 (粒细胞集落刺激因子)。Wong等人的美国专利第5,451,569号记载了用 于全身作用的肺部递送药物的方法和组合物。另见Licalsi等人的U.S. 6,651,655。
预期用于实施本发明的是设计用于治疗性产品的肺部递送的多种机 械装置，包括但不限于喷雾器、计量剂量吸入器和药粉吸入器，其均为 本领域技术人员所熟悉。适于实施本发明的可商购装置的一些具体实例 是Ultravent喷雾器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)；Acorn II喷雾器 (Marquest Medical Products，Englewood，CO)；舒喘灵计量剂量吸入器 (Glaxo Inc.，Research Triangle Park，NC)；和Spinhaler药粉吸入器 (Fisons Corp.，Bedford，MA)。所有这类装置都需要使用适于治疗剂分配 的制剂。典型地，各制剂都特异针对所用装置的类型，并且除常见的可 用于治疗的稀释剂、佐剂、表面活性剂和/或载体之外，可包含适当的推 进剂材料的使用。另外，脂质体、微胶囊或微球、包合物或其它类型的 载体的使用也在预期中。
用于计量剂量吸入器装置的制剂通常会包含细碎粉末，所述细碎粉 末含有借助表面活性剂悬浮于推进剂中的治疗剂。所述推进剂可以是用 于该目的的任何常规材料，诸如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括 三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组 合。适当的表面活性剂包括三油酸山梨酯和大豆卵磷脂。还可将油酸用 作表面活性剂。
用于自药粉吸入器装置分配的制剂会包含含有治疗剂的细碎干粉， 并且还可以包含膨胀剂，诸如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露醇，所述膨 胀剂的量促进粉末从所述装置分散，例如为所述制剂重量的50％-90％。 为最有效地递送至远端肺，治疗剂应最有利地以微粒形式制备，所述微 粒形式的粒径小于10mm(或微米)、最优选0.5mm-5mm。
治疗剂的鼻或其它粘膜递送也在预期中。鼻递送允许在将组合物给 予鼻内之后，直接进入血液，而无需该产品在肺中沉积。用于鼻递送的 制剂包括将葡聚糖或环葡聚糖和皂角苷用作佐剂的制剂。
本发明的组合物或疫苗可以与一种或多种另外的活性成分、药物组 合物或疫苗联合给药。本发明的治疗剂可以对动物给药、优选为哺乳动 物、最优选为人。
剂量
按照本领域建立完善的方法学，随后使用小动物模型(例如小鼠或 大鼠)在临床前研究中确定在体外测试中表现良好的本发明的化合物和 组合物的有效剂量和毒性。在所述小动物模型中，已发现志贺氏菌抗原、 多肽、药物或疫苗组合物是治疗有效的，并且在所述小动物模型中，能 够通过针对人临床试验提出的相同途径来给予这些药物。
用于本发明的制剂或剂型无需含有本文公开的治疗有效量的组分， 因为所述治疗有效量可以通过给予多个所述制剂或剂型来实现。
对于用于本发明方法的任何药物组合物，可以由动物模型初步估计 治疗有效剂量。由动物系统获得的剂量-应答曲线随后被用于确定人最初 临床研究的测试剂量。在各组合物的安全性测定中，给药剂量和频率应 达到或超过预期用于临床试验的剂量和频率。
如本文所述，确定本发明组合物中组分的剂量，以确保连续或间歇 给予的剂量不会超过考虑了试验动物中的结果和患者个体情况后确定的 量。具体剂量自然依剂量步骤、患者或受试动物的情况(如年龄、体重、 性别、敏感性)、喂食、剂量期、联用的药物和疾病严重性而变化。某些 条件下的适当剂量和给药次数可以通过基于上述指标的测试来确定，但 可以根据标准的临床技术，依照医师的判断和各患者情况(年龄、全身 情况、症状严重性、性别等)来改良并最终确定。
可以通过实验动物的标准药学步骤、例如通过确定LD50(导致50％ 群体死亡的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)确定本发明 组合物的毒性和疗效。疗效和毒性作用间的剂量比是治疗指标，它可以 表示为ED50/LD50的比例。优选显示出较高治疗指标的组合物。
动物研究中得到的数据可用于配制人用的一系列剂量。优选地，人 的治疗有效剂量在一系列循环浓度范围内，所述循环浓度范围包括基本 无毒或无毒的ED50。该剂量可以依所用剂型和给药途径而在该范围内变 化。理想地，应每日使用单一剂量的每种药物。
下面记载了实施例1-14所用的材料和方法。
材料和方法
志贺氏菌SigA2和Icsp2多肽的克隆、表达和纯化
如上所述(37)，可获得所述蛋白抗原的DNA序列。从基因库登录 号[Genbank AE014073]获得弗氏志贺氏菌2a菌株2457T的SigA DNA序 列。从基因库登录号[Genbank AL391753]获得弗氏志贺氏菌5a菌株M90T 的icsP的DNA序列。不同种的志贺氏菌间的核苷酸一致性和氨基酸序 列同源性超过99％。将DNA片段插入可商购的大肠杆菌过表达质粒 pET21d(Novagen，Gibbstown，NJ，USA)，并根据制造商的说明，使用 TALON金属亲和树脂(Clontech，Mountain View，CA，USA)进行纯化。 引物
当IcsP2片段来自弗氏志贺氏菌2a 2457T菌株时，用IcsP2引物组 CCGGAATTCGGAGTGAAAACGGGGGGAGC和CGGCGGCTCGAGCTA GTGGTGGTGGTGGTGGTGAATACTTGCACTATTTTT进行扩增。利用 EcoRI和XhoI消化扩增片段(序列编号1，390bp，加下划线的序列)(如 图12所示，方框内的序列)。
用SigA2引物组CCCGGGGAATTCGGGAAAAAGCCTTCAATAAAA和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTGAAACTACTTTCGCCTG扩增弗氏志贺氏菌2a 2457T菌株的SigA2片段。利用EcoRI 和XhoI消化扩增片段(序列编号3，795bp，加下划线的序列)(如图13 所示，方框内的序列)。
将所扩增的IcsP2片段和SigA2片段插入pET21d的EcoRI和XhoI 位点，利用测序来验证重组DNA。用各重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)(Novagen，Gibbstown，NJ，USA)细菌，在37℃下通过培养基中 的0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导蛋白过表达。收集过 表达各片段的大肠杆菌BL21(DE3)，在6M尿素存在的情况下，通过冻 /融后再超声将其破碎。以12,000×g的速度对大肠杆菌提取物进行离心 处理，并将上清液上样至利用1×结合缓冲液：20mM TrisCl pH 7.9，500 mM NaCl，5mM咪唑和6M尿素进行过预平衡的TALON树脂柱(3ml)。 用20ml的1×结合缓冲液和30ml的1×清洗缓冲液(20mM TrisCl pH 7.9，500mM NaCl，15mM咪唑和6M尿素)清洗柱，再用1×洗脱缓 冲液(20mM TrisCl pH 7.9，500mM NaCl，250mM咪唑)将蛋白洗脱。
如上所述，还亚克隆了IcsP的另一个片段(引物组 CCCGGGGAATTCACCACTAACTATCCACTTTT和CGGCGGCTCGAGC TAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACTGTAACGACTCTCTTGGTA)。
icsP和sigA基因破坏突变体菌株(弗氏志贺氏菌2a 2457T本底)的 构建：使用等位基因交换法(17)单独构建icsP和sigA基因破坏突变体 菌株。简言之，利用用于icsA片段的引物Ics5Tr/Ics3Tr(5′-GGC TCT AGA ACCACTAACTATCCACTT-3′/5′-GCC GAA TTC CCA GCT CTG GTC GGT CCA-3′)和用于sigA片段的引物Sig5Tr/Sig3Tr(5′-GGC TCT AGA GAA CTG ACC CGG AAA GTT AGT-3′/5′-GCC GAA TTC GTA CGC ACC TCC TAA TGA-3′)，扩增icsP和sigA的内部300nt DNA片段(核苷酸 61-360)。将所述片段插入自杀质粒pSW23.oriT。将重组质粒pSWicsPTr 和pSEsigATr用于转化大肠杆菌菌株BW19610(pir+ AmpS Cmr)。从 BW19610中纯化各质粒，用于转化大肠杆菌SM10λpir(pir+ Tra+ AmpS Cmr)。将大肠杆菌SM10λpir与弗氏志贺氏菌2a 2457T接合，并在刚果 红/链霉素/氯霉素平板上分离耐氯霉素弗氏志贺氏菌。在各敲除菌株中， 将毒力质粒和基因组上的基因分为2种片段，3’末端片段和360个核苷酸 的5’末端片段。通过PCR和测序验证突变体菌株上各基因的破坏。将各 菌株用于攻击免疫接种过的小鼠。
如上所述，使用如下引物组，还纯化了SigA蛋白的三种其它片段： SigA1片段引物组：CCCGGGGAATTCGGTATGGCGAAACAGCATTTGC和CGGCGGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCTTGTTTTTTACCATCCA(利用EcoRI和XhoI的824bp片段)，SigA3片段引物组 CCGGGGAAGCTTGACCCCTACAGAAAATAATA和CGGCGGCTCGA GCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGCCATTGGTGTCACGCA(利用 HindIII和XhoI的822bp片段)，以及SigA4片段引物组 CCCGGGGAATTCGGGATAAAAAACATGAGCTGG和CGGCGGCTCGA GCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAAAGAGTAACGGAAGTTGG(利用 EcoRI和XhoI的702bp片段)。如上所述，过表达并纯化这些片段。SigA1 片段显示出免疫原性但未表现出保护作用，而SigA3和SigA4片段没有 在小鼠中引发抗体应答。所有引物均购自Genotech，大田，韩国。
细菌菌株
弗氏志贺氏菌2a菌株2457T和弗氏志贺氏菌5a菌株M90T由 Philippe Sansonetti博士，Institut Pasteur，巴黎，法国提供。
鲍氏志贺氏菌(IB8295)血清型1：从2002年在巴基斯坦采集的志 贺氏菌病患者获得(IVI采集)。
宋内志贺氏菌(IB4200)：从G.B.Nair博士(NICED，印度)于2004 年在印度采集的志贺氏菌病患者获得。
痢疾志贺氏菌血清型1：由D.Kopecko博士(FDA，Bethesda，MD， USA)提供。
动物免疫接种
在国际疫苗研究所(the International Vaccine Institute)的动物看护中 心(首尔)，依据国际准则，在无特定病原体的条件下饲养所有动物，国 际疫苗研究所动物实验伦理委员会批准了本文所述的全部实验。
为达到本发明目的，将免疫佐剂定义为“与特定疫苗抗原联用时， 能够发挥促进、延长或加强抗原特异性免疫应答作用的任何物质”(The Use of Conventional Immunologic Adjuvants in DNA Vaccine Preparations， Shin Sasaki和Kenji Okuda；D.B.Lowrie和R.G.Whalen(编者)，DNA Vaccines：Methods and Protocols，Humana Press，2000.ISBN 978-0-89603-580-5)以及“用以帮助增强对疫苗的免疫应答从而只需要较 少疫苗的物质”(佐剂的定义，国家癌症研究所； www.cancer.gov/templates/db_alpha.aspx？CdrID＝43987)。与抗原共给药 时，霍乱毒素、含有未甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)和 铝盐为已知佐剂。
通过多种途径给予蛋白抗原，免疫接种5-6周龄雌性Balb/c小鼠。 剂量：对于各免疫接种，在等渗的、无热原磷酸盐缓冲液pH7.4(PBS) 中，将25μg剂量的蛋白抗原与佐剂混合。所述佐剂由霍乱毒素(CT)(每 剂量3-5微克(μg))、CpG ODN(每剂量4μg)或氢氧化铝(alum)组 成。
腹膜内给药
通过总体积0.2ml的PBS的腹膜内注射，给予25μg的蛋白抗原， 并给予或不给予佐剂。对小鼠免疫接种3次，以2周为间隔。
鼻内给药
将25μg蛋白抗原与3μg霍乱毒素(CT)混合，并通过各鼻孔以50 微升的总体积(每鼻孔约25微升)给药。2周和4周后，在相同条件下 对小鼠再次免疫接种。
直肠给药
将100μg蛋白抗原与CT(5微克)混合，用插入肛门直肠口的移液 管，以0.2毫升的终体积给药。免疫接种豚鼠3次，各免疫接种间间隔2 周。
志贺氏菌病的动物模型
小鼠肺炎模型：将50微升PBS中的2×107CFU弗氏志贺氏菌2a菌 株2457T接种到免疫接种的小鼠鼻孔内。每日监视动物，持续10天。另 外，将弗氏志贺氏菌5a菌株M90T和痢疾志贺氏菌1菌株用于攻击实验。
豚鼠角膜结膜炎模型：在以CT作为佐剂的志贺氏菌蛋白抗原的3 次连续免疫接种中的最后一次的一周后，麻醉豚鼠，并在豚鼠的眼结膜 囊中滴注1×105cfu/20μl的弗氏志贺氏菌2a菌株2457T。每日监视眼周 症状，持续4-5天。为了与全身性免疫比较，通过腹膜内途径给予50μg 的蛋白和3μg的CT三次，以两周为间隔，并且在所述最后一次免疫接 种一周后，攻击免疫接种的豚鼠。
豚鼠结肠炎模型：用最近开发的肠志贺氏菌病模型(30)来评价本 发明公开的新志贺氏菌常见蛋白抗原的保护性功效。简言之，如Shim， Suzuki，Chang等人(30)所记载的，通过肛门直肠口滴注，对5周龄豚 鼠给予弗氏志贺氏菌2a 2457T(1×109CFU)或弗氏志贺氏菌5a菌株 M90T。每日检查动物的痢疾症状(腹泻、里急后重(tenesmus))，随后 通过过量的戊巴比妥处死动物，此后对结肠组织样本进行组织学分析。 对志贺氏菌常见蛋白抗原的全身免疫应答和粘膜免疫应答的测量
生物体液采集
在第一次免疫接种一周前、此后在每次免疫接种一周后，采集血清 和分泌物(唾液、阴道洗液和直肠洗液)。
器官提取物的制备和细胞悬液的分离
最后一次免疫接种一周后，用戊巴比妥麻醉小鼠，腹膜内注射0.2ml 盐水中的125i.u.肝素(SIGMA，MO，USA)。直接从心脏抽血，并通过断 颈法处死小鼠。将15ml含有肝素(10i.u./ml)的PBS注射进心脏右心 室对小鼠进行灌注，直至肺膨胀并变得清晰。使用胶原酶A(0.5mg/ml) (Roche)，在添加DNase 1(0.1mg/ml)(Roche)的RPMI培养基(Gibco Europe，U.K.)中，将细切的肺片于37℃消化30min，并通过细胞滤网 的过滤收集单细胞悬液。通过将器官挤压通过尼龙筛，获得来自脾的单 细胞悬液。利用氯化铵的处理除去所有悬液中的红细胞，清洗所有悬液， 将其重悬于含有5％FBS的RPMI培养基中，并将其储于冰上，直至借助 如下所述ELISPOT测定法对其进行测定(30分钟内)。
为制备无细胞的器官提取物，使用PERFEXT技术(34)。从灌注动 物切除肺，并将其切成小片(2-3mm厚)，并在37℃下，在含有肝素的 PBS中持续搅拌地孵育30分钟而进一步灌注。通过离心(500rpm，3分 钟)使所述小片粒化，并重悬于提取缓冲液中，所述提取缓冲液由Triton X100、PMSF和蛋白酶抑制剂组成(34)。在液氮中速冻样品，并将其储 存在-70℃。使用前，室温融化样品并离心(2000rpm，5分钟)。收集上 清液，并借助如下所述的ELISA方法测定其特异性的抗体活性。
抗体ELISA(酶联免疫吸附测定法)
通过标准固相酶联免疫吸附测定法(ELISA)评估血清、分泌物和组 织PERFEXT提取物中针对志贺氏菌常见蛋白抗原的抗体的水平。使用每 一种蛋白包被聚苯乙烯96孔板(NUNC，丹麦)的各个孔(每ml PBS 1 微克；每孔0.1ml；环境温度下过夜孵育)，利用处于含0.05％吐温20的 PBS中的5％(体积/体积)脱脂乳，将孔封闭(每孔0.2ml；环境温度下 30分钟)，并用PBS-吐温清洗3次。在环境温度下，在含5％脱脂乳的 PBS-吐温溶液中，将样品的2倍连续稀释物在包被抗原的孔中孵育2小 时，并且用PBS-吐温将板清洗三次以移除未结合的抗体。接下来，向各 孔中添加0.1ml含有适当稀释(1/5000)的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗 小鼠IgA或IgG抗体(Southern Biotechnology，Birmingham，AL，USA)的 PBS-吐温。随后用PBS清洗板三次，并在添加生色酶底物后，监测酶结 合活性。通过添加50μl的0.5N H2SO4终止显色，并用ELISA读出器进 行分光光度法(O.D450)测定。数据表示为几何平均抗体效价，该效价被 定义为产生等于或高于添加的对照(无样品)的吸光率数值的样品的最 高稀释度的倒数。
ELISPOT测定法：借助酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法(4)，测 定产生志贺氏菌蛋白抗原的特异性抗体的细胞频率。为进行比较，使用 时确定了产生霍乱毒素(CT)的抗体的细胞频率。简言之，将PBS稀释 的10μg霍乱毒素、50μg sigA2和100μg sigA2蛋白加入硝化纤维素铺 底的96孔HA板(Millipore，Bedford，USA)的各孔中。4℃过夜孵育后， 使用PBS清洗每一个孔，并用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养 基(GIBCO，UK)将其封闭。在含有FBS的RPMI培养基中，以连续2 倍稀释(起始于每孔800,000个单核细胞)孵育来自免疫接种小鼠的肺和 脾细胞悬液。37℃下孵育4小时后，用PBS将各孔清洗5次，再用含有 0.05％吐温20的PBS清洗各孔5次，随后在室温下将其暴露于0.1ml PBS- 吐温1小时，所述PBS-吐温含有辣根过氧化物酶缀合的小鼠IgG或小鼠 IgA的山羊抗体(1∶1000稀释)。在用PBS-吐温清洗3次并用PBS清洗 4次后，将孔暴露于显色底物10-20分钟，直至出现斑点。随后用流动的 自来水清洗板并干燥。接着使用立体显微镜对斑点计数。数据表示为校 正至1百万个细胞的斑点形成细胞(SFC)的数量。
实施例1
用IcsP2粘膜免疫接种保护的小鼠免受弗氏志贺氏菌2a诱导的肺炎
如上所述，通过鼻内途径，使用连同CT一起提供的IcsP2对小鼠进 行免疫接种。利用致死剂量的弗氏志贺氏菌2a菌株2457T攻击动物。图 1的结果表明，受IcsP蛋白免疫接种保护的动物免受使用弗氏志贺氏菌 2a的肺攻击。根据图1所示结果，活的减毒弗氏志贺氏菌疫苗菌株 (SC602)的鼻内给药也保护小鼠免受攻击。
实施例2
利用IcsP2的粘膜免疫接种保护小鼠免受弗氏志贺氏菌不同血清型诱导 的肺炎
如上所述，通过鼻内途径，使用连同CT一起提供的IcsP2免疫接种 小鼠。利用致死剂量的弗氏志贺氏菌5a菌株M90T(50μl中含2×107CFU)攻击动物。图2的结果表明，IcsP蛋白的免疫接种保护动物免受 使用弗氏志贺氏菌5a的肺攻击。相反，活的减毒弗氏志贺氏菌2a菌株 (SC602)的鼻内给药无法保护小鼠免受属于不同(5a)血清型的志贺氏 菌菌株的攻击(如图2实心方块总结的结果所示)。
实施例3
利用IcsP2的粘膜免疫接种保护小鼠免受痢疾志贺氏菌诱导的肺炎
如上所述，通过鼻内途径，使用连同CT一起提供的IcsP2免疫接种 小鼠。利用致死剂量的1型痢疾志贺氏菌(菌株由D.Kopecko博士提供， FDA，Bethesda，MD，USA)攻击动物。
图3所示的结果证明，当已利用IcsP2免疫接种动物时，所述动物得 到保护而免受另一志贺氏菌种(即1型痢疾志贺氏菌)的攻击。相反， 弗氏志贺氏菌2a的活的减毒菌株SC602无法保护小鼠免受使用1型痢疾 志贺氏菌的致死肺攻击。
根据以上实验，可以得出结论，IcsP2不仅提供针对不同血清型的弗 氏志贺氏菌的粘膜感染的保护，还提供针对诸如痢疾志贺氏菌的不同种 志贺氏菌所造成的感染的保护。
实施例4
利用SigA2的粘膜免疫接种抵抗弗氏志贺氏菌2a(2457T)的攻击，但 不抵抗弗氏志贺氏菌5a(M90T)的攻击
已知SigA蛋白仅仅存在于弗氏志贺氏菌2a，而不存在于弗氏志贺氏 菌的其它血清型中(1)。使用致死剂量的弗氏志贺氏菌2a(2457T，实心 圆)和弗氏志贺氏菌5a(M90T，实心方块)攻击利用SigA2蛋白免疫接 种的小鼠。利用2457T攻击的小鼠表现出80％的存活率，而利用弗氏志 贺氏菌攻击的小鼠死于细菌诱导的肺炎。利用PBS免疫接种的小鼠显示 两种菌株2457T(图4中的空心圆)和M90T(图4中的空心方块)引起 了100％死亡。
实施例5
利用IcsP2的免疫接种提供抵抗实验性角膜结膜炎的保护
如上所述，使用IcsP2免疫接种的豚鼠和对照(使用PBS伪(sham) 免疫接种)。在3次连续免疫中最后一次的一周后攻击动物，所述连续免 疫利用1×105集落形成单位的毒力弗氏志贺氏菌2a 2457T，通过鼻内或 腹膜内途径给予IcsP2和CT佐剂。随后，在攻击24小时和48小时时， 检查豚鼠的眼部炎症(角膜结膜炎)的迹象和强度。没有可检测到的炎 症的动物被认为是受保护的。由下表1可见，40％-50％的鼻内或腹膜内 途径给药的IcsP2免疫接种的动物受保护而免于志贺氏菌诱导的角膜结 膜炎，但是对照动物(用PBS处理)均表现出角膜结膜炎。
表1
*保护性功效：受保护动物的百分比
实施例6
利用IcsP2 SigA2的免疫接种提供抗志贺氏菌诱导的实验性直肠结肠炎 的保护
使用具有1×109CFU接种物的毒力弗氏志贺氏菌2a菌株2457T攻 击用IcsP2、SigA2、SC602和PBS免疫接种的豚鼠，并在接种24小时后， 检查所述豚鼠的腹泻、结肠出血和里急后重频率。由表2可见，所有对 照(PBS处理的)动物发生直肠结肠黏膜出血，其中的大部分发生腹泻 (缺乏固体粪便)并表现出排便费力、也称直肠里急后重的迹象。相反， 用SigA2免疫接种的动物没有直肠结肠炎的迹象，但表现出里急后重。 已用活的减毒弗氏志贺氏菌2a菌株SC602免疫接种的动物受保护而抗毒 力弗氏志贺氏菌2a(菌株2457T)的攻击。最重要的是，已用纯化的IcsP2 免疫接种的豚鼠也受到充分保护而抵抗弗氏志贺氏菌2a(菌株2457T) 的攻击。
表2
实施例7
IcsP2在使用不同血清型的弗氏志贺氏菌和1型痢疾志贺氏菌的志贺氏菌 诱导的豚鼠结肠炎模型中诱导保护性免疫力
表3
攻击菌株 抗结肠炎保护 弗氏志贺氏菌2a 100％ 弗氏志贺氏菌5a 100％ 痢疾志贺氏菌1 80％ SC602(直肠内) 100％
实施例8
SigA2或IcsP2与CT佐剂一起进行粘膜给药诱导血清抗体响应
随后，在第三次鼻内免疫接种一周后，测定血清抗体水平。由图5 可见，对于各次免疫，以10μg各蛋白的量进行志贺氏菌蛋白免疫接种的 小鼠表现出针对相应抗原的强有力的血清IgG抗体应答，所述抗体应答 在第二次免疫接种后已经出现，由第三次疫苗接种进一步放大。图5显 示了在3次连续免疫的每一次后的SigA2和IcsP2蛋白的抗体效价。
实施例9
志贺氏菌常见蛋白抗原的粘膜给药诱导全身免疫应答和粘膜免疫应答
借助在细胞悬液上进行的ELISpot测定法，对用SigA2或IcsP2免疫 接种的小鼠的脾和肺中的抗体分泌细胞进行计数，所述细胞悬液是在以 CT作为佐剂的SigA2或IcsP2的3次鼻内免疫接种一周后收集的。图 6A-6B所示结果表示为在3-4只小鼠的组中测定的每百万单核细胞的 ASC平均数(柱状图)加该平均数的标准误差(垂直线)。可以看出，用 SigA2免疫接种的动物在脾(图6A)和肺(图6B)中均主要发生IgA-ASC 应答和IgG-ASC应答。对于用IcsP2免疫接种的小鼠中的IcsP2特异的 IgA-ASC应答和IgG-ASC应答，获得了非常相似的结果。
在3次连续免疫接种最后一次的一周后，测定了小鼠肺提取物的 SigA2特异性IgG抗体的活性，所述小鼠通过鼻内(i.n.)途径或腹膜内 (i.p.)途径用SigA2免疫接种。由图7可见，利用SigA2的全身(i.p.) 免疫接种和粘膜(i.n.)免疫接种诱导肺和血清中的抗体应答。在鼻内给 予IcsP2后，在用IcsP2免疫接种的小鼠中记录到相似的肺应答。
总之，所述结果证明，粘膜给予的SigA2和IcsP2是免疫原性的，并 且可以诱导全身和粘膜抗体应答。
实施例10
IcsP2和SigA2的血清抗体与全长IcsP和SigA志贺氏菌蛋白反应
志贺氏菌蛋白的蛋白印迹分析：对弗氏志贺氏菌血清型2a 2457T、 鲍氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌的全细胞去垢剂提取物进行SDS-PAGE， 将所述蛋白转移至硝化纤维素膜上。在环境温度下，用稀释至1/50或 1/100(PBS-吐温20中)的小鼠抗血清孵育该膜2小时。如上所述，通 过腹膜内注射进行SigA2和IcsP2与alum佐剂的共同给药来获得这些抗 血清。在用PBS-吐温清洗后，用碱性磷酸酶缀合的抗小鼠Ig山羊抗体 (Southern Biotech，Birmingham，AL，USA)进一步孵育所述膜。清洗后， 通过添加BCIP-NBT显色底物使膜显色。为了比较性的目的，用考马斯 亮蓝对单独的膜染色。由图9A和图9B可见，针对SigA2和IcsP2产生 的抗血清可以识别不同志贺氏菌种(弗氏志贺氏菌2a、鲍氏志贺氏菌、 宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌)的全长SigA和IcsP2(箭头对应于蛋白 的位置)。
实施例11
SigA2的抗血清的体外抑制性作用
在37℃下，以100、10和1的感染复数(M.O.I)，用侵袭性弗氏志 贺氏菌2a 2457T菌株感染汇合的HeLa细胞2小时。清洗细菌，并用琼 脂糖覆盖培养物。感染后48小时进行吉姆萨染色，使菌斑可见。为测试 SigA2的抗血清抑制菌斑形成的能力，将侵袭性细菌和测试抗血清混合 20分钟，随后将其加入细胞中(图9A-9B)。吉姆萨染色后监测到菌斑减 少。由图9B可见，SigA2的抗体抑制了弗氏志贺氏菌诱导的菌斑形成。 在M.O.I为10下，在SigA2的小鼠抗血清存在的情况下，相比无抗血清 的对照(图9A)，受感染细胞中侵袭性弗氏志贺氏菌2a所诱导的菌斑数 量减少了约60％(图9B)。
实施例12
志贺氏菌菌株中IcsP和SigA存在的确认
使用以上题为“志贺氏菌SigA2和Icsp2多肽的克隆、表达和纯化” 的部分所述的用于过表达载体构建的引物，通过PCR确认志贺氏菌菌株 中IcsP和SigA的存在。
如图10所示，利用用于SigA2和Icsp2片段的引物组，通过PCR确 认：志贺氏菌各血清型中sigA基因和icsP基因的存在。除痢疾志贺氏菌 的sigA外，通过PCR从所有菌株中均扩增到sigA2和icsP2的核酸片段， 通过全基因组测序结果，已知痢疾志贺氏菌菌株中不存在sigA基因(39)。
实施例13
抗SigA2的抗体抑制弗氏志贺氏菌2a造成的角膜结膜炎
将毒力弗氏志贺氏菌2a菌株2457T(20微升中含2×104个集落形 成单位)与PBS、等体积的抗SigA2抗血清或预免疫血清混合，随后将 其接种进豚鼠的结膜囊。由图11A可见，左上插图显示了对照动物中的 中度(24小时)眼周炎症，所述炎症在接种弗氏志贺氏菌2a(菌株2457T) 后48小时(图11B的右上插图)变得严重。相反地，由图11下方两插 图可见，24小时后(图11C)和48小时后(图11D)，SigA2的抗血清抑 制了共同给药的弗氏志贺氏菌(菌株2457T)细菌诱导的眼部炎症。使用 与预免疫血清混合的细菌接种的豚鼠患上了角膜结膜炎。
实施例14
icsP和sigA破坏的突变体菌株分别可以逃避由IcsP2和SigA2诱导的免 疫力
分别用IcsP2、SigA2或SC602(活的减毒弗氏志贺氏菌2a菌株)免 疫接种小鼠。用弗氏志贺氏菌2a或用缺失IcsP或SigA的弗氏志贺氏菌 2a(本文称作KO菌株)攻击动物。如表4所示，小鼠在弗氏志贺氏菌 2a的攻击下存活，但死于KO菌株的攻击，从而分别证明了由IcsP2和 SigA2诱导的保护特异性。
表4毒力菌株攻击后的小鼠存活
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本发明并未限于本文所述具体实施方式的范围内。的确，除本文所 述改变外，在前述说明书及附图的基础上，对本发明的多种改变对本领 域技术人员而言是显而易见的。所述改变意在落入所附权利要求书的范 围。要进一步理解的是，所有数值均是近似的、且是为说明而提供的。
本申请通篇引用专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案，为 一切目的通过引用其整体而将其公开内容并入本文。