一种用黄素荧光蛋白锚定并优化制备甲基对氧硫磷水解酶的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610753732.7 (22)申请日 2016.08.29 (71)申请人 湖北大学 地址 430062 湖北省武汉市武昌区友谊大 道368号 (72)发明人 张贞马立新卞璐唐荣兴 沈威 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 (普通合伙) 42212 代理人 丁齐旭 (51)Int.Cl. C12N 9/16(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称 一种用黄素荧光蛋白锚定并优化制备甲基 对氧硫磷水解酶的方法 (57)摘要 本发明。

2、提出了一利用黄素荧光蛋白锚定并 优化展示甲基对氧硫磷水解酶的方法。 其步骤 为： 1)构建融合基因(H6MPH-EcFbFP)； 2)构建重 组质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP， 同时将通过PCR将 带电荷多肽6Glu的编码序列引入融合蛋白 (H6MPH-EcFbFP)编码基因的3 端， 并构建重组质 粒pET23a/H6MPH-EcFbFP(E6)； 3)重组质粒转化大 肠杆菌感受态细胞， 获得基因工程菌株； 4)将重 组菌株摇瓶培养， 并分别提取细胞各组份， 检测 表面展示效率； 5)测量甲基对氧硫磷水解酶的酶 活； 6)对MPH表面展示的稳定性进行测量。 本发明 首次以黄素荧光。

3、蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白， 将 MPH在大肠杆菌中表面展示， 展示效率高， 制备的 MPH酶活稳定性好。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 106350494 A 2017.01.25 CN 106350494 A 1.一利用黄素荧光蛋白锚定并优化展示甲基对氧硫磷水解酶的方法， 其特征在于步骤 为： 1)重组质粒构建。 首先， 设计构建融合基因H6MPH-EcFbFP； 其次， 将融合基因(H6MPH- EcFbFP)克隆到表达载体pET23a-T， 构建重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP； 然后， 设计 PCR引物携带编码负电荷多肽6Glu的基因。

4、序列， 通过PCR引入重组质粒pET23a/H6MPH- EcFbFP， 重新构建重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP(E6)； 2)重组菌株构建。 将构建好的两种重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受 态细胞， 并涂布于LA平板， 37静置培养16h， 获得重组菌株； 3)重组菌株培养和表达。 接种重组菌株于氨苄青霉素浓度100 g/mL的LB培养基中诱导 培养， 培养条件为： 首先， 37200RPM震荡培养， 在OD值为0.50.6之间， 加入IPTG， 终浓度 为1mM， 37继续诱导培养8小时； 然后， 12000RPM， 4， 10分钟离心收集菌体，。

5、 菌体用预冷 PBS清洗3次， 重悬于10mL的预PBS中备用； 4)细胞组份提取。 取1mL菌液， 12000RPM， 4， 离心2分钟收集菌体， 将菌体重悬于1mL预 冷的TES缓冲液中， 静置5分钟， 12000RPM， 离心10分钟， 离心后的上清定义为细胞外膜组份； 将沉淀重悬于1mL预冷的MgCl2缓冲液中， 4静置30分钟， 12000RPM， 离心10分钟， 离心后的 上清定义为细胞周质组份； 将沉淀重悬于1mL预冷的PBS缓冲液之中， 定义为细胞胞质组份； 5)细胞表面展示效率测定。 分别取200 L步骤4中的上述各细胞组份， 用SDS-PAGE检测。 经考马斯亮蓝染色之后，。

6、 采用灰度扫描的方法来计算各组份中的目的蛋白占总目的蛋白的 比例， 以此来计算出MPH的展示效率； 6)细胞表面展示MPH活性测定。 按照文献1方法对细胞表面展示MPH进行活性测定。 7)展示MPH稳定性测定。 参照步骤6中的方法， 每天在相同的时间内对同一份样品进行 酶活测定， 连续测量31天， 并绘制酶活的变化趋势。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106350494 A 2 一种用黄素荧光蛋白锚定并优化制备甲基对氧硫磷水解酶的 方法 技术领域 0001 本发明涉及的是甲基对氧硫磷水解酶(MPH)的表面技术， 特别是利用黄素荧光蛋 白(EcFbFP)这一全新的锚定蛋白， 通过优化其所带的。

7、电荷以提高甲基对氧硫磷水解酶 (MPH)展示效率的方法， 是甲基对氧硫磷水解酶(MPH)在大肠杆菌表面展示的一种新思想、 新途径、 新方法。 背景技术 0002 在全世界范围内， 每年大约要消耗约40万吨的农药用于农业防治， 有机磷农药占 到总农药使用量的70， 然而有效的利用率不到的1。 随着有机磷农药长期和大范围的使 用， 越来越多的环境问题、 人类健康问题、 可持续发展问题日益凸显出来。 因此， 寻找一种安 全、 经济、 有效的生物降解有机磷农药的方法迫在眉睫。 通过微生物酶系降解有机磷农药的 方法， 基于其成本低和活性高而倍受到人们的重视。 0003 异源蛋白质的表面展示系统及其锚定策。

8、略方面的研究的快速发展， 为高活性、 低 成本的有机磷水解酶的生产提供了一种新对策， 并解决了传统的重组工程菌株产生的降解 酶不能自由穿越细胞膜结构， 从而导致其在应用时， 酶的活性不能够得到充分发挥， 以及从 工程菌中分离纯化降解酶， 由于工艺繁琐和成本高而限制了其推广应用等诸多问题。 0004 甲基对硫磷水解酶(MPH)是有机磷水解酶家族中的成员之一， 来源于假单胞菌 (Pseudomonas sp.)， 它主要降解甲基对硫磷， 还可以降解乙基对硫磷， 它们都存在于杀螟 松和毒死蜱等有机磷农药中。 目前， 国内外研究甲基对硫磷水解酶(MPH)的细胞表面展示技 术获得了一系列成果， 成功构建。

9、大肠杆菌MPH展示工程菌。 例如， Yang等3将Tat信号通路的 信号肽TorA， 融合到MPH的氨基端， 实现其在细胞周质中表达， 并测得细胞周质中的酶活是 胞质表达的3倍； Yang等2将锚定蛋白Lpp-OmpA； AIDA等分别与MPH的氨基端进行融合， 实现 了MPH在大肠杆菌细胞表面展示， 其中Lpp-OmpA作为锚定蛋白展示的MPH的酶活达到1.52U/ OD600。 0005 但是目前利用大肠杆菌表面展示系统展示MPH还存在一些缺陷， 如： (1)固定部位 经常发生错误， 造成MPH表达不稳定； (2)表达出来的MPH活性不高且活性保持时间不够长； (3)MPH对大肠杆菌有毒性。

10、， 使细胞在表达过程中发生生长停滞和自溶现象。 这些都直接影 响MPH的表达和降解有机磷农药的效率。 0006 参考文献 0007 1Shhimazu M ,Mulchandani A ,Chen W .Cell surface display of organophosphorus hydrolase using ice nucleation proteinJ .Biotechnol Prog, 2001； 17(1):76-80. 0008 2Yang JJ,Liu RH,Jiang H,Yang Y,Qiao CL.Selection of a whole-cell biocatalys。

11、t for methyl parathion biodegradationJ.Appl Microbiol Biotechnol, 2012； 95:1625-1632. 说明书 1/5 页 3 CN 106350494 A 3 0009 3Yang C,Freudl R,Qiao CL.Export of methyl parathion hydrolase to the periplasm by the twin-arginine translocation pathway in Escherichia coli J.J Argric Food Chem,2009,57:8901-8905。

12、. 发明内容 0010 本发明的目的是提出了一种用黄素荧光蛋白锚定并优化制备甲基对氧硫磷水解 酶的方法， 提高甲基对氧硫磷水解酶(MPH)在大肠杆菌中表面展示效率， 提高制备的甲基对 氧硫磷水解酶(MPH)的稳定性。 0011 本发明是这样实现的。 用黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白， 构建融合蛋白 (H6MPH-EcFbFP)， 并通过优化黄素荧光蛋白(EcFbFP)所带的电荷， 来提高融合蛋白(H6MPH- EcFbFP)在大肠杆菌细胞表面的展示效率； 0012 1)重组质粒构建。 首先， 设计构建融合基因(H6MPH-EcFbFP)； 其次， 将融合基因 (H6MPH-EcFbF。

13、P)克隆到表达载体pET23a-T(由本实验室构建或者外购)， 构建重组表达质粒 pET23a/H6MPH-EcFbFP； 0013 然后， 设计PCR引物携带编码带负电荷多肽6Glu的基因序列， 通过PCR引入重组 质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP， 重新构建重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP(E6)(结构示意图 见图1和图2， 氨基酸序列见表1， PCR引物见表2)； 0014 表1信号肽和带电荷多肽及其氨基酸序列 0015 0016 0017 表2引物名称及引物序列 说明书 2/5 页 4 CN 106350494 A 4 0018 0019 引物方向为5 -3。

14、 0020 2)重组菌株构建。 将构建好的两种重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue 感受态细胞， 并涂布于LA平板上(氨苄青霉素的终浓度为100 g/mL)， 37静置培养过夜， 获 得重组菌株； 0021 3)重组菌株培养和表达。 将基因工程菌株， 接种于100mL LB培养基， 氨苄青霉素的 终浓度为100 g/mL， 37在200RPM的摇瓶上震荡培养， OD值为0.50.6之间， 加入IPTG， 终 浓度为1mM， 37诱导培养8小时。 然后， 12000RPM， 4， 10分钟离心收集菌体， 菌体用预冷磷 酸缓冲液清洗3次， 重悬于10mL的预冷磷酸缓冲液中备用； 0。

15、022 4)细胞各组份的提取。 取1mL菌液， 12000RPM， 4， 离心2分钟收集菌体， 将菌体重 悬于1mL预冷的TES缓冲液中， 静置5分钟， 12000RPM， 离心10分钟， 离心后的上清即为细胞外 膜组份； 将沉淀重悬于预冷的MgCl2缓冲液中， 4静置30分钟， 12000RPM， 离心10分钟， 离心 后的上清即为细胞周质组份； 将沉淀重悬于预冷的PBS缓冲液之中， 即为胞质组份。 0023 5)分别取200 L步骤4中的上述各细胞组份， 用SDS-PAGE检测。 经考马斯亮蓝染色 之后， 采用灰度扫描的方法来计算各组份中的目的蛋白占总目的蛋白的比例， 以此来计算 融合蛋白。

16、的展示效率； 0024 6)菌株的全细胞MPH活性测定。 按照文献1的方法对菌株的全细胞MPH进行活性测 定。 0025 收集经IPTG诱导后的细胞培养物， 用pH至为8.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗涤3次， 重悬于含50 M CoCl2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中， 并调整其OD600为1.0。 酶活反应体系(1000 L溶液)中包含： OD600为1.0的菌悬液200 L， 37反应2分钟， 测定410nm处的吸收值的变化。 1个MPH酶活单位(U)定义为每分钟水解1 M对氧磷所需的酶量； 0026 7)展示的稳定性检测， 参照步骤6中的方法， 每天在相同的时间内对同一份样品进 行酶活测定， 连。

17、续测量31天， 并绘制酶活的变化趋势。 0027 本发明是在大肠杆菌细胞表面展示甲基对氧硫磷水解酶， 包括黄素荧光蛋白 (EcFbFP)作为锚定蛋白， 甲基对氧硫磷水解酶(MPH)作为展示的目的蛋白的展示方法， 以及 在此基础上优化的黄素荧光蛋白(EcFbFP)展示甲基对氧硫磷水解酶(MPH)的展示方法。 0028 本发明具有的优势。 0029 首先， 本发明建立了一种全新的以黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白的大肠杆 菌细胞表面展示系统； 其次， 利用该展示系统， 甲基对氧硫磷水解酶(MPH)实现了在大肠杆 菌细胞表面展示， 通过优化黄素荧光蛋白所带的电荷， 将甲基对氧硫磷水解酶在大肠。

18、杆菌 表面的展示效率提高了近5倍， 展示酶活提高了近10倍； 与杨等2报道的使用(LPP-OmpA)作 为锚定蛋白展示的甲基对氧硫磷水解酶酶活(1.52U/OD600)的接近； 经过31天的连续测量， 分析其酶活趋势发现， 利用本系统展示的MPH， 在第14天重组菌株仍然具有100的残留酶 说明书 3/5 页 5 CN 106350494 A 5 活， 在第31天重组菌株仍然具有近50的残留酶活， 与Yang等2报道的LPP-OmpA作为锚定 蛋白展示的甲基对氧硫磷水解酶展示稳定性急剧下降(第3天下降至不到30的残留酶活) 相比， 说明本展示系统具有良好的异源蛋白展示稳定性。 附图说明 003。

19、0 图1、 图2为本发明实验设计方案。 如图所示， EcFbFP为黄素荧光蛋白(EcFbFP)的英 文缩写； MPH为甲基对氧硫磷水解酶的英文缩写； His为标签蛋白的英文缩写； E6为六个谷氨 酸的英文缩写。 设计方案如下， 首先， 构建重组质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP， 其次将带电荷多 肽(6Glu)引入到黄素荧光蛋白(EcFbFP)的羧基端， 构建重组质粒pET23a/H6MPH- EcFbFP(E6)。 0031 图3为SDS-PAGE分析展示效率和表面展示的MPH酶活测定。 1为融合蛋白H6MPH- EcFbFP在细胞各组份中的分析结果， C为细胞胞质组份总蛋白； P为。

20、细胞周质组份总蛋白； OM 为细胞外膜组份总蛋白。 2为融合蛋白H6MPH-EcFbFP(E6)在细胞各组份中的分析结果， C为细 胞胞质组份总蛋白； P为细胞周质组份总蛋白； OM为细胞外膜组份总蛋白。 0032 图4为测得表面展示的MPH的酶活结果， 1为测定表面展示融合蛋白H6MPH-EcFbFP 的酶活结果； 2为测得表面展示融合蛋白H6MPH-EcFbFP(E6)的酶活结果。 0033 图5为分析细胞表面展示有机磷水解酶稳定性。 图中为表面展示融合蛋白H6MPH- EcFbFP稳定性测定结果的趋势图； 0034 图6为分析细胞表面展示有机磷水解酶稳定性。 图中为表面展示融合蛋白H6M。

21、PH- EcFbFP(E6)稳定性测定结果的趋势图。 具体实施方式 0035 下面以实例对本发明进一步说明： 0036 实施例1： 0037 利用本发明方法在大肠杆菌细胞表面展示甲基对氧硫磷水解酶(MPH)。 首先， 将构 建好的重组质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株， 37 静置培养过夜。 然后， 挑取单菌落， 接种于100mL LB培养基， 抗生素氨苄青霉素的终浓度为 100 g/mL， 37震荡培养， OD值为0.50.6之间， 加入IPTG， 终浓度为1mM， 37诱导培养8小 时。 然后， 12000RPM， 4离心收集菌体，。

22、 菌体用预冷PBS清洗3次， 最终重悬于10mL预冷PBS缓 冲液备用。 然后参照发明内容步骤4、 步骤5中的方法进行分析， 并参照发明内容， 步骤6中的 方法进行酶活测定(图3)。 0038 实施例2： 0039 对大肠杆菌中细胞表面展示甲基对氧硫磷水解酶(MPH)的系统进行优化。 首先， 在 重组表达质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP的基础上， 设计PCR引物携带编码带负电荷多肽6Glu 的基因序列， 通过PCR引入重组质粒pET23a/H6MPH-EcFbFP上， 构建重组表达质粒pET23a/ H6MPH-EcFbFP(E6)； 其次， 将构建好的重组质粒pET23a/H6MP。

23、H-EcFbFP(E6)转化大肠杆菌感受 态细胞Rosetta Blue菌株， 37静置培养过夜。 然后， 挑取单菌落， 接种于100mL LB培养基， 抗生素氨苄青霉素的终浓度为100 g/mL， 37震荡培养， OD值为0.50.6之间， 加入IPTG， 终浓度为1mM， 37诱导培养8小时。 然后， 12000RPM， 4离心收集菌体， 菌体用预冷PBS清洗 说明书 4/5 页 6 CN 106350494 A 6 3次， 最终重悬于10mL预冷PBS缓冲液备用； 然后， 参照发明内容步骤4、 步骤5中的方法进行 分析， 并参照发明内容， 步骤6中的方法进行酶活测定(图4)。 0040 。

24、实施例3： 0041 将实施例1、 实施例2离心收集的菌体， 用预冷PBS清洗3次， 最终重悬于10mL预冷 PBS缓冲液备用。 然后参照发明内容， 步骤7)中的方法每天在相同的时间点针对同一份菌液 进行酶活测定(图5， 图6)。 0042 各种实例结果分析 0043 黄素荧光蛋白(EcFbFP)作为锚定蛋白首次实现甲基对氧硫磷水解酶(MPH)在大肠 杆菌细胞表面展示， 并且展示的甲基对氧硫磷水解酶具有活性。 通过对黄素荧光蛋白 (EcFbFP)的电荷进行优化之后， 本发明将展示效率由原来10提高到50， 并且将展示的 甲基对氧硫磷水解酶的酶活由0.170.002U/OD600提高到1.099。

25、0.005U/OD600， 酶活提高 近10倍， 与Yang等2报道的使用LPP-OmpA作为锚定蛋白展示的甲基对氧硫磷水解酶酶活 (1.52U/OD600)的接近。 本发明还对该系统展示的甲基对氧硫磷水解酶的展示稳定性进行了 测量， 经过31天的连续测量， 分析其酶活趋势发现， 利用本系统展示的MPH， 在第14天重组菌 株仍然具有100的残留酶活， 在第31天重组菌株仍然具有近50的残留酶活， 与Yang等2 报道的LPP-OmpA作为锚定蛋白展示的甲基对氧硫磷水解酶展示稳定性急剧下降(第3天下 降至不到30的残留酶活)相比， 说明本展示系统具有良好的异源蛋白展示稳定性。 0044 本发明大肠杆菌菌株Rosetta Blue购于美国Novagen公司， 不同的重组质粒均为 本实验室构建或外购， 分析用各种试剂为分析纯。 说明书 5/5 页 7 CN 106350494 A 7 0001 序列表 1/2 页 8 CN 106350494 A 8 0002 序列表 2/2 页 9 CN 106350494 A 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 10 CN 106350494 A 10 图4 图5 说明书附图 2/3 页 11 CN 106350494 A 11 图6 说明书附图 3/3 页 12 CN 106350494 A 12 。