一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610517308.2 (22)申请日 2016.07.04 (71)申请人 江西师范大学 地址 330000 江西省南昌市紫阳大道99号 (72)发明人 张志斌颜日明祝丽彬朱笃 汪涯杨慧林江玉梅 (51)Int.Cl. C12N 1/16(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法 (57)摘要 本发明提供了一种调控皮状丝孢酵母B3发 酵形态的方法， 属于生物工程。

2、领域， 所涉及的菌 株保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 C C T C C N O .M 2 0 1 0 0 7 6 ， 已 在 专 利 ZL201010210264.1中公开。 本发明针对所述菌株 的特点确定影响其细胞形态转换的关键因子为 氮源浓度及培养基pH。 将酵母型或菌丝型的细胞 接种到发酵培养基中， 通过控制氮源浓度及培养 基pH， 可稳定调控其发酵形态。 碱性环境， 低氮源 浓度； 呈菌丝型生长的发酵工艺是： 酸性环境， 高 氮源浓度。 本发明的优点在于可使发酵过程中细 胞形态均一， 为皮状丝孢酵母B3形态代谢工程研 究提供理论依据。 本发明设计的促使菌体呈酵母 型生长的。

3、发酵方法工艺简单， 能为皮状丝孢酵母 B3高密度发酵产微生物油脂降低生产成本。 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 CN 105969676 A 2016.09.28 CN 105969676 A 1.一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法， 皮状丝孢酵母B3呈酵母型生长的发酵工 艺为碱性环境pH7.09.0， 低氮源浓度01.0g/L； 皮状丝孢酵母B3呈菌丝型生长的发酵 工艺为酸性环境pH3.06.0， 高氮源浓度5.010.0g/L。 2.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法， 其特征在于： 所述的氮 源为酵母提取物、 蛋白胨、 尿素或(NH4)2SO4中的一种。 3。

4、.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法， 其特征在于： 通过柠磷 酸氢二钠-柠檬酸或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液调节培养基的初始pH值。 4.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法， 其特征在于： 将保存在 固体培养基上的皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养基中培养48-60h， 以体积分数5- 10的接种量接入发酵培养基； 摇瓶培养的温度为25-30， 摇床转速为180-200r/min， 氮 源浓度保持在01.0g/L， pH保持在7.0-9.0， 细胞呈酵母型生长。 5.按照权利要求1所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法， 其特征在于： 将保存在 固体培养基。

5、上的皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养基中培养48-60h， 以体积分数5- 10的接种量接入发酵培养基； 摇瓶培养的温度为25-30， 摇床转速为180-200r/min， 氮 源浓度保持在5.0g/L10.0g/L， pH保持在3.0-6.0， 细胞呈菌丝型生长。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105969676 A 2 一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物发酵形态调控， 属于生物工程领域。 更具体地， 即一株产微生物 油脂菌株皮状丝孢酵母B3的发酵形态调控方法。 背景技术 0002 菌体发酵形态调控作为微生物发酵调控的重要内容， 对于提高真菌在。

6、工业发酵中 的生产水平具有重要作用， 受到高度重视。 以菌丝型生长的真菌会形成分散菌丝体 (Dispersedmycelium)、 球状菌丝体(Pellet)和团簇状菌丝体(ClumporFlock)等三种集 结形态， 不管哪种形态， 都会对发酵液的流体学性质、 营养物质摄取和氧气传递带来影响。 随着细胞菌丝的增多， 真菌细胞间更容易发生结团现象， 从而使发酵液的粘度不断增加， 进 一步阻碍细胞对营养物质的摄取和氧气的传递， 最终影响菌体的生长和产物的生成。 为此， 研究人员根据真菌生长的特性， 通过优化培养基的成分以及组成来控制丝状真菌形态。 如 Christiansen等研究了不同葡萄糖糖。

7、浓度下黑曲霉(Aspergillusniger)菌丝体的生长情 况， 发现在不同糖浓度下， 菌丝体的分支情况会有所区别。 Liao等则全面考察了接种孢子浓 度， 葡萄糖、 尿素、 磷酸盐、 金属离子的浓度， 发酵体系pH以及微粒子添加对米根霉 (Rhizopusoryzae)生长形态的影响及其变化规律。 0003 近年来， 随着化石燃料的益枯竭和人们环保意识的增强， 利用生物技术开发和生 产可持续、 绿色环保的生物燃料正成为替代能源研究的一个重要方向， 利用微生物生产油 脂也是近年来的研究重点之一。 皮状丝孢酵母具有油脂含量高， 生长速度快、 可利用木质纤 维素等优点， 在利用廉价的工农业废弃。

8、原料进行发酵生产方面具有优势， 越来越受到人们 的重视。 迄今， 皮状丝孢酵母已成为一个重要的微生物油脂生产候选菌种。 皮状丝孢酵母归 类为二型态真菌， 可呈酵母型和菌丝型两种形态， 但正常情况下， 其在发酵过程中是以丝状 生长为主。 随着细胞密度的上升， 菌丝会发生结团， 造成发酵液的流体学性质发生改变(粘 度上升)， 大大影响了营养物质和氧气的传递， 从而进一步对菌体的生长起到阻碍作用， 无 法进行高密度培养， 使得最终油脂产量不高。 外界环境条件是影响二型态真菌形态转换的 重要因素之一， 例如碳氮源、 温度、 溶氧和pH值等。 但有关调控皮状丝孢酵母发酵形态的具 体环境因素及工艺却未有报。

9、道。 本发明所述的皮状丝孢酵母B3发酵形态的调控工艺， 可稳 定控制其发酵形态， 对研究皮状丝孢酵形态代谢具有重要的意义， 为其高密度发酵产微生 物油脂奠定基础。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法， 为皮状丝孢酵母 B3形态代谢研究和高密度发酵产微生物油脂奠定基础。 0005 本发明提供了皮状丝孢酵母B3发酵形态的调控方法， 所述皮状丝孢酵母B3保藏于 中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCCNO.M2010076； 0006 本发明所述的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法， 具体步骤如下： 说明书 1/7 页 3 CN 105969676 A。

10、 3 0007 1.皮状丝孢酵母B3所使用的培养基： 0008 (1)固体培养基 0009 葡萄糖： 20g/L； 酵母提取物： 10g/L； 琼脂： 20g/L； pH自然。 0010 (2)种子培养基 0011 葡萄糖： 40g/L； 酵母提取物： 3.0g/L； KH2PO4： 0.75g/L； CaCl22H2O： 0.4g/L； MgSO47H2O： 0.4g/L； pH6.0。 0012 (3)发酵培养基 0013 葡萄糖： 40g/L； KH2PO4:0.75g/L； CaCl22H2O:0.4g/L； MgSO47H2O:0.4g/L； 以 酵母提取物、 蛋白胨、 硫酸铵、 尿。

11、素作为氮源， 用柠磷酸氢二钠-柠檬酸或甘氨酸-氢氧化钠 缓冲液进行调配初始pH值。 0014 2.皮状丝孢酵母B3呈酵母型的发酵方法： 0015 (1)将保存在固体培养基上的产微生物油脂皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养 基中培养48-60h， 以5-10的接种量接入发酵培养基； 摇瓶培养的温度为25-30， 摇床 转速为180-200r/min， pH保持在7.0-9.0， 氮源浓度保持在0-1.0g/L以下或者0.11.0g/L； 0016 (2)将步骤(1)中培养48h的菌体放置显微镜下观察并拍照， 所得照片运用图像定 量分析(QIA)软件进行分析， 计算酵母细胞所占的百分率： 酵母型细。

12、胞数/(酵母型细胞数+ 菌丝型细胞数)100， 即： Y/(Y+M)100。 0017 3.皮状丝孢酵母B3呈菌丝型的发酵方法： 0018 (1)将保存在固体培养基上的产微生物油脂皮状丝孢酵母B3的菌种接入种子培养 基中培养48-60h， 以体积分数5-10的接种量接入发酵培养基； 摇瓶培养的温度为25-30 ， 摇床转速为180-200r/min， pH保持在4.0-6.0， 氮源浓度保持在5.0-10.0g/L。 0019 (2)将步骤(1)中培养48h的菌体放置显微镜下观察并拍照， 所得照片运用图像定 量分析(QIA)软件进行分析， 计算菌丝型细胞所占的百分率： 菌丝型细胞数/(酵母型细。

13、胞 数+菌丝型细胞数)100， 即： M/(Y+M)100。 0020 有益效果： 本发明的调控皮状丝孢酵母B3发酵形态的方法确立了影响皮状丝孢酵 母B3形态的关键因素： 氮源浓度和培养基的pH。 采用本发明所述的方法可稳定控制皮状丝 孢酵母B3发酵过程中的细胞形态， 这对皮状丝孢酵母的形态代谢工程研究具有重要意义。 0021 另外， 采用本发明所设计的促使细胞呈酵母型的发酵方法可使菌体在发酵过程中 始终呈酵母型， 避免了因菌丝结团造成的发酵液粘度上升， 这为皮状丝孢酵母B3高密度发 酵产微生物油脂奠定基础。 附图说明 0022 图1是pH为7.0时， 不同氮源低浓度条件下细胞的形态； 002。

14、3 图2是pH为8.0时， 不同氮源低浓度条件下细胞的形态； 0024 图3是pH为9.0时， 不同氮源低浓度条件下细胞的形态； 0025 图4是pH为4.0时， 不同氮源高浓度条件下细胞的形态； 0026 图5是pH为5.0时， 不同氮源高浓度条件下细胞的形态； 0027 图6是pH为6.0时， 不同氮源高浓度条件下细胞的形态。 说明书 2/7 页 4 CN 105969676 A 4 具体实施方式： 0028 以下结合实施例对本发明进行详细说明。 0029 实施例1pH为7.0时， 不同氮源低浓度条件对皮状丝孢酵母B3细胞形态的影响 0030 (1)培养基 0031 a.固体培养基 003。

15、2 葡萄糖： 20g/L； 酵母提取物： 10g/L； 琼脂： 20g/L； pH自然。 0033 b.种子培养基 0034 葡萄糖： 40g/L； 酵母提取物： 3g/L； KH2PO4： 0.75g/L； CaCl22H2O： 0.4g/L； MgSO47H2O： 0.4g/L； pH6.0。 0035 c.发酵培养基 0036 葡萄糖:40g/L； KH2PO4:0.75g/L； CaCl22H2O:0.4g/L； MgSO47H2O:0.4g/L； 以 酵母提取物、 蛋白胨、 硫酸铵、 尿素作为氮源， 浓度设置如下： 1g/L、 0.5g/L、 0.1g/L； 初始pH 7.0(通过柠。

16、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。 0037 (2)培养方式 0038 甘油管保藏的菌种转接至固体平板培养基， 28活化48h。 种子培养使用250mL三 角瓶， 装液量50mL， 培养温度为28， 摇床转速200r/min。 种子培养48h以5的接种量接入 发酵培养基， 装样量50mL/250mL， 培养温度为28， 摇床转速180r/min。 培养48h后进行菌体 形态观察。 0039 (3)结果显示 0040 pH7.0， 氮源浓度在1.0g/L以下时， 皮状丝孢酵母B3基本都呈酵母型， 酵母型菌 体比例均在90以上， 结果见表1， 图1。 0041 表1碱性环境， 低氮源浓度条件下，。

17、 酵母型细胞的比例 说明书 3/7 页 5 CN 105969676 A 5 0042 0043 实施例2pH为8.0时， 不同氮源低浓度条件对皮状丝孢酵母B3细胞形态的影响 0044 (1)培养基 0045 a.固体培养基 0046 同实例1 0047 b.种子培养基 0048 同实例1 0049 c.发酵培养基 0050 培养基成分同实例1； 初始pH8.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配) 0051 (2)培养方式 0052 同实例1 0053 (3)结果显示： 0054 pH8.0， 氮源浓度1.0g/L以下时， 皮状丝孢酵母B3基本呈酵母型， 酵母型菌体比 例均在90以上， 。

18、结果见表1， 图2。 0055 实施例3pH为9.0时， 不同氮源低浓度条件对皮状丝孢酵母B3细胞形态的影响 0056 (1)培养基 0057 a.固体培养基 0058 同实例1 0059 b.种子培养基 说明书 4/7 页 6 CN 105969676 A 6 0060 同实例1 0061 c.发酵培养基 0062 培养基成分同实例1； 初始pH9.0(通过甘氨酸-氢氧化钠缓冲液进行调配) 0063 (2)培养方式 0064 同实例1 0065 (3)结果显示： 0066 pH9.0， 氮源浓度在1.0g/L以下时， 皮状丝孢酵母B3基本都呈酵母型， 酵母型菌 体比例均在90以上， 结果见表。

19、1， 图3。 0067 实施例4pH为4.0时， 不同氮源高浓度条件对皮状丝孢酵母B3菌体形态的影响 0068 (1)培养基 0069 a.固体培养基 0070 同实例1 0071 b.种子培养基 0072 同实例1 0073 c.发酵培养基 0074 葡萄糖： 40g/L； KH2PO4:0.75g/L； CaCl22H2O:0.4g/L； MgSO47H2O:0.4g/L； 以 酵母提取物、 蛋白胨、 硫酸铵、 尿素作为氮源， 浓度设置如下： 5.0g/L、 7.0g/L、 10.0g/L； 初始 pH4.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。 0075 (2)培养方式 0076 。

20、同实例1 0077 (3)结果显示： 0078 pH4.0， 氮源浓度在5.0-10.0g/L时， 皮状丝孢酵母B3基本呈菌丝型， 且由于培养 基环境酸性过强， 菌体会产生少量厚垣孢子或形成假菌丝(归为菌丝型)， 菌丝型菌体比例 可达90以上， 结果见表2， 图4。 0079 表2酸性环境， 高氮源浓度条件下， 菌丝型细胞的比例 说明书 5/7 页 7 CN 105969676 A 7 0080 0081 实施例5pH为5.0时， 不同氮源高浓度条件对皮状丝孢酵母B3菌体形态的影响 0082 (1)培养基 0083 a.固体培养基 0084 同实例1 0085 b.种子培养基 0086 同实例。

21、1 0087 c.发酵培养基 0088 同实例4， 初始pH5.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。 (2)培养方式 0089 同实例1 0090 (3)结果显示： 0091 pH5.0， 氮源浓度在5.0-10.0g/L时， 皮状丝孢酵母B3基本呈细长菌丝型， 菌丝型 菌体比例高达90以上， 结果见表2， 图5。 0092 实施例6pH为6.0时， 不同氮源高浓度条件对皮状丝孢酵母B3菌体形态的影响 0093 (1)培养基 0094 a.固体培养基 0095 同实例1 0096 b.种子培养基 说明书 6/7 页 8 CN 105969676 A 8 0097 同实例1 0098 。

22、c.发酵培养基 0099 同实例4， 初始pH6.0(通过柠磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行调配)。 (2)培养方式 0100 同实例1 0101 (3)结果显示： 0102 pH6.0， 氮源浓度在5.0-10.0g/L时， 皮状丝孢酵母B3也基本呈菌丝型， 菌丝型细 胞比例要比同等条件下pH为5.0时略低一点， 但比例也在90左右， 结果见表2， 图6。 说明书 7/7 页 9 CN 105969676 A 9 图1 说明书附图 1/6 页 10 CN 105969676 A 10 图2 说明书附图 2/6 页 11 CN 105969676 A 11 图3 说明书附图 3/6 页 12 CN 105969676 A 12 图4 说明书附图 4/6 页 13 CN 105969676 A 13 图5 说明书附图 5/6 页 14 CN 105969676 A 14 图6 说明书附图 6/6 页 15 CN 105969676 A 15 。