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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710327027.5 (22)申请日 2017.05.10 (71)申请人 广东温氏食品集团股份有限公司 地址 527499 广东省云浮市新兴县新城镇 东堤北路9号 (72)发明人 曾喜多陈燕珊陈俊伟张冠群 何晓明凌宝明温伟怡庞仕旭 (74)专利代理机构 广州番禺容大专利代理事务 所(普通合伙) 44326 代理人 刘新年 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 。
2、1/93(2006.01) (54)发明名称 一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测引物及RT- PCR检测方法 (57)摘要 本发明涉及猪病毒的检测技术领域， 具体涉 及一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测引物及检测 方法。 所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO： 1和 SEQIDNO： 2所示； 所述RT-PCR检测方法包括： 设 计合成所述的引物； 提取样本RNA， 保存备用； 将 所得的样本RNA作为模板RNA， 利用所述引物进行 RT-PCR反应； 判读检测结果。 本发明方案丰富了 该病毒检测的技术手段， 特异性和灵敏度好， 检 测速度快， 具有很好的应用价值。 权利要求书2页 说明书4页。
3、 序列表1页 附图2页 CN 107034313 A 2017.08.11 CN 107034313 A 1.一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测引物， 其特征在于， 所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO： 2所示。 2.一种塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测方法， 其特征在于， 操作步骤包括： (1)、 设计合成权利要求1所述的引物； (2)、 提取样本RNA， -20-80冷冻保存备用； (3)、 将(2)中所得的样本RNA作为模板RNA， 利用(1)中所得的引物进行RT-PCR反应； (4)、 电泳鉴定(3)所得的RT-PCR产物， 并对结果进行判定。 3.根据权。
4、利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤(2)提取的样本RNA中保存温 度为-70。 4.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中的RT-PCR反应， 反应体 系为： 21 Step Buffer： 6.25 l； PrimeScript 1 Step Enzyme Mix： 0.5 l； SVVUP(10 mol/l)(SEQ ID NO： 1)： 0.25 l； SVVDN(10 mol/l)(SEQ ID NO： 2)： 0.25 l； 模板RNA： 0.5 l； 无核酸酶水补足至12.5 l。 5.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤(3。
5、)中的RT-PCR反应， 反应程 序为： 逆转录： 50， 30min； 预变性： 95， 25min； 后延伸： 72， 10min； 最后降温至4或16。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述反应程序为： 逆转录： 50， 30min； 预变性： 95， 2min； 后延伸： 72， 10min； 最后降温至4。 7.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中的电泳鉴定为1琼脂 权利要求书 1/2 页 2 CN 107034313 A 2 糖凝胶电泳鉴定。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107034313 A 3 一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测。
6、引物及RT-PCR检测方法 技术领域 0001 本发明涉及猪病毒的检测技术领域， 具体涉及一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测引 物及RT-PCR检测方法。 背景技术 0002 塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus ， SVV) 属于小核糖核酸病毒科 (picornaviridae)Senecavirus病毒属， 为单股正链RNA病毒， 基因组全长约7.28kb， 包含5 UTR、 3 UTR和处于两者之间的单一ORF， 5 端有VPg蛋白共价结合， 3 端有polyA尾。 SVV最初 是2002年在PER.C6细胞培养物中被发现， 2007年美国一屠宰场的猪群中出现水疱性疾病临。
7、 床症状， 经检测排除各种能引起水疱的病原， 最终认定SVV为致病原。 但自此之后未见其他 发病的报道。 0003 直至20142015年， 巴西报道了其在涉及六个州的猪群中爆发水疱性疾病， 该病 有三个主要特征： (1)母猪鼻部和冠状带上出现水疱和聚合性糜烂； (2)四日龄内新生仔猪 急性死亡达3070； (3)自限性爆发持续时间约12周。 官方诊断发现强制性报告的水 疱性疾病均为阴性， 仅SVV阳性， 序列分析发现其与SVV-001株的核苷酸相似性为87.6 98.5， 氨基酸相似性为9599.4， 说明SVV是本次巴西水疱性疾病爆发的致病原， 且 为SVV首次在北美之外被报到。 美国在2。
8、0142015年也发生了多起区域性的感染。 近年已有 报道显示中国境内也出现了SVV的感染， 但目前还没有相应的快速有效的检测手段， 致使一 旦有疫情爆发， 不能及时的确诊病原， 从而不能及时有效地采取防治措施， 给养殖业带来巨 大损失。 0004 可见， 现有技术问题亟待解决。 发明内容 0005 鉴于此， 有必要针对上述问题提供一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测引物及RT-PCR 检测方法， 该引物特异性好、 灵敏度高且扩增片段小， 整个RT-PCR检测过程可以在2h内完 成， 能够特异地检测出塞尼卡谷病毒， 可用于实验室检测和临床辅助诊断， 具有重要现实意 义。 0006 本发明目的通过。
9、以下技术方案实现： 0007 一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测引物， 其核苷酸序列为： 0008 SVVUP： 5 -GATGTATAAACCTTCTC-3 (SEQIDNO： 1) 0009 SVVDN： 5 -ATTGTAAGTGCCAAGAG-3 (SEQIDNO： 2)。 0010 一种塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测方法， 步骤包括： 0011 (1)、 设计合成所述引物(SEQIDNO： 1和SEQIDNO： 2)； 0012 (2)、 提取样本RNA， -20-80冷冻保存备用； 0013 (3)、 将(2)中所得的样本RNA作为模板RNA， 利用(1)中所得的引物进行RT-PC。
10、R反 应； 说明书 1/4 页 4 CN 107034313 A 4 0014 (4)、 电泳鉴定(3)所得的RT-PCR产物， 并对结果进行判定。 0015 进一步的， 所述步骤(2)提取的样本RNA中保存温度为-70。 0016 进一步的， 所述RT-PCR反应中， 12.5 l反应体系为： 0017 21StepBuffer： 6.25 l； PrimeScript1StepEnzymeMix： 0.5 l； SVVUP(10 mol/l) (SEQIDNO： 1)： 0.25 l； SVVDN(10 mol/l)(SEQIDNO： 2)： 0.25 l； 模板RNA： 0.5 l； 无。
11、核酸酶水 补足至12.5 l。 0018 进一步的， 所述RT-PCR反应中， 反应程序为： 0019 0020 最后降温至4或16， 一般降温至4度， 样品的临时保存也可在4度， 但若暂存于 PCR仪中， 4会凝结水滴， 对PCR仪不好， 此时设为16度保存有保护PCR仪的作用， 且16度短 时保存对PCR产物影响不大。 0021 进一步的， 所述RT-PCR反应中， 反应程序为： 0022 0023 最后降温至4。 0024 进一步的， 所述步骤(4)中的电泳鉴定为1琼脂糖凝胶电泳鉴定。 0025 本发明有益效果： 0026 本发明引物特异性好、 灵敏度高且扩增片段小， 整个RT-PCR检。
12、测过程可以在2h内 完成， 能够特异地检测出塞尼卡谷病毒， 可用于实验室检测和临床辅助诊断， 具有重要现实 意义。 0027 本发明提供了一种检测塞尼卡谷病毒的方法， 丰富了该病毒检测的技术手段， 同 时该方法特异性和灵敏度好， 检测速度快， 具有很好的应用价值。 说明书 2/4 页 5 CN 107034313 A 5 附图说明 0028 图1塞尼卡谷病毒RT-PCR方法特异性试验结果:M为DNAMarker2000， 1为阳性对照， 2为阴性对照， 37分别为口蹄疫、 猪瘟、 伪狂犬、 蓝耳、 圆环疫苗样品。 0029 图2塞尼卡谷病毒RT-PCR方法灵敏度试验结果:M为DNAMarker。
13、2000， 1为阴性对照， 2为阳性对照， 37分别为阳性对照的10倍梯度稀释的样品， 其稀释梯度依次为： 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5。 0030 图3临床样品的塞尼卡谷病毒检测结果： M为DNAMarker2000， 1为阳性对照， 2为阴 性对照， 3和4为临床样品。 具体实施方式 0031 为了更好地说明本发明所解决的问题、 所采用的技术方案和所达到的效果， 现结 合具体实施例和相关资料进一步阐述。 需要说明的是， 本发明内容包含但不限于以下实施 例及其组合实施方式。 0032 实施例一 0033 1、 引物设计： 由于塞尼卡谷病毒为新发现的致病病毒， 当时。
14、国内还没有建立普通 PCR检测技术， GenBank上能找到的基因序列也极为有限， 我们将GenBank上仅有的塞尼卡谷 病毒SVV001株和11-55910-3株的基因序列进行比对， 并将其与同病毒科的多种病毒基因序 列进行比对， 找出其保守区域， 选定SVV001株的13361662位基因片段作为目标， 然后 BLAST进一步确定其保守性。 通过Oligo6.0引物设计软件在该保守序列上设计一对扩增目 的带为327bp的引物SVVUP/SVVDN， 引物序列如下： 0034 SVVUP： 5 -GATGTATAAACCTTCTC-3 (SEQIDNO： 1) 0035 SVVDN： 5 -。
15、ATTGTAAGTGCCAAGAG-3 (SEQIDNO： 2)。 0036 2、 样本RNA的提取： 使用AxyGen的DNA/RNA小量提取试剂盒， 按照使用说明书提取 模板RNA， -70保存备用。 0037 3、 RT-PCR反应： 使用TaKaRa的一步法RT-PCR试剂盒， 按照使用说明书以步骤(2)中 所提取的样本RNA作为模板RNA进行RT-PCR反应。 12.5 l反应体系如下： 0038 序号组分体积( l) 121StepBuffer6.25 2PrimeScript1StepEnzymeMix0.5 3SVVUP(10 M)(SEQIDNO： 1)0.25 4SVVDN。
16、(10 M)(SEQIDNO： 2)0.25 5模板RNA0.5 6无核酸酶水补足至12.5 0039 经优化的反应程序如下： 逆转录： 50， 30min； 预变性： 95， 2min； (变性： 94， 30s； 退火： 56， 30s； 延伸： 72， 45s)扩增30个循环； 后延伸： 72， 10min； 最后降温至4。 0040 4、 检测结果的判定： RT-PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳鉴定， 若能扩增出大小为 327bp的单一目的条带， 则判定该样品为塞尼卡谷病毒阳性。 说明书 3/4 页 6 CN 107034313 A 6 0041 实施例二 特异性检验 0042 按照实施例。
17、一所述的RT-PCR反应体系和反应程序， 将样本模板RNA分别换成口蹄 疫、 猪瘟、 伪狂犬、 蓝耳、 圆环疫苗样品， 以本实验室检测阳性并经测序鉴定过的塞尼卡谷病 毒阳性样品(即之后命名为CH-01-2015株(KT321458)的病毒病料RNA样品)为阳性对照， 进 行RT-PCR反应， RT-PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳鉴定， 电泳结果如图1所示， 结果显示仅阳 性对照泳道327bp处出现单一条带， 说明该方法特异性好。 0043 实施例三 灵敏度检验 0044 按照实施例一所述的RT-PCR反应体系和反应程序， 以实施例二中的阳性对照RNA 作为阳性对照， 并将该阳性样品RNA按10-。
18、1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5进行10倍梯度稀释， 以蒸馏 水为阴性对照， 进行RT-PCR反应， RT-PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳鉴定， 电泳结果如图2所 示。 结果显示稀释100(10-2)倍条带仍较明显， 稀释1000(10-3)倍仍有不明显但肉眼可见的 条带， 表明该方法灵敏度较高。 0045 实施例四 临床样本检测 0046 按照实施例一所述的RT-PCR反应体系和反应程序进行RT-PCR反应， 以实施例二中 的阳性对照RNA作为阳性对照， 以蒸馏水为阴性对照， 对两个疑似发生塞尼卡谷病毒病的临 床样品进行检测， 模板RNA的提取参照实施例一。 RT-PCR产物。
19、经1琼脂糖凝胶电泳鉴定， 电 泳结果如图3所示。 结果显示阴阳性对照成立， 两个样品均为SVV阳性。 0047 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 4/4 页 7 CN 107034313 A 7 广东温氏食品集团股份有限公司 一对塞尼卡谷病毒的RT-PCR检测引物及RT-PCR检测方法 2 Oligo 6.0 1 17 DNA 人工序列 1 gatgtataaa ccttctc 17 2 17 DNA 人工序列 2 attgtaagtg ccaagag 17 序列表 1/1 页 8 CN 107034313 A 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 107034313 A 9 图3 说明书附图 2/2 页 10 CN 107034313 A 10 。