一种多肽混合原液的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810952493.7 (22)申请日 2018.08.21 (71)申请人 启迪汉洱康 （嘉兴） 生物科技有限公 司 地址 314000 浙江省嘉兴市南湖区亚太路 705号14F1401室-B (72)发明人 周碧柳李均翔陆益项生群 毛书辉董云加俞剑锋沈云霞 (74)专利代理机构 嘉兴启帆专利代理事务所 (普通合伙) 33253 代理人 程开生 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) C12P 21/00(2006.01) C07K 1/34(2。

2、006.01) (54)发明名称 一种多肽混合原液的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种多肽混合原液的制备方 法， 包括三个步骤： 一、 脐带华通氏胶的分离； 二、 分离间充质干细胞； 三、 提取高纯度的多肽混合 原液； 本发明的多肽混合原液的制备方法对比现 有技术中的制备方法具备下述有益效果： 能够高 效分离出华通氏胶， 然后从华通氏胶中分离纯化 出高纯度高活力的间充质干细胞， 继续扩增传代 培养， 从而在干细胞高速增殖期收集提取多肽混 合原液。 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 CN 109055308 A 2018.12.21 CN 109055308 A 1.一种多肽混合原液的。

3、制备方法， 其特征在于： 包括如下步骤： 1)脐带华通氏胶的分离 a采集脐带， 将脐带放入无菌一次性脐带采集瓶， 浸没在保存液中， 拧紧瓶盖， 并放入4 冰箱存放； b在无菌环境下测定脐带重量和长度； c将脐带剪成2cm小段， 剔除脐带的动脉和静脉， 分离华通氏胶； d收集华通氏胶， 滴入12ml培养液， 将华通氏胶剪碎， 呈糊状； f贴壁培养， 将步骤1)d中搅碎的华通氏胶加入到细胞培养瓶中， 每个培养皿加入1毫升 的华通氏胶和23毫升的培养液， 让华通氏胶完全覆盖培养皿底部， 放入细胞培养箱中培 养； 2)分离间充质干细胞 a待华通氏胶生长7天左右后观察细胞生长状况， 有细胞从组织块边沿慢。

4、慢开始爬出， 然后细胞快速增值， 到15天左右， 将组织去除； b细胞传代细胞融合度达到8590开始进行细胞传代和多肽混合原液收集； c从培养瓶中吸出培养上清收集间充质干细胞分泌多肽原液于专用收集瓶中； d加入PBS洗涤， 加入洗涤液， 前后摇晃容器数次后吸出洗涤液丢弃， 加入胰酶3ml， 摇晃 培养瓶使得胰酶完全覆盖细胞层， 显微镜下观察细胞变圆， 肉眼可见贴壁细胞层有大量细 胞掉落时， 倾斜培养瓶， 加入大于所用胰酶一倍体积的培养基终止消化， 轻轻吹打细胞层表 面， 分散培养基， 吸取细胞悬液于15ml离心管内， 1000rpm离心5分钟， 倒去上清液， 加入5ml 培养基重悬， 离心洗涤。

5、倒去上清液， 加入7ml培养基重悬细胞， 混合均匀， 加入T-75培养瓶 中， 放入培养箱继续培养。 3)提取高纯度的多肽混合原液 a多肽混合原液的提取； b多肽混合原液的分离和提纯； c将收集的脐带间充质干细胞分泌的多肽混合原液采用微量分光光度计进行蛋白浓度 测定： d将收集到的多肽混合原液进行质量检测。 2.根据权利要求1所述的多肽混合原液的制备方法， 其特征在于： 步骤3)b包括如下步 骤 (1)低速低温粗分离 a打开离心机， 设置温度为4度， 待离心机温度降温， 将收集的多肽混合原液混匀， 分别 加入到两个250毫升的离心管中， 4度， 1000RPM， 10MIN进行离心； b将离心。

6、收集的多肽混合原液收集到专用收集瓶中， 以备进一步的提纯； (2)粗分离的多肽混合原液进一步纯化 a采用一次性真空换膜过滤器进行过滤。 3.根据权利要求2所述的多肽混合原液的制备方法， 其特征在于： 所述真空换膜过滤器 包括抽真空装置和过滤装置， 所述过滤装置包括滤膜， 上层加液装置和下层的接受装置， 所 述为两层膜， 包括一层预过滤膜和一层过滤膜， 所述一层预过滤膜为AP20玻璃纤维圆片， 所 述一层过滤膜为0.22um的过滤膜。 权利要求书 1/2 页 2 CN 109055308 A 2 4.根据权利要求1所述的多肽混合原液的制备方法， 其特征在于： 所述步骤1)f中的细 胞培养箱中的培。

7、养条件为： 5CO2， 温度为37。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109055308 A 3 一种多肽混合原液的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种多肽混合原液的制备方法。 背景技术 0002 脐带是连接于胎儿与胎盘之间索条状结构， 长约4060cm， 粗约1.52.0cm.含一 脐静脉、 两条脐动脉， 血管周围为华通氏胶。 形状如绳索， 表面光滑透明， 内含结缔组织和一 支脐静脉， 一对脐动脉。 脐静脉沿着胎儿腹壁内面通过肝的血窦、 脐动脉与胎儿主动脉相通 连。 这两种血管的另一端， 形成许多相互联系的毛细血管网， 分布于胎盘绒毛内。 通过胎盘 绒毛上皮。

8、的渗透作用， 胎儿盘液与绒毛间隙内母体血液之间进行物质交换。 脐带华通氏胶 是胎儿脐带除去外膜、 剔除2条动脉和1条静脉后剩余的凝胶状物质， 主要成分是黏多糖， 脐 带华通氏胶内含丰富的间充质干细， 一根脐带含有的间充质干细胞相当于5000毫升骨髓分 离出的间充质干细胞。 0003 目前普遍从脐带组织中分离间充质干细胞的方法主要有： 消化法， 组织直接贴壁 法。 消化法存在消化时间不好控制， 消化酶会损伤细胞， 从而影响细胞活力和形态， 目前组 织工程细胞分离普遍不提倡使用消化法。 组织贴壁法是目前使用比较多的， 直接将脐带组 织剪成2厘米小段后去除静脉和动脉后剪碎成肉眼可见糊状后直接用培养瓶。

9、贴壁培养， 组 织贴壁法操作简单， 分离细胞活力强等优点， 但是存在贴壁时间长， 对培养基营养要求高， 血清质量要求高。 分离高纯度的华通氏胶存在以下两个难点： 1、 剔除动静脉， 如若剔除不干 净， 则细胞纯度会降低； 2、 无法有效分离出纯度高的华通氏胶， 从而无法纯化出高纯度高活 力的减充质干细胞， 进而会影响后期的多肽混合原液的收集提取。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种多肽混合原液的制备方法， 该制备方法能够高效分离出 华通氏胶， 然后从华通氏胶中分离纯化出高纯度高活力的间充质干细胞， 继续扩增传代培 养， 从而在干细胞高速增殖期收集提取多肽混合原液。 0005 为实现上述。

10、目的， 本发明是通过下列技术方案实现的： 0006 本发明提供了一种一种多肽混合原液的制备方法， 包括如下步骤： 0007 1)脐带华通氏胶的分离 0008 a采集脐带， 将脐带放入无菌一次性脐带采集瓶， 浸没在保存液中， 拧紧瓶盖， 并放 入4冰箱存放； 0009 b在无菌环境下测定脐带重量和长度； 0010 c将脐带剪成2cm小段， 剔除脐带的动脉和静脉， 分离华通氏胶； 0011 d收集华通氏胶， 滴入12ml培养液， 将华通氏胶剪碎， 呈糊状； 0012 f贴壁培养， 将步骤1)d中搅碎的华通氏胶加入到细胞培养瓶中， 每个培养皿加入1 毫升的华通氏胶和23毫升的培养液， 让华通氏胶完全。

11、覆盖培养皿底部， 放入细胞培养箱 中培养； 说明书 1/7 页 4 CN 109055308 A 4 0013 2)分离间充质干细胞 0014 a待华通氏胶生长7天左右后观察细胞生长状况， 有细胞从组织块边沿慢慢开始爬 出， 然后细胞快速增值， 到15天左右， 将组织去除； 0015 b细胞传代细胞融合度达到8590开始进行细胞传代和多肽混合原液收集； 0016 c从培养瓶中吸出培养上清收集间充质干细胞分泌多肽原液于专用收集瓶中； 0017 d加入PBS洗涤， 加入洗涤液， 前后摇晃容器数次后吸出洗涤液丢弃， 加入胰酶3ml， 摇晃培养瓶使得胰酶完全覆盖细胞层， 显微镜下观察细胞变圆， 肉眼可。

12、见贴壁细胞层有大 量细胞掉落时， 倾斜培养瓶， 加入大于所用胰酶一倍体积的培养基终止消化， 轻轻吹打细胞 层表面， 分散培养基， 吸取细胞悬液于15ml离心管内， 1000rpm离心5分钟， 倒去上清液， 加入 5ml培养基重悬， 离心洗涤倒去上清液， 加入7ml培养基重悬细胞， 混合均匀， 加入T-75培养 瓶中， 放入培养箱继续培养。 0018 3)提取高纯度的多肽混合原液 0019 a将收集的脐带间充质干细胞分泌的多肽混合原液采用微量分光光度计进行蛋白 浓度测定： 0020 b将收集到的多肽混合原液进行质量检测。 0021 优选的， 步骤3)b包括如下步骤 0022 (1)低速低温粗分离。

13、 0023 a打开离心机， 设置温度为4度， 待离心机温度降温， 将收集的多肽混合原液混匀， 分别加入到两个250毫升的离心管中， 4度， 1000RPM， 10MIN进行离心； 0024 b将离心收集的多肽混合原液收集到专用收集瓶中， 以备进一步的提纯； 0025 (2)粗分离的多肽混合原液进一步纯化 0026 a采用一次性真空换膜过滤器进行过滤。 0027 优选的， 所述真空换膜过滤器包括抽真空装置和过滤装置， 所述过滤装置包括滤 膜， 上层加液装置和下层的接受装置， 所述为两层膜， 包括一层预过滤膜和一层过滤膜， 所 述一层预过滤膜为AP20玻璃纤维圆片， 所述一层过滤膜为0.22um的。

14、过滤膜。 0028 优选的， 所述步骤1)f中的细胞培养箱中的培养条件为： 5CO2， 温度为37。 0029 本发明具有以下有益效果： 0030 1、 步骤1)中， 分离耗时短， 降低了污染的几率， 进而能够高效的分离出华通氏胶， 进而能够从华通氏胶中分离纯化出高纯度高活力的间充质干细胞， 通过继续扩增传代培 养， 最终能够在干细胞高速增殖期收集提取多肽混合原液， 具体为： (1)本发明分离纯化出 的高纯度高活力的间充质干细胞的倍增时间为48小时， 传统提取的间充质干细胞倍增时间 为72小时以上； (2)传统方法提取的间充质干细胞会随着扩增代数的增加而细胞慢慢开始 分化从而失去增殖性， 本发。

15、明方案分离出的间充质干细胞在P15代， 甚至P20代以后的细胞 依旧保持着很好的增殖能力， 从而本发明方案的生产工艺可以在保证多肽混合原液的质量 的同时有效提高了多肽混合原液的产量； 0031 2、 粗分离的多肽混合原液进一步纯化采用两层滤膜具备下述优点： (1)由于收集 的多肽混合原液含有大量的死细胞碎片、 细胞聚集团、 以及残留的牛血清蛋白聚集物， 需要 进行进一步的分离和提纯， 具体为通过两步法分离， 一步离心， 一步过滤。 提取后的多肽混 合原液不含细胞碎片等各种沉淀和杂质， 原液澄清， 原液为无色或者淡黄色， 可以满足化妆 说明书 2/7 页 5 CN 109055308 A 5 品。

16、原料的需求； (2)此方法方面大规模的原液提纯， 成本低， 操作规范化， 方便了后续多肽混 合原液的工艺化和规模化的生产； (3)过滤步骤中采用了预过滤膜和0.22um过滤膜过滤， 可 以更有效的过滤， 一方面过滤掉原液中的杂质， 另一方面同时可以通过过滤达到除菌的目 的， 进而避免了细胞培养过程中加抗生素， 还杜绝了细胞培养过程中的可能的染菌从而影 响多肽混合原液的质量， 最终使得本发明提纯后的多肽混合原液不仅纯度高而且在工艺生 产后可以低温存储达两年以上。 附图说明 0032 图1本发明的步骤二中间充质干细胞从华通氏胶中爬出图； 0033 图2本发明的显微镜下观察脐带间充质干细胞形态图； 。

17、0034 图3本发明收集的脐带间充质干细胞分泌的多肽混合原液的微量分光光度计进行 蛋白浓度测定表。 0035 图4本发明提取的间充质干细胞倍增时间图； 0036 图5本发明脐带间充质干细胞P20细胞生长曲线图； 0037 图6本发明的提取工艺与传统工艺多肽混合原液产量对比图。 具体实施方式 0038 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 以下结合和最佳实施例对本发 明作进一步说明： 0039 本发明的多肽混合原液的制备方法分为如下三个步骤： 0040 一、 脐带华通氏胶的分离 0041 1、 脐带采集 0042 (1)采集前严格核对脐带产妇的信息(姓名、 年龄、 既往史等)， 符合脐。

18、带供者采集 标准者方可进行采集 0043 (2)检查脐带采集的所有物品， 脐带采集瓶应放置4保存， 检查采集瓶外包装是 否完整， 有无渗液及限用期限， 检查有无采血管及脐带结扎包 0044 (3)脐带采集严格按照无菌操作， 新生儿娩出后10秒钟内， 在距新生儿脐部约5厘 米处用两把止血钳夹住， 从两钳间剪断脐带， 新生儿抱走正常处理 0045 (4)从止血钳夹住的脐带靠近止血钳的位置， 用碘伏浸润的消毒纱布向胎盘方向 快速擦拭， 清除血液、 羊水及胎粪等污物， 消毒两遍， 消毒范围为4-5厘米。 并用此纱布扶持 住脐带断端， 拿5ML针管斜面朝下或侧面小角度刺入， 抽取5ml脐带静脉血， 注入。

19、采血管中， 用做病原学检测。 0046 (5)采集脐血样后， 结扎脐带， 隔离穿刺部位待胎盘娩出后， 在靠近胎盘处剪断脐 带， 将脐带内脐血尽量驱赶干净， 然后将这一端结扎。 结扎的脐带用浸有0.9生理盐水及 75酒精的无菌医用纱布擦试脐带， 清除脐带表面羊水、 血液及胎粪等污物， 污染严重者用 生理盐水充分冲洗。 脐带采集的长度不小于15厘米， 采集的脐带需保持完整， 无针眼及破 损， 尽量避免脐带与其他物品接触。 将脐带放入无菌一次性脐带采集瓶， 浸没在保存液中， 拧紧瓶盖。 0047 填写采集瓶标签上的内容， 脐带瓶及采血管放入外包装袋内， 及时交给实验室工 说明书 3/7 页 6 CN。

20、 109055308 A 6 作人员或者放入4冰箱暂时存放， 禁止冰冻。 0048 2、 无菌环境下测量脐带重量和长度 0049 (1)将采集的脐带收集入实验室， 提前准备好手术器械。 0050 (2)用加双抗的PBS重新脐带， 将脐带内残留的血液清洗干净。 0051 (3)将清洗干净的脐带放入脐带华通氏胶分离盘中测量脐带的重量和长度。 0052 3、 在脐带华通氏胶分离中剔除脐带动静脉 0053 (1)将清洗干净的脐带剪成2cm左右的小段， 每一段的脐带含一脐静脉、 两条脐动 脉,用有齿镊子去除动脉和静脉， 分离华通氏胶。 0054 4、 将分离华通氏胶收集到搅碎剪槽中， 滴入12毫升的培养。

21、液混合， 然后将华通 氏胶剪碎成肉眼可见糊状。 0055 5、 贴壁培养： 0056 将搅碎的华通氏胶加入到75cm2细胞培养瓶中， 每个培养皿加入约1毫升的步骤5 中的华通氏胶和23毫升的培养液， 让华通氏胶完全覆盖培养皿底部。 放入5的CO2， 37 细胞培养箱中培养。 在贴壁培养过程中尽量不要摇动细胞培养瓶。 0057 二、 间充质干细胞的分离 0058 1、 待华通氏胶生长7天左右后观察细胞生长状况， 有细胞从组织块边沿慢慢开始 爬出， 然后细胞快速增值， 到15天左右， 将组织去除， 根据细胞生长情况选择传代时机。 0059 如图1所示， 间充质干细胞从华通氏胶中爬出。 0060 2。

22、细胞传代与多肽混合原液收集。 0061 材料准备： 0062 T-75培养瓶、 15ml离心管、 试管架、 5ml移液管、 10ml移液管、 酒精灯、 废液缸。 试剂： 75酒精、 加10胎牛培养基、 PBS洗涤液、 胰酶。 0063 (1)观察细胞融合度达到85-90开始进行细胞传代和多肽混合原液操作 0064 (2)从培养瓶中吸出培养上清收集间充质干细胞分泌多肽原液于专用收集瓶中。 0065 (3)加入PBS洗涤。 从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入洗涤液， 前后摇晃容 器数次， 吸出洗涤液丢弃， 向培养瓶中加入胰酶3ml， 轻轻摇晃培养瓶使胰酶完全覆盖细胞 层， 显微镜下观察细胞变圆，。

23、 肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落时， 倾斜培养瓶， 加入大 于所用胰酶一倍体积的培养基终止消化， 轻轻吹打细胞层表面数次， 使培养基分散， 吸取细 胞悬液于15ml离心管内， 1000rpm离心5分钟， 轻轻倒去上清液， 再加入5ml培养基重悬， 离心 洗涤倒去上清液， 加入7ml培养基重悬细胞， 混合均匀， 加入T-75培养瓶中， 放入培养箱继续 培养。 0066 如图2所示为显微镜下观察脐带间充质干细胞形态： 成短梭形态， 形成规则排列(* 40) 0067 三、 提取高纯度的多肽混合原液(收集的多肽混合原液含有大量的死细胞碎片， 细 胞聚集团， 和残留的牛血清蛋白聚集物， 需要进行进一。

24、步的分离和提纯) 0068 a采用低速低温粗分离， 目的为在保持原液中的蛋白活性的情况下去除沉淀等碎 片 0069 (1)首先打开离心机， 设置温度为4度， 待离心机温度降温； 2)将收集的多肽混合原 液混匀， 分别加入到两个250毫升的离心管中， 4度， 1000RPM， 10MIN进行离心； 3)将离心收集 说明书 4/7 页 7 CN 109055308 A 7 的多肽混合原液收集到专用收集瓶中， 以备进一步的提纯。 0070 b采用大容量(1L)0.22um过滤器进行进一步的纯化， 目的为了获得更高纯度的多 肽混合原液 0071 (2)采用一次性真空换膜过滤器进行过滤， 真空换膜过滤器。

25、包括两部分， 一部分为 抽真空装置和过滤装置， 过滤装置为一次性使用， 包含滤膜， 上层加液装置和下层的接受装 置。 所选的膜必须采用两层膜， 一层预过滤膜， 预过滤膜为AP20玻璃纤维圆片， 另外一层过 滤膜为0.22um的过滤膜。 具体操作过程为： 首先， 将双层膜安装好， 然后将经过粗过滤的原 液加入的过滤装置的上层， 然后使用抽真空装置进行抽真空过滤， 过滤好的原液收集在收 集瓶中。 提取后的多肽混合原液不含细胞碎片等各种沉淀和杂质， 原液澄清， 为无色或者淡 黄色， 满足化妆品原料的需求。 0072 将提纯后的多肽混合原液进行蛋白浓度和质量监测 0073 (1)如图3所示为收集的脐带。

26、间充质干细胞分泌的多肽混合原液采用微量分光光 度计进行蛋白浓度测定， 从图3可知多肽混合液总蛋白含量为3.2 g/ml， 0074 (2)将收集到的多肽混合原液进行质量检测： 0075 检测内容如表14所示 0076 从多个角度对收集到的多肽混合原液进行了质量检测： 0077 首先是： 外观检测， 外观检测的内容包括： 形态， 澄清度， 色泽， 沉淀， 气味， 如表1所 示 0078 表1多肽混合原液外观检测 0079 0080 本方案检测的多肽混合原液具有以下特点： 本发明经过提纯， 最终收集到的多肽 混合原液为澄清液体溶液。 在细胞培养过程中， 细胞本身要进行新陈代谢， 培养过程中会有 细。

27、胞死亡从而产生各种碎片， 细胞分泌出来的蛋白也会存在析出聚集成团的现象， 导致收 集到的上清液会有各种浑浊沉淀杂质等， 导致多肽混合原液的质量稳定性很差， 本发明的 制备方法中采用了两步法分离纯化出的多肽混合原液澄清度非常高， 质量稳定性也好， 可 以满足化妆品原料质量要求。 另一方面， 通过分离纯化后的多肽混合原液不存在气味。 0081 其次为传染性病原体微生物检测， 如表2所示 0082 表2传染性病原体微生物检测 说明书 5/7 页 8 CN 109055308 A 8 0083 0084 本多肽混合原液收集在脐带间充质干细胞天然分泌的， 其标本来源于生物源性， 因此本方案对多肽混合原液。

28、进行传染性病院微生物检测， 以保证所生产的多肽混合原液生 物安全性。 0085 其次为重金属检测， 如表3所示 0086 表3重金属检测 0087 0088 第三： 重金属检测。 我国重金属的污染很严重， 目前的从各种植物等提取使用化妆 品原料都可能存在重金属的污染。 本发明方案所提取的多肽混合原液来源如人脐带间充质 干细胞， 培养过程中培养基和添加因子等都通过严格的检测。 因此本分离方案分离提取的 多肽混合原液不存在重金属， 其作为化妆品原料应用具有很好的安全性。 0089 微生物检测， 如表3所示 0090 表4微生物检测 0091 0092 多肽混合原液中富含各种干细胞脐带天然分泌因子和。

29、多种氨基酸和维生素成分， 营养丰富。 脐带间充质干细胞培养过程复杂， 操作步骤多， 因此微生物污染是多肽混合原液 生产工艺过程中非常关键的问题， 微生物污染决定着多肽混合原液的安全性和质量稳定 性， 本生产方案： 脐带分离培养以及多肽混合原液生产过程中的所有工艺都在万级洁净间 的局部百级生物安全柜中生产， 以保证生产过程中的严格无菌状态。 再者， 本发明的制备方 案在多肽混匀原液提纯过程中经过了0.22um过滤膜过滤， 在获得高纯度的多肽混合原液的 同时可以有效的去除多肽混合原液中可能的细菌真菌污染。 从而获得更高纯度和更高质量 说明书 6/7 页 9 CN 109055308 A 9 稳定性。

30、的多肽混合原液。 0093 本发明的步骤1)中， 能够高效的分离出华通氏胶， 进而能够从华通氏胶中分离纯 化出高纯度高活力的间充质干细胞， 通过继续扩增传代培养， 最终能够在干细胞高速增殖 期收集提取多肽混合原液， 具体为： (1)本发明分离纯化出的高纯度高活力的间充质干细胞 的倍增时间为48小时， 传统提取的间充质干细胞倍增时间为72小时以上， 如图4所示为本发 明提取的间充质干细胞倍增时间图。 本发明的倍增时间有效缩短了， 所以更高活力的细胞 分泌的血管内皮生长因子(VEGF)、 表皮生长因子(EGF)， 成纤维细胞生长因子(bFGF)、 肝细 胞生长因子(HGF)转化生长因子 1(TGF。

31、B1)， 等多肽混合因子的浓度更高， 分泌的蛋白谱会 更广； (2)传统方法提取的间充质干细胞会随着扩增代数的增加而细胞慢慢开始分化从而 失去增殖性， 本发明方案分离出的间充质干细胞在P15代， 如图5所示， 甚至P20代以后的细 胞依旧保持着很好的增殖能力， 从而本发明方案的生产工艺可以在保证多肽混合原液的质 量的同时有效提高了多肽混合原液的产量， 如图6所示为传统工艺与本发明的提取工艺一 根脐带多肽混合原液产量对比图， 如图6所示， 一根脐带(按照15公分的脐带计算)传统的方 法可获得约5*106次方的种子细胞， 细胞培养到P10代， 每跟脐带可以获得多肽混合原液最 大的量为： 6210毫。

32、升。 本方案改进的一方面提高了种子细胞的分离量同时改进的方案可以 保持间充质干细胞传代至p15代以上， 因此每根脐带可以获得的多肽混合原液的产量可以 达到18210毫升， 对比现有技术的提取方案， 本发明的提取方案最终产能提升了约3倍。 0094 以上所述仅为本发明的优选实施方式， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利 用本发明所作的等效变换， 均在本发明的专利保护范围内。 说明书 7/7 页 10 CN 109055308 A 10 图1 图2 说明书附图 1/3 页 11 CN 109055308 A 11 图3 图4 说明书附图 2/3 页 12 CN 109055308 A 12 图5 图6 说明书附图 3/3 页 13 CN 109055308 A 13 。