技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物及试剂盒。
背景技术
磺酰脲类药物(sulfonylureas，SU)是治疗2型糖尿病的主要口服药物之一，通过结合磺酰脲类受体使胰岛β细胞钾通道关闭，从而刺激胰岛素分泌。研究发现，磺酰脲类药物的药效个体差异较大，大约10％-20％患者疗效高于平均水平，但仍有10％-20％患者最初服用磺酰脲类药物后治疗失败。有研究指出，发生这种现象多是由于作用于KATP通道的、分别由KCNJ11和ABCC8编码的Kir6.2和SUR1受体以及代谢磺酰脲类药物的CYP2C9发生变异引起的。
CYP2C9是CYP450家族中常见的药物酶代谢基因，常见的等位基因以野生型CYP2C9*1和突变型CYP2C9*2和CYP2C9*3最为常见。研究发现，CYP2C9*2的活性仅是正常功能者的40％左右，CYP2C9*3的活性仅是正常功能者的10％，突变患者可使磺酰脲类药物的肾清除率显著降低，其药物半衰期明显延长。
磺脲类药物作用于胰岛β细胞膜上的ATP敏感性钾通道(KATP)，从而关闭钾通道，刺激胰岛β细胞释放胰岛素。ATP敏感性钾通道组成：亚基磺脲类受体(SUR)+亚基内向整流钾通道(Kir)。研究发现，编码Kir6.2的基因KCNJ11的E23K多态性可能影响β细胞对磺酰脲类药物的反应，从而减少胰岛素的分泌，增加继发性失效发生的风险。
ABCC8基因编码SUR1受体，磺酰脲类药物通过与SUR1受体结合，从而使钾通道关闭，刺激胰岛素的分泌，进而产生降血糖的作用。研究发现，ABCC8基因S1369A位点多态性与磺酰脲类药物的疗效有关，该位点G等位基因携带者对磺酰脲类较为敏感，治疗效果优于T等位基因型携带者。
基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究，已经报道的方法包括直接测序法、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、TaqMan PCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplification refractory mutation system，扩增阻滞突变系统)法。
其中，直接测序法能够发现一些新的未知突变，但检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列步骤，费时费力。
ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶，特异性地识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。然而，现在市场上的类似试剂盒价格昂贵，应用受到限制。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物及试剂盒。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物，该引物组合物包括CYP2C9引物组、KCNJ11引物组及ABCC8引物组；
所述的CYP2C9引物组包括以下引物：
P1-FW：5’-AGAGGAGCATTGAGGAAC-3’；
P1-FS：5’-AAGAGGAGCATTGAGGACT-3’；
P1-R：5’-TAACAACCAGGACTCAT-3’；
P2-FW：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’；
P2-FS：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’；
P2-R：5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’；
所述的KCNJ11引物组包括以下引物：
P3-F：5’-GCACGGTACCTGGGCAC-3’；
P3-RW：5’-GCACGGTACCTGGGCAT-3’；
P3-RS：5’-CACCGAGAGGACTCTGCA-3’；
所述的ABCC8引物组包括以下引物：
P4-FW：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；
P4-FS：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；
P4-R：5’-ACTGCGATGTCTGAATA-3’。
进一步地，该引物组合物还包括内控引物组，该内控引物组包括以下引物：
CF：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3’；
CR：5’-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3’。
所述的引物组合物在制备磺酰脲类药物相关基因的基因多态性检测试剂中的应用。
用于检测磺酰脲类药物相关基因的试剂盒，该试剂盒包括所述的引物组合物。
进一步地，该试剂盒还包括PCR反应液，该PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq酶、MgCl2、dNTPs及SYBR Green I染料。所述的PCR缓冲液为Tris-HCl缓冲液、Tris-乙酸(TAE)缓冲液或Tris-硼酸(TBE)缓冲液。
作为优选的技术方案，该PCR反应液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶(酶活力为2.5U)、1.0-5.0mM MgCl2、4.0-20.0mM dNTPs(包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP各1.0-5.0mM)及SYBR Green I染料。
进一步地，该试剂盒还包括阳性对照液及阴性对照液。
作为优选的技术方案，所述的阳性对照液为含有试剂盒内可检测的4个位点对应的质粒混合液，质粒混合液中含有4种不同的带有待检测突变位点的CYP2C9、KCNJ11和ABCC8等位基因，质粒混合液中的质粒浓度为1000copies/μl；所述的阴性对照液为Tris-HCL缓冲液，该Tris-HCL缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。
磺酰脲类药物相关基因(CYP2C9、KCNJ11和ABCC8)的基因多态性检测方法，包括以下步骤：
1)待测样品的处理和模板的提取；
2)利用所述的引物组合物配制荧光定量PCR反应体系；
3)釆用ARMS法，利用各引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBR GreenI染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。
作为优选的技术方案，步骤1)所述的待测样品包括全血、血浆、血清或胸腔积液。
作为优选的技术方案，步骤2)中所述的PCR反应体系中，各组分的含量如下：
其中，引物组合物中各引物的浓度均为300nM。
本发明磺酰脲类药物相关基因的基因多态性检测试剂盒采用SYBR染料法，建立了针对人类相关基因(CYP2C9、KCNJ11和ABCC8)的基因多态性(如表1所示)的多重实时PCR检测方法。本发明经过大量试验，研究和分析成功筛选出能够用于快速、灵敏、有效地检测CYP2C9、KCNJ11和ABCC8基因多态性的引物组合物，并利用这些引物开发出用于检测磺酰脲类药物相关基因多态性的方法和试剂盒。
表1磺酰脲类药物相关基因的基因多态性形式
磺酰脲类药物相关基因的特异性引物见下表2-5，表6为内参的检测引物。
表2 CYP2C9(430)基因多态性的检测引物
表3 CYP2C9(1075)基因多态性的检测引物
表4 KCNJ11(23)基因多态性的检测引物
表5 ABCC8(1369)基因多态性的检测引物
表6内参的检测引物
本发明中，根据各基因的碱基突变形式，利用ARMS-PCR方法，设计出与野生型和突变型基因片段相适配的引物，并采用常规引物合成方法合成出这些引物，用于对相关基因的基因多态性进行检测。ARMS-PCR方法的基本原理为：如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸，因此根据已知点突变设计相应的引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法，得到一种能够快速、敏感而且简便地检测磺酰脲类药物疗效相关基因(CYP2C9、KCNJ11和ABCC8)基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括特异性ARMS检测引物、内控引物及PCR反应液，通过设计ARMS引物以及将Scorpions探针换为SYBR染料，以使检测成本大大降低，更适合中国患者CYP2C9、KCNJ11和ABCC8基因多态性的检测，具有检测快速、灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确的优势，适于推广应用；
2)试剂盒可在50ng野生型基因组DNA背景下准确检出1％的突变DNA，且针对性设计不同突变位点的特异性引物，使用荧光定量PCR进行检测，检测过程均为闭管反应，大大降低污染。
附图说明
图1为本发明基因多态性检测试剂盒检测CYP2C9(430)样品的扩增曲线图；
图2为本发明基因多态性检测试剂盒检测CYP2C9(1075)样品的扩增曲线图；
图3为本发明基因多态性检测试剂盒检测KCNJ11(23)样品的扩增曲线图；
图4为本发明基因多态性检测试剂盒检测ABCC8(1369)样品的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1：
1、样本处理和核酸提取：
利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，具体操作参见试剂盒说明书，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在5～50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，低于5ng/μL者重新进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA应立即进行检测，否则于-20℃以下保存，保存时间不能超过6个月。试剂盒质控品使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。
2、试剂配制：
2.1配制说明：检测反应设置内控检测、阴性质控品检测和阳性质控品检测。
2.2配制过程：
提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。确定每个检测位点反应数N和内控检测数M，N＝待检样本数(n)+质控品数(2)+1；M＝待检样本数(n)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下表7：
表7 PCR反应体系配制表
取9个灭菌离心管配制上述9个反应体系，试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒。然后将上述混合液23μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。
3、加样：
表8样品及质控品上样表
名称 成分 加样量 待检样本 样本DNA 2μL STD1 阳性质控品P1 2μL STD2 阳性质控品P2 2μL STD3 阳性质控品P3 2μL STD4 阳性质控品P4 2μL STD5 阳性质控品P5 2μL STD6 阳性质控品P6 2μL STD7 阳性质控品P7 2μL STD8 阳性质控品P8 2μL NTC 阴性质控品P9 2μL
注：STD代表阳性质控品；NTC代表阴性质控品。
根据表8提示的上样比例，将已处理样本、阳性质控品和阴性质控品分别加入反应管中，内控引物只需检测样本DNA即可，盖紧管盖(避免气泡产生)，2000rpm离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。
4、PCR扩增程序设置：
表9 PCR反应程序的设定
5、检验结果的解读：
利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBR Green染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。检测各样品的扩增曲线图如图1、图2、图3、图4所示。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。
实施例2：
用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物包括CYP2C9引物组、KCNJ11引物组及ABCC8引物组；
CYP2C9引物组包括以下引物：
P1-FW：5’-AGAGGAGCATTGAGGAAC-3’；
P1-FS：5’-AAGAGGAGCATTGAGGACT-3’；
P1-R：5’-TAACAACCAGGACTCAT-3’；
P2-FW：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’；
P2-FS：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’；
P2-R：5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’；
KCNJ11引物组包括以下引物：
P3-F：5’-GCACGGTACCTGGGCAC-3’；
P3-RW：5’-GCACGGTACCTGGGCAT-3’；
P3-RS：5’-CACCGAGAGGACTCTGCA-3’；
ABCC8引物组包括以下引物：
P4-FW：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；
P4-FS：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；
P4-R：5’-ACTGCGATGTCTGAATA-3’。
上述引物组合物应用在制备磺酰脲类药物相关基因的基因多态性检测试剂中。
用于检测磺酰脲类药物相关基因的试剂盒包括上述引物组合物及PCR反应液，该PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq酶、MgCl2、dNTPs及SYBR Green I染料。
实施例3：
用于检测磺酰脲类药物相关基因的引物组合物包括CYP2C9引物组、KCNJ11引物组及ABCC8引物组；
CYP2C9引物组包括以下引物：
P1-FW：5’-AGAGGAGCATTGAGGAAC-3’；
P1-FS：5’-AAGAGGAGCATTGAGGACT-3’；
P1-R：5’-TAACAACCAGGACTCAT-3’；
P2-FW：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’；
P2-FS：5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’；
P2-R：5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’；
KCNJ11引物组包括以下引物：
P3-F：5’-GCACGGTACCTGGGCAC-3’；
P3-RW：5’-GCACGGTACCTGGGCAT-3’；
P3-RS：5’-CACCGAGAGGACTCTGCA-3’；
ABCC8引物组包括以下引物：
P4-FW：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；
P4-FS：5’-CGTCAATGCCCTCATGT-3’；
P4-R：5’-ACTGCGATGTCTGAATA-3’。
该引物组合物还包括内控引物组，该内控引物组包括以下引物：
CF：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3’；
CR：5’-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3’。
上述引物组合物应用在制备磺酰脲类药物相关基因的基因多态性检测试剂中。
用于检测磺酰脲类药物相关基因的试剂盒包括上述引物组合物及PCR反应液，该PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq酶、MgCl2、dNTPs及SYBR Green I染料。
试剂盒还包括阳性对照液及阴性对照液。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。