技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术进行菌样快速检测的生物检测试剂，具体涉及一种绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
绿色魏斯氏菌（Weissella viridescens）属于乳杆菌目（Lactobacillales）明串珠菌科（Leuconostocaceae）魏斯氏菌属（Weissella），该菌在微观和宏观形态方面与乳酸菌的其它代表菌株相似，特别是容易与明串珠菌（Leuconostoc）和乳杆菌（Lactobacillus）相混淆。绿色魏斯氏菌为革兰氏阳性菌，呈不规则的短杆状，两端呈圆形或稍细小，成对或短链排列，在MRS琼脂培养基上形成透明的小菌落，呈微隆起圆形轮廓。
绿色魏斯氏菌具有异型发酵性新陈代谢，能够参与食品特别是肉制品的腐败变质。当暴露于氧气中时，一些肉制品，如香肠、真空包装肉、烟熏肉等会出现变绿的现象。研究认为，绿色魏斯氏菌是造成肉制品表面出现黏液并发绿的主要原因。黏液起初在单个菌落上出现，之后便逐渐形成一片绿色的黏液，并从肉制品的表面往内部渗透。存在于肉制品中的某些细菌会通过其正常的生理活动产生过氧化氢，而绿色魏斯氏菌具有较低的氧化还原电位，能够造成过氧化氢在肉制品中的积累。过氧化氢通过氧化亚硝基肌色原，最终导致肉制品发绿。绿色魏斯氏菌已经成为威胁肉制品质量与安全的重要腐败菌，给肉类加工行业造成显著的经济损失。
目前针对绿色魏斯氏菌的检测方法十分有限。传统的鉴定方法需要经过前增菌、选择性培养基再次增菌、培养物在含一种或多种抑制被检菌生长制剂的平板上划线培养、对肉眼可见的特征性菌落进行确认、并对该菌落进行一系列生化和血清型检测做出鉴定等，操作繁琐，且结果可靠性低，耗时较长，严重影响检测鉴定的周期；聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，通过PCR反应扩增出了高的拷贝数，再经过琼脂糖凝胶电泳将目的片段检测出来。但电泳法检测特异性不高，灵敏度也较低，因此引物二聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判，而且实验过程不能实现完全闭管操作，增加了PCR 产物污染的风险。DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次PCR循环后产物总量的方法，该技术克服了以往基因扩增方法的不足，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过CT值和标准曲线的变化对起始模板进行定量分析，较真实地反映了起始样品中的模板量，其操作过称简单、检测时间短，具有准确性好、灵敏度高、特异性强和安全可靠等优点，适用范围广泛，有较好的应用性。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种快速、灵敏且准确的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其检测方法。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于包含：
（1）反应液1：10mmol/L脱氧核苷三磷酸1μL、10×Taq Buffer反应缓冲液2.5μL、20×SYBR Green I荧光染料1μL和RNase-Free ddH2O 15.5μL；
（2）反应液2：10μmol/L上游引物1.5μL和10μmol/L下游引物1.5μL，引物序列为：
上游引物：5’-GATTTCGTTGGTGATGCTG-3’、
下游引物：5’-CGATTGGGGTAAAGATTGA-3’；
（3）5U/μL Taq DNA聚合酶。
本发明所述的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于定性检测的具体步骤为：
步骤一：提取待检样品的基因组DNA
步骤二：实时荧光定量PCR扩增
（1）取1μL待测样品DNA溶液，加入20μL反应液1、3μL反应液2和1μL Taq DNA聚合酶；
（2）将配制好的反应体系置于实时荧光定量PCR仪中反应，反应条件为：预变性，95℃ 15min；变性，95℃ 10s；退火，60℃ 30s；延伸：72℃ 30s；反应进行40个循环；
步骤三：分析判断反应结果
根据实时荧光定量PCR反应的扩增曲线判断结果，当CT值≤40时，待检样品出现扩增曲线，说明结果呈阳性；当CT值≤40时，待检样品未出现扩增曲线，说明结果呈阴性。
本发明所述的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于定量检测的具体步骤为：
步骤一：标准曲线的绘制
将绿色魏斯氏菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，分别取DNA浓度为2.667×105pg/μL、2.667×104pg/μL、2.667×103pg/μL、2.667×102pg/μL、2.667×101pg/μL、2.667pg/μL、2.667×10-1pg/μL、2.667×10-2pg/μL和2.667×10-3pg/μL，9个梯度浓度为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系和反应程序如下：
实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：取1μL标准样品DNA溶液，加入20μL反应液1、3μL反应液2和1μL Taq DNA聚合酶；
SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：预变性，95℃ 15min；变性，95℃ 10s；退火，60℃ 30s；延伸：72℃ 30s；反应进行40个循环；
以绿色魏斯氏菌样品浓度的对数值为X轴、CT值为Y轴制作标准曲线，标准曲线斜率为-3.46，截距为16.30，检测下限为2.667×10-3pg/μL，线性关系曲线方程式为：y=-3.46x+16.30，相关系数R2=0.99，线性关系良好；
步骤二：待测样品绿色魏斯氏菌的检测
取1μL标准样品DNA溶液，加入20μL反应液1、3μL反应液2和1μL Taq DNA聚合酶；
SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：预变性，95℃ 15min；变性，95℃ 10s；退火，60℃ 30s；延伸：72℃ 30s；反应进行40个循环；
将检测到的CT值代入标准曲线即可计算得到待测样品绿色魏斯氏菌浓度。
本发明与其他绿色魏斯氏菌检测技术相比具有以下优点：
1、本发明相对于常规PCR技术，具有操作简便，结果明了等特点，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效的降低了PCR产物污染的风险；
2、本发明检测速度快，整个实验操作仅需2～3小时，操作简单；
3、本发明所使用引物是针对绿色魏斯氏菌rpoA基因设计的特异性检测引物，相比先前有文献报道的采用recN基因作为实时荧光定量PCR检测绿色魏斯氏菌的靶基因，ropA基因的检测限更低，灵敏度更高，特异性更强，准确性更高，检测结果更可靠；
4、本发明所使用的染料是SYBR Green I荧光染料，该染料可特异性地掺入DNA双链，发射强荧光信号，荧光信号虽 PCR 扩增产物的增加而增加，具有样品荧光信号强，背景信号低等优点，且价格低廉，经济适用。
本发明所建立的实时荧光定量PCR检测方法为绿色魏斯氏菌快速精准的检测提供可靠的技术手段，适合在检验检疫系统内、食品安全监管及食品加工等部门推广应用。
附图说明
图1为绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR敏感性试验的熔解曲线图。
图2为绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR敏感性试验的扩增曲线图，图中1为2.667×105 pg/μL的模板浓度；2为2.667×104 pg/μL的模板浓度；3为2.667×103 pg/μL的模板浓度；4为2.667×102 pg/μL的模板浓度；5为2.667×101 pg/μL的模板浓度；6为2.667 pg/μL的模板浓度；7为2.667×10-1 pg/μL的模板浓度；8为2.667×10-2 pg/μL的模板浓度；9为2.667×10-3 pg/μL的模板浓度；10为无酶水。
图3为绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR敏感性试验的扩增产物电泳图，图中1为DL 2000 DNA Marker；2为阴性对照；3为2.667×105 pg/μL的模板浓度；4为2.667×104 pg/μL的模板浓度；5为2.667×103 pg/μL的模板浓度；6为2.667×102 pg/μL的模板浓度；7为2.667×101 pg/μL的模板浓度；8为2.667 pg/μL的模板浓度；9为2.667×10-1 pg/μL的模板浓度；10为2.667×10-2 pg/μL的模板浓度；11为2.667×10-3 pg/μL的模板浓度。
图4为绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR的标准曲线，图中X轴为绿色魏斯氏菌样品浓度的对数值，Y轴为CT值。
图5为绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR特异性试验的扩增曲线图,图中1为绿色魏斯氏菌。
图6为绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR特异性试验的扩增产物电泳图，图中1为DL 2000 DNA Marker；2为阴性对照；3为绿色魏斯氏菌；4为粪肠链球菌；5为植物乳杆菌；6为嗜热链球菌；7为保加利亚乳杆菌；8为融合魏斯氏菌。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
敏感性实验
步骤一：引物的设计、合成试剂盒的组装
本实施例确定用于检测的引物序列如下：
上游引物：5’-GATTTCGTTGGTGATGCTG-3’、
下游引物：5’-CGATTGGGGTAAAGATTGA-3’。
在此基础上设计绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含：
（1）反应液1：10mmol/L脱氧核苷三磷酸1μL、10×Taq Buffer反应缓冲液2.5μL、20×SYBR Green I荧光染料1μL和RNase-Free ddH2O 15.5μL；
（2）反应液2：10μmol/L上游引物1.5μL和10μmol/L下游引物1.5μL；
（3）5U/μL Taq DNA聚合酶。
步骤二：提取待检样品的基因组DNA
检测菌种绿色魏斯氏菌（Weissella viridescens）为本实验室所保存，使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取样品绿色魏斯氏菌基因组DNA。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增
将绿色魏斯氏菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，分别取DNA浓度为2.667×105pg/μL、2.667×104pg/μL、2.667×103pg/μL、2.667×102pg/μL、2.667×101pg/μL、2.667pg/μL、2.667×10-1pg/μL、2.667×10-2pg/μL和2.667×10-3pg/μL，9个梯度浓度为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系和反应程序如下：
所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：取1μL标准样品DNA溶液，加入20μL反应液1、3μL反应液2和1μL Taq DNA聚合酶；
所述SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：预变性，95℃ 15min；变性，95℃ 10s；退火，60℃ 30s；延伸：72℃ 30s；反应进行40个循环。
步骤四：分析判断反应结果
采用所建立的实时荧光定量PCR方法能检测到绿色魏斯氏菌基因组DNA的下限为2.667×10-3 pg（图2）。前人以recN作为靶基因建立的实时荧光定量PCR方法能检测到绿色魏斯氏菌基因组DNA的下限为8.2×10-1 pg。相比之下，本发明建立的基于rpoA基因的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR比前人的方法灵敏度高100倍。
步骤五：标准曲线的绘制
以绿色魏斯氏菌样品浓度的对数值为X轴、CT值为Y轴制作标准曲线，如图4所示。标准曲线斜率为-3.46，截距为16.30，线性关系曲线方程式为：y=-3.46x+16.30，相关系数R2=0.99，表明线性关系良好。
实施例2
特异性实验
步骤一：引物的设计、合成试剂盒的组装
本实施例确定用于检测的引物序列如下：
上游引物：5’-GATTTCGTTGGTGATGCTG-3’、
下游引物：5’-CGATTGGGGTAAAGATTGA-3’。
在此基础上设计绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含：
（1）反应液1：10mmol/L脱氧核苷三磷酸1μL、10×Taq Buffer反应缓冲液2.5μL、20×SYBR Green I荧光染料1μL和RNase-Free ddH2O 15.5μL；
（2）反应液2：10μmol/L上游引物1.5μL和10μmol/L下游引物1.5μL；
（3）5U/μL Taq DNA聚合酶。
步骤二：提取待检样品的基因组DNA
使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取绿色魏斯氏菌、粪肠链球菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和融合魏斯氏菌的基因组DNA。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增
以绿色魏斯氏菌的基因组DNA为阳性对照，以粪肠链球菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和融合魏斯氏菌的基因组DNA为阴性对照进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系和反应程序如下：
所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：取1μL待测样品DNA溶液，加入20μL反应液1、3μL反应液2和1μL Taq DNA聚合酶；
所述实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：预变性，95℃ 15min；变性，95℃ 10s；退火，60℃ 30s；延伸：72℃ 30s；反应进行40个循环。
步骤四：分析判断反应结果
将上述6种细菌DNA进行实时荧光定量PCR检测。结果如图显示，只有绿色魏斯氏菌产生扩增曲线，其他5株非绿色魏斯氏菌均未出现扩增曲线（图5）。对反应产物进行凝胶电泳鉴定，结果显示只有绿色魏斯氏菌在196bp处才有明显的特异性扩增条带（图6）。
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其检测方法
<141> 2018-04-03
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gatttcgttg gtgatgctg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cgattggggt aaagattga 19