技术领域
本发明涉及一类新型氮氧自由基在治疗缺血再灌注损伤中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因，诸如冠动脉硬化导致的心肌梗死、脑卒中、肝肾缺血等，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，严重威胁人类健康，给社会、政府和家庭带来了巨大的负担。
对于缺血引起的多组织多器官损伤目前尚无有效治疗药物，临床缺口很大。因此，研究开发有效防治或减轻缺血再灌注损伤的新药成为我国乃至世界各国药学工作者的重要任务，也是当今医学界亟待解决的重要问题之一。
目前大量研究结果表明，氧化应激损伤是缺血再灌注损伤的重要原因，并在缺血再灌注损伤急性期的各个环节中起重要作用。缺血组织再灌注时造成的微血管和实质器官的损伤主要是由活性氧自由基引起的，这已在多种器官中得到的证明。在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧了自由基对缺血后再灌注组织的损伤。因此，能清除有害自由基的抗氧化剂成为缺血再灌注损伤防治药物的研究重点，例如，化学药物依达拉奉，可减少局部脑缺血后的脑梗死体积，是第一个被临床证明有效的自由基清除剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类既可高效、循环清除自由基，又对缺血再灌注损伤有明显的抑制作用的新型氮氧自由基药物结构。
本发明的另一目的是提供上述新型氮氧自由基药物结构的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述新型氮氧自由基药物在制备治疗缺血再灌注损伤药物中的应用。
本发明实现过程如下：
结构通式（I）所示的化合物，
其中R为单取代或二取代基，独立地选自NO2、OH、OCH3、卤素、H。
结构通式（I）所示化合物的合成方法，其合成路线如下：
。
结构通式（I）所示的化合物在制备治疗缺血再灌注损伤药物中的应用，所述缺血再灌注损伤包括：心肌、脑、肺、肾、肝、肠缺血再灌注损伤；所述药物是片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、乳剂或注射剂。
通过体内药效学试验证明：本发明药物对大鼠脑缺血再灌注损伤及心肌缺血再灌注损伤均有明显的保护作用，且耐药性更好。
具体实施方式
实施例1：化合物1的合成方法
（1）4-羟基苯丙烯酸酰氯的合成
将1.64g（10.0mmol）对羟基苯丙烯酸溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加10.0mLSOCl2（1.18g）的CH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂直接用于下步反应。
（2）对羟基氮氧自由基的合成
将1.22g（10.0mmol）对羟基苯甲醛和1.48g（10.0mmol）二羟胺溶于50mL甲醇中，回流反应24h。有大量白色不溶物生成，过滤，滤饼用少量甲醇洗涤。将滤饼悬浮于50.0mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，加入30.0mLNaIO4（1.7g）水溶液，搅拌15min后停止反应。静置分层后，水相用CH2Cl2萃取两次，合并有机相，干燥过夜，过滤，减压除去溶剂，柱层析纯化得产物1.12g，产率45%。
（3）化合物1的合成
将2.49g（10.0mmol）对羟基氮氧自由基溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加1.82g（10.0mmol）对羟基苯丙烯酸酰氯的20.0mLCH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂，柱层析纯化得产物3.67g，产率93%。mp:197~198℃；R(νmax/cm-1):3380,17161645,1630,1505,780；EI-MS(m/z)395.24[M]+；元素分析:Found:C,66.82;H,5.86;N,7.08;Calc.forC22H23N2O5,C,66.89;H,5.83;N,7.05%；ESR(DMF):五重峰1:2:3:2:1,aN=8.30G,g=2.00990.
实施例2：化合物2的合成方法
（1）3-甲氧基-4-羟基苯丙烯酸酰氯的合成
将1.94g（10.0mmol）对羟基苯丙烯酸溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加10.0mLSOCl2（1.18g）的CH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂用于下步反应。
（2）化合物2的合成
将2.49g（10.0mmol）对羟基氮氧自由基溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加2.12g（10.0mmol）3-甲氧基-4-羟基苯丙烯酸酰氯的20.0mLCH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂，柱层析纯化得产物3.91g，产率92%。mp:245~247℃.IR(νmax/cm-1):3485,1720,1650,1509,1632,880,810.EI-MS(m/z)425[M]+；元素分析:Found:C,64.93;H,5.92;N,6.58;Calc.forC22H23N2O5,C,64.91;H,5.95;N,6.52%；ESR(DMF):五重峰1:2:3:2:1,aN=8.25G,g=2.00987.
实施例3：化合物3的合成方法
（1）3-羟基-4-羟基苯丙烯酸酰氯的合成
将1.64g（10.0mmol）对羟基苯丙烯酸溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加10.0mLSOCl2（1.18g）的CH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂用于下步反应。
（2）化合物3的合成
将2.49g（10.0mmol）对羟基氮氧自由基溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加1.98g（10.0mmol）对羟基苯丙烯酸酰氯的20.0mLCH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂，柱层析纯化得产物3.91g，产率95%。mp:203~204℃.IR(νmax/cm-1):3480,1710,1647,1509,1635,880,810；EI-MS(m/z)411[M]+；元素分析:Found:C,64.22;H,5.63;N,6.81;Calc.forC22H23N2O6,C64.25,H5.61,N6.84；ESR(DMF):五重峰1:2:3:2:1,aN=8.27G,g=2.00992.
实施例4：化合物4的合成方法
称取2.01g（10mmo1）4-羟基-3-溴苯甲醛置于50mL三颈烧瓶，1.46g（0.014mo1）丙二酸，15mL苯，3mL吡啶，0.5mL哌啶，油浴，搅拌溶解，回流反应6h。反应完毕，冷却至室温后加入15mL饱和碳酸氢钠溶液，水层用6mol·L-1盐酸酸化至pH值约为2，过滤，烘干，得白色固体产物1.87g，收率77％。
将上步产物2.41g（10.0mmol）溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加10.0mLSOCl2（1.18g）的CH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂用于下步反应。
将2.49g（10.0mmol）对羟基氮氧自由基溶于50mLCH2Cl2中，冰水浴冷却，滴加2.62g（10.0mmol）对4-羟基3-溴苯丙烯酸酰氯的20.0mLCH2Cl2溶液，然后升温至回流反应2h，停止反应。减压除去溶剂，柱层析纯化得产物4.01g，产率83%。mp:177~178℃.EI-MS(m/z)473.25[M]+；元素分析:Found:C,C55.71,H4.68,N5.98;Calc.forC22H22BrN2O5,C55.43,H4.72,N6.15；ESR(DMF):五重峰1:2:3:2:1,aN=8.01G,g=2.00754.
实施例5：化合物1治疗脑缺血再灌注损伤的药效学实验
（1）①脑缺血再灌注模型的建立：
（i）研究对象：健康雄性SD大鼠，3-4月龄，280-350g，由第四军医大学实验动物中心提供。
（ii）缺血再灌注损伤模型的制备：大鼠局灶性缺血再灌注损伤模型的制备采用稍加改良的Zea-Longa法，建立SD大鼠大脑中动脉局灶性缺血再灌注损伤模型。用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，术中保持肛温36.5-37.5℃，暴露颈总动脉及其分支，分离颈外动脉并结扎、暴露颈内动脉，并引人40mm尼龙线(?0.26mm)，向前徐进18-20mm，阻断大脑中动脉血流，进行右侧大脑中动脉栓塞，造模成功后2h拔除线栓，形成局灶性缺血再灌注模型。术后至处死前若有大鼠死亡，则随机补以同批次相似体重大鼠。
（iii）实验分组及处理：假手术组20只大鼠，仅进行颈部血管分离而不栓塞大脑中动脉；缺血再灌注造模成功后的大鼠在清醒后进行Zea-Longa行为学评分，1-3分入组。采用随机数字表法将入组的60只大鼠随机均分为假手术组、脑缺血再灌注组（模型组）和药物治疗组。分组后，药物治疗组灌胃给予所合成的目标药物0.5mmol/kg，每天2次，给药3d，模型组及假手术组给予生理盐水3.0mL灌胃。所有大鼠再灌注72h后再次进行行为学评分，然后迅速断头取脑。
②测试指标：
（i）神经行为学评估
术后24h由不知晓分组情况的人检查所有大鼠的行动能力，方法如下：
0分：无神经缺失症状；
1分：左前爪不能完全伸展；
2分：向左侧绕圈；
3分：向左侧跌倒；
4分：无自发行动或意识水平下降。
（ii）脑梗死灶体积评估
用TTC染色法测定其梗死灶体积。大鼠快速断头取脑，弃去小脑、脑干，在-20℃下冷冻10min，自额极开始切取2mm厚冠状脑组织片，将脑片浸于37℃恒温2%TTC磷酸盐缓冲液中染色30min，避光，梗死灶不会被TTC染色，在4%多聚甲醛液中固定2h。使用图像分析软件ImageJ1.36b统计出梗死灶面积，进而计算出梗死灶体积和梗死百分比。我们用以下公式来校正水肿效应对梗死灶体积的影响：校正梗死灶体积=左侧脑半球体积?（右侧脑半球体积?梗死灶体积）
（iii）取血清及全脑组织制成的匀浆上清测定与自由基密切相关的各种指标SOD、MDA、GSH:GSH活性选用化学比色法测定；SOD活性选用黄嘌呤酶法测定；MDA含量选用硫代巴比妥酸法测定；观察各组大鼠血清中不同测试指标含量的改变，评价不同目标化合物对脑缺血再灌注损伤的治疗效果，分析防护效应与化合物结构的关系，初步总结构效关系。
（5）结果：与假手术组比较，模型组大鼠出现明显的神经功能缺损症状(P<0.05)，脑缺血2h再灌注24h后神经功能缺损症状最明显，可见明显脑梗死灶。与模型组比较，合成的氮氧自由基1、2、3能够降低大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织丙二醛（MDA）含量，同时增加超物歧化酶活力（SOD）GSH的活性，增强机体抗氧化能力。
实施例6：化合物2治疗脑缺血再灌注损伤的药效学实验
实验分组及方法同上，分组后，药物2治疗组灌胃给予所合成的目标药物0.5mmol/kg，每天2次，给药3d，模型组及假手术组给予生理盐水3.0mL灌胃。
实施例7：化合物3治疗脑缺血再灌注损伤的药效学实验
实验分组及方法同上，分组后，药物3治疗组灌胃给予所合成的目标药物0.5mmol/kg，每天2次，给药3d，模型组及假手术组给予生理盐水3.0mL灌胃。
实施例8：化合物2和3治疗心肌缺血再灌注损伤的药效学实验
实验分组50只大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、给药组（化合物2，化合物3）。药物治疗组灌胃给予所合成的目标药物0.5mmol/kg，模型组及假手术组给予生理盐水3.0mL灌胃，每天1次，连续7d。各组大鼠给药7d后按文献方法制备大鼠心肌缺血再灌注模型。
实验结果显示，模型组与假手术组相比，血清CK活力明显升高(P<0.05)，化合物2和化合物3均能够降低血清CK的活力，具有显著性差异(P<0.05)。与假手术组相比，模型组的血清SOD含量明显降低、MDA含量明显升高(P<0.05)，大鼠给予化合物2和化合物3后，能有效提高血清中的SOD活力，减少血清的MDA含量(P<0.05)，减少氧自由基造成的损伤，提示其对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。