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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810365019.4 (22)申请日 2018.04.23 (71)申请人 沈阳师范大学 地址 110034 辽宁省沈阳市黄河北大街253 号 （道义开发区） (72)发明人 李玥莹逄洪波李雪梅马莲菊 邹剑秋王兰兰张颖魏鑫 高华晨钱美玲 (74)专利代理机构 沈阳维特专利商标事务所 (普通合伙) 21229 代理人 杨群 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (5。
2、4)发明名称 甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因的表达检测方 法及扩增引物 (57)摘要 本发明以甜高粱LTR102(母本)， 高粱654(父 本)以及它们杂交的F5代的高糖群体与低糖群体 为试材， 在苗期、 拔节期、 抽穗期和成熟期测定不 同时期甜高粱LTR102、 高粱654以及F5高糖群体 和低糖群体叶片中蔗糖含量及SPS的活性， 确定 甜高粱SPS活性与蔗糖含量相关性。 对上述试材 不同发育时期SPS基因表达进行定性分析， 确定 不同时期SPS基因表达的差异性。 定量分析上述 试材在不同的生长时期SPS基因表达量的差异， 并将SPS基因表达相对浓度与蔗糖含量进行相关 性分析， 结果表明SPS基因。
3、表达相对浓度与蔗糖 含量显著相关， 根据本发明的结果建立一种甜高 粱SPS基因表达快速检测方法， 以期达到通过快 速检测确定最佳收获时期及筛选甜高粱高含糖 量新材料的目的。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图1页 CN 108441544 A 2018.08.24 CN 108441544 A 1.甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因扩增引物， 其特征在于， 包括引物SPS-1和引物 -Actin， 引物SPS-1包括SPS-1正向引物和SPS-1反向引物， 核苷酸序列分别如SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO： 2所示； 引物 -Actin包括 -Actin正向引物和 -Actin反向。
4、引物， 核苷酸序列分别如SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO： 4所示。 2.如权利要求1所述的甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因扩增引物， 其特征在于， 所述引物 SPS-1扩增的目的片段的长度为121bp； 所述引物 -Actin扩增的目的片段的长度为210bp。 3.一种检测甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因表达的快速PCR试剂， 其特征在于， 所述PCR试 剂包括10Buffer 2.5 l、 25mg/ml MgCl2 2.5 l， 100 mol/l dNTP 0.5 l， 5U/ l Taq酶 0.5 l， 0.2 mol/l Forward Primer 1.0 l， 0.2 mol/l 。
5、Reverse Primer 1.0 l， cDNA模板 1.0 l， 用ddH2O补足25 l； 所述PCR试剂中的引物为权利要求1所述的引物SPS-1或引物 -Actin。 4.利用如权利要求3所述的试剂进行PCR反应的方法， 其特征在于， 包括如下反应程序： 预变性942min32个扩增循环延伸7210min4保存， 扩增循环包括如下步骤： 变 性9430s退火5320s延伸721min 20s。 5.一种检测蔗糖磷酸合成酶基因表达的快速荧光定量PCR试剂， 其特征在于， 所述荧光 定量PCR试剂体积20 l， 包括： 2SYBR Premix ExTaq II 10.0 l， ddH2。
6、O 6.0 l， 0.2 mol/l Forward Primer 0.8 l， 0.2 mol/l Reverse Primer 0.8 l， ROX Reference DYE 0.4 l， cDNA模板2.0 l； 所述荧光定量PCR试剂中的引物为权利要求1所述的引物SPS-1或引物 -Actin。 6.利用如权利要求5所述的试剂进行快速荧光定量PCR的方法， 其特征在于， 包括如下 反应程序： 预变性9515min35个扩增循环溶解曲线程序53-95； 扩增循环包括如下 步骤： 变性9420s退火5320s延伸721min 20s。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108441544。
7、 A 2 甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因的表达检测方法及扩增引物 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及甜高粱蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因， 具体涉及甜高 粱蔗糖磷酸合成酶基因的表达检测方法及扩增引物。 背景技术 0002 蔗糖是高等植物光合作用的主要产物， 是碳运输的主要形式， 又是碳水化合物积 累和贮藏的主要形式， 也是 “库代谢” 的主要基质， 在植物糖代谢中具有特殊的位置(Farrar et al.,2000)。 特别对于甜高粱， 作为制糖业、 生产酒精、 纤维和饲料的优良原料主要取决 于茎杆富含的糖份， 其中85是蔗糖， 9葡萄糖， 6果糖(Gnansounou et al.,。
8、2005)。 利 用甜高粱的糖分生产酒精作为替代能源近年来引起了人们的高度关注， 探讨甜高粱的糖分 代谢转换机理是生物能源研究的一个重要部分。 0003 甜高粱是 “双库型” 作物， 具有籽粒库和茎秆库， 蔗糖是甜高粱茎秆中糖分的主要 存在形式， 蔗糖在茎秆中的积累关系到甜高粱茎秆中的糖分含量和产量， 而茎秆糖分积累 过程与蔗糖代谢密不可分。 蔗糖代谢由多种酶调控， 调控蔗糖代谢的关键酶主要有三种： 蔗 糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase , E.C.2.4.1 .14 ,SPS)， 蔗糖合成酶 (Sucrosesynthase， E.C.2.4.1.13,SS。
9、)和蔗糖转化酶(Invertase,EC3.2.1.26,Inv)。 其中， SPS催化蔗糖合成， Inv催化蔗糖降解， SS具有分解和合成蔗糖的双重属性， 三者共同催化 蔗糖进入各种代谢途径。 三种酶在植物生长发育过程中有着举足轻重的作用， 因此， 研究这 些与蔗糖代谢相关的酶至关重要。 0004 SPS的活性直接反映了植物体内蔗糖合成的能力。 从分析SPS基因表达量， 是探明 茎秆糖分积累规律、 解释不同品种间糖含量差异和建立分子调控体系的有效途径。 而甜高 粱SPS基因表达检测方法研究未见全面报道。 发明内容 0005 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因的表达。
10、检测 方法及扩增引物， 以甜高粱LTR102(母本)、 高粱654(父本)以及它们杂交的F5代中高糖群体 和F5低糖群体为试材， 利用高效液相色谱法和荧光定量 PCR技术对蔗糖含量以及蔗糖磷酸 合成酶(SPS)的基因表达进行检测， 建立了一种高粱高糖品种筛选快速检测方法。 0006 本发明的目的一： 应用高效液相色谱法及分光光度法测定不同时期甜高粱 LTR102(母本)、 高粱654(父本)以及F5高糖群体和低糖群体叶片中蔗糖含量及SPS的活性， 确定甜高粱SPS活性与蔗糖含量相关性。 0007 本发明目的二： 应用PCR技术对父本、 母本以及F5高糖群体和低糖群体， 不同发育 时期SPS基因。
11、表达进行定性分析， 初步确定不同时期SPS基因表达的差异性。 0008 本发明的目的三： 应用荧光定量PCR技术， 定量分析甜高粱LTR102(母本)、 高粱654 (父本)以及F5高糖群体和低糖群体在不同的生长时期SPS基因的定量表达情况， 并将SPS基 因表达相对浓度与蔗糖含量进行相关性分析， 结果表明SPS基因表达相对浓度与蔗糖含量 说明书 1/8 页 3 CN 108441544 A 3 显著相关(R0.972， P0.05)， 根据实验结果进而建立了SPS基因表达迅速检测的反应体系 和条件， 建立甜高粱高糖品种筛选的一种快速鉴定标准， 达到确定最佳收获期和筛选高含 糖的高粱品种的目的。
12、， 为实践辅助育种、 缩短育种周期提供了技术保障。 0009 (1)F5群体的构建： 0010 本发明以甜高粱LTR102为母本， 高粱654为父本， 杂交获得F5代， 其中87株高糖及 33株低糖。 0011 将F5代分为高糖群体及低糖群体， 高糖群体及低糖群体分别由F5代87株高糖株叶 片及33株低糖株叶片组成， 并进行酶液、 mRNA的提取。 0012 (2)应用高效液相色谱法测定蔗糖含量； 应用分光光度法测定SPS活性， 对蔗糖含 量与SPS活性进行相关性分析。 0013 (3)建立了甜高粱RNA的提取方法， 应用改良Trizol法提取的RNA， 所提取的RNA完 整性很好， RNA不。
13、存在污染， 可以在下一步实验中作为模板。 0014 (4)蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因引物设计： 根据已知的一段甜高粱SPS3-1 基因编 码区cDNA序列， 应用Oligo6软件和Primer primier软件进行设计引物。 命名为SPS-1， - Actin为看家基因。 0015 (5)应用PCR技术对甜高粱蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因表达进行定性分析， 结果表 明以 -Actin和SPS-1为引物可以扩增理想的目的片段， 谱带清晰且无杂带， 苗期就可检测 出SPS基因， 随着生长时期的延伸， SPS基因表达量逐步增加， 到成熟期是表达量达到最大。 这与蔗糖含量的变化规律相一致， 可以初。
14、步证明SPS基因的表达影响蔗糖的积累。 在定性检 测的基础上进行荧光定量PCR 检测， 更加准确的了解SPS基因的变化规律。 0016 (6)应用荧光定量PCR技术对SPS基因表达进行定量分析， 结果表明SPS 基因表达 量由高到低依次为高糖群体、 母本、 低糖群体和父本。 SPS基因的变化规律与甜高粱蔗糖含 量和SPS酶活性的变化规律基本一致， 并且都是在成熟期达到最大值， 为甜高粱高糖品种的 选育以及确定甜高粱最佳的收获时期提供理论依据。 0017 本发明是这样实现的， 一方面提供了甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因扩增引物， 包括 引物SPS-1和引物 -Actin， 引物SPS-1包括SPS-1。
15、正向引物和SPS-1反向引物， 核苷酸序列分 别如SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO： 2所示； 引物 -Actin 包括 -Actin正向引物和 -Actin反向 引物， 核苷酸序列分别如SEQ ID NO： 3 和SEQ ID NO： 4所示。 0018 进一步地， 所述引物SPS-1扩增的目的片段的长度为121bp； 所述引物 -Actin扩 增的目的片段的长度为210bp。 0019 另一方面， 本发明还提供了检测甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因表达的快速 PCR试 剂， 所述PCR试剂包括10Buffer 2.5 l、 25mg/ml MgCl 2 2.5 l， 100 mol/l。
16、 dNTP 0.5 l， 5U/ l Taq酶0.5 l， 0.2 mol/l Forward Primer 1.0 l， 0.2 mol/l Reverse Primer 1.0 l， cDNA模板1.0 l， 用ddH2O补足25 l； 0020 所述PCR试剂中的引物为权利要求1所述的引物SPS-1或引物 -Actin。 0021 进一步地， 利用上述快速PCR试剂进行PCR反应的方法包括如下反应程序： 预变性 942min32个扩增循环延伸7210min4保存， 扩增循环包括如下步骤： 变性94 30s退火5320s延伸721min 20s。 0022 再一方面， 本发明还提供一种检测。
17、蔗糖磷酸合成酶基因表达的快速荧光定量PCR 说明书 2/8 页 4 CN 108441544 A 4 试剂， 所述荧光定量PCR试剂体积20 l， 包括： 2SYBR Premix ExTaq II 10.0 l， ddH2O 6.0 l， 0.2 mol/l Forward Primer 0.8 l， 0.2 mol/l Reverse Primer 0.8 l， ROX Reference DYE 0.4 l， cDNA模板2.0 l； 0023 所述荧光定量PCR试剂中的引物为权利要求1所述的引物SPS-1或引物 -Actin。 0024 进一步地， 利用上述试剂进行快速荧光定量PCR的。
18、方法包括如下反应程序： 预变性 95 15min35个扩增循环溶解曲线程序53-95； 扩增循环包括如下步骤： 变性94 20s退火53 20s延伸72 1min 20s。 0025 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 0026 将该引物及表达检测方法应用于高粱糖含量、 SPS酶活性、 SPS基因表达的快速分 析， 在高含糖量品种的选择， 淘汰低糖品种基因型， 加快育种进程， 确定最佳的收获时期、 节 省选育所需的试验用地和成本等等方面具有较大的实用价值， 进而克服了那些由于表型鉴 定困难、 用通常的方法辅助选择工作量非常巨大的困难， 为缩短育种周期提供了技术保障。 同时填补甜高粱SPS基因。
19、表达辅助选择研究的国、 内外空白。 附图说明 0027 图1为本发明的苗期SPS基因表达检测谱带(PCR方法)。 0028 图2为本发明的拔节期SPS基因表达检测谱带(PCR方法)。 0029 图3为本发明的抽穗期SPS基因表达检测谱带(PCR方法)。 0030 图4为本发明的成熟期SPS基因表达检测谱带(PCR方法)。 具体实施方式 0031 参照图1、 图2、 图3和图4， 如图所示高粱654(父本)(1,5谱带)， 甜高粱LTR102(母 本)(2,6谱带)， F5高糖基因池(3,7谱带)， F5低糖基因池(4,8谱带)， Marker(M谱带)。 1-4谱带 以引物对 -Actin为引。
20、物扩增出的PCR产物， 片段长度为210bp左右； 5-8谱带以引物对SPS-1 为引物扩增出的PCR产物， 片段长度为121bp。 0032 1.材料和方法 0033 1.1试验材料 0034 甜高粱LTR102(母本)， 高粱654(父本)以及它们杂交的F5代个体。 0035 1.2药品、 仪器与设备 0036 100mmol/L PH7.8磷酸缓冲液1PVP、 0.1mmol/LEDTA、 0.1间苯二酚、 UDPG、 100mmol/L六磷酸果糖、 100mmol/L果糖、 琼脂糖、 氯仿、 EDTA均为国产分析纯、 Trizol试剂 盒、 焦碳酸二乙酯(DEPC)、 Tris、 异丙。
21、醇、 QuantiTect Reverse Transcription Kid均为宝 生物(大连)公司产品。 0037 荧光定量PCR、 温度梯度PCR、 低温冷冻离心机、 电子天平、 电泳仪， 电冰箱、 超低温 冰箱微波炉、 微量移液器、 超纯水仪。 0038 1.3实验总体设计 0039 分别在苗期、 拔节期、 抽穗期、 成熟期取LTR102(母本)， 654(父本)以及F5代个体的 叶片提取mRNA(改良Trizol法)逆转录为cDNA蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因扩增引物的 设计应用PCR技术对SPS基因表达进行定性分析应用荧光定量PCR技术对SPS基因表达 说明书 3/8 页 5 CN。
22、 108441544 A 5 进行定量分析分析含糖量与 SPS表达相关性建立快速检测SPS基因表达的方法确定 鉴定方法为甜高粱高糖品种的选育以及确定最佳的收获时期提供理论依据。 0040 1.4甜高粱蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性测定 0041 称取1g样品， 洗净剪碎至于预冷研钵中， 加2.5ml磷酸缓冲液， 冰浴研磨。 研成匀浆 后倒入离心管中， 再用2.5ml磷酸缓冲液润洗， 之后一并倒入离心管中。 离心10000 xg， 15min， 取上清液备用。 取50 l粗酶液加入到相应号码的试管中， 加入50 l缓冲液， 20 l MgCl2， 20 l UDPG， 20 l 6-磷酸果糖， 振。
23、荡。 30， 水浴30min。 加入200 l NaOH， 沸水煮 10min,冷却。 加入1.5ml 30盐酸， 0.5ml 间苯二酚。 80水浴10min冷却。 在480nm下比色。 0042 1.5甜高粱RNA的提取和cDNA的合成 0043 1.5.1改良Trizol法提取总RNA 0044 (1)将叶片组织在液氮中磨成粉末， 向每50-100mg组织中加入1ml Trizol 试剂， 样品体积不应超过100 l室温静置5min。 0045 (2)向每管样中加入0.2ml氯仿， 盖紧管帽， 剧烈振荡样品15秒钟， 室温下稳定 5min。 0046 (3)样品在12000 xg， 4下离。
24、心15min 0047 (4)取上清入新管， 每管加0.5ml异丙醇， 混匀， 室温放置5min。 0048 (5)样品在12000 xg， 4下离心10min。 0049 (6)弃上清， 用1ml 75乙醇洗涤RNA沉淀， 旋涡混匀。 0050 (7)12000 xg， 4下离心5min.(如果用于逆转录PCR， 重复步骤6两次)。 0051 (8)丢弃表面物， 室温干燥5-10min(不要使沉淀完全变干)， 以30-60 l去 TE溶解。 0052 1.5.2RNA纯度分析 0053 (1)从原始混合物中取10至20 lRNA样品， 以990或980 l去RNA酶水溶解在1.5ml微 型离。
25、心管中， 得到稀释100或200倍的RNA样品。 0054 (2)吸取1ml去RNA酶水加入干净比色杯中并读出空白的吸光率。 0055 (3)吸取稀释的RNA样品加入干净比色杯中并读出260、 280和230nm下的吸光率。 用 下面的公式测定原始样品的RNA浓度： RNA g/ lA26033稀释倍数/1000。 0056 1.5.3RNA完整性分析 0057 用1.0琼脂糖凝胶于90V电压下电泳45min， 在凝胶成像仪上观察RNA 条带的清 晰度和完整性。 0058 1.6蔗糖磷酸合成酶(SPS)引物的设计 0059 根据已知的一段甜高粱SPS3-1基因编码区cDNA序列， 应用Olig。
26、o6软件和 Primer primier软件进行设计引物。 0060 1.7PCR的反应体系、 反应程序及检测方法 0061 1.7.1PCR反应体系及反应程序的建立 0062 用QuantiTect Reverse Transcription Kid进行反转录， 取0.2ml Eppendorf管， 每管按样品编号后加入如下成分gDNA Wipeout Buffer 2 l， Template RNA总量在10pg到1 g之间， 加RNase-free water使反应总体积大到14 l。 加样完毕后放入水浴锅内， 去除RNA 中的基因组DNA 42 10min。 再向管内加入 Quanti。
27、Tect Reverse Transcriptase 1ul， QuantiTect RT Buffrt 4 l， RT Primer Mix 1 l， 这是的反应体积达到20 l。 42水浴 说明书 4/8 页 6 CN 108441544 A 6 15min， 953min。 0063 反应体系的建立 0064 RNA经过反转录成cDNA之后， 取0.2ml Eppendorf管， 每管按样品编号后加入如下 成分： 反应体系为25 l， 其中包括10Buffer 2.5 l、 25mg/ml MgCl2 2.5 l， 100 mol/l dNTP 0.5 l， 5U/ l Taq酶0.5 。
28、l， 0.2 mol/l Forward Primer 1.0 l， 0.2 mol/l Reverse Primer 1.0 l， cDNA模板1.0 l， 用ddH2O补足25 l； 0065 反应程序： 0066 将上述加样完毕的Eppendorf管， 放入EN61010-1PCR扩增仪中进行PCR 反应， 反应 程序为： 预变性94 2min(变性94 30s退火53 20s延伸72 1min 20s)32个循 环延伸72 10min4保存。 0067 1.7.2PCR产物分析 0068 将PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测， 对扩增产物进行进一步分析并确定产 物特异性。 0069 。
29、1.8荧光定量PCR检测甜高粱磷酸蔗糖合成酶(SPS)的表达量 0070 1.8.1标准曲线的建立 0071 稀释cDNA成5个梯度(22， 24， 25， 26， 27)， 分别进行目的基因SPS及内参基因 - actin的SYBR Green I实时定量PCR反应， 制备两基因的标准曲线并检测扩增效率。 0072 1.8.2荧光定量PCR的反应体系和条件 0073 SYBR荧光定量PCR的反应体系： 20 l： 2SYBR Premix ExTaq II 10.0 l， ddH2O 6.0 l， Forward Primer 0.8 l， Reverse Primer 0.8 l， ROX。
30、 Reference DYE 0.4 l， cDNA 模板2.0 l。 0074 反应程序： 预变性95 15min(变性94 20s退火53 20s延伸 72 1min 20s)35个循环溶解曲线程序53-95 反应结束仪器自动生成CT (threshold cycles)值及熔解曲线图。 每个样本设3个重复管， 同时设无模板阴性对照。 0075 实施例1： 甜高粱磷酸蔗糖合成酶(SPS)活性与蔗糖含量相关性分析 0076 本发明通过测定不同时期父本、 母本以及它们杂交的F5高糖群体和低糖群体叶片 中的SPS的活性， 了解在不同时期不同群体间SPS的变化规律。 父母本及F5高糖群体和低糖 群。
31、体叶片中的SPS的活性在逐步升高。 在成熟期时母本、 高糖群体和低糖群体这三个甜高粱 品种的活性都达到最大值分别为14.86、 17.63、 13.76 mol/h.g.FW； 父本在成熟期SPS的活 性比抽穗期略微有所下降。 在苗期时四个品种的SPS的活性没有太大的区别， 而从拔节期开 始四个品种的 SPS的活性出现差距。 高糖群体和低糖群体两个杂交品种SPS的活性呈线性 增长， 活性增长的速度要比亲本快， 且高糖品种在成熟期的SPS的酶活性最高。 对高粱和甜 高粱叶片中的蔗糖与SPS活性进行相关性分析， 结果表明蔗糖与SPS 活性呈显著的正相关 (R0.763， P0.01)。 0077 。
32、实施实例2： 甜高粱RNA的提取结果分析 0078 琼脂糖凝胶电泳检测表明， 应用改良Trizol法提取的RNA都有3条的带， 总RNA中 28S条带的亮度约是18S条带的2倍， 说明其在提取过程中降解较少， 所提取的RNA完整性很 好。 5S条带比较浅， 说明RNA不存在污染， 可以在下一步实验中作为模板。 0079 实施实例3： 蔗糖磷酸合成酶(SPS)引物设计 说明书 5/8 页 7 CN 108441544 A 7 0080 表1中的引物是根据已知的一段甜高粱SPS3-1基因编码区cDNA序列， 应用Oligo6 软件和Primer primier软件进行设计引物。 命名为SPS-1，。
33、 -Actin为看家基因， 两对引物扩 增的目的片段的长度分别为121bp和210bp。 0081 表1SPS基因扩增所用引物 0082 0083 实施实例4： 蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因表达的定性分析 0084 苗期亲本、 F5高糖群体和低糖群体叶片中的SPS基因的表达情况如图1所示， 图中 1-4谱带是父本、 母本、 高糖群体和低糖群体的cDNA， 以 -Actin为引物扩增出的PCR产物， 片 段长度为210bp左右； 5-8号谱带是父本、 母本、 高糖群体和低糖群体的cDNA， 以SPS-1为引物 扩增出的PCR产物， 片段长度为121bp。 结果表明在苗期SPS基因已经开始表达。 。
34、0085 拔节期SPS基因的表达情况见图2， 1-4谱带是父本、 母本、 高糖群体和低糖群体的 cDNA， 以 -Actin为引物扩增出的PCR产物， 片段长度为210bp； 5-8 谱带是父本、 母本、 高糖 群体和低糖群体的cDNA， 以SPS-1为引物扩增出的 PCR产物， 片段长度为121bp左右。 结果表 明在拔节期父本的SPS基因表达较弱， 高糖群体SPS基因表达较强。 0086 抽穗期SPS基因的表达情况见图3， 1-4号谱带是父本、 母本、 高糖群体和低糖群体 的cDNA， 以 -Actin为引物扩增出的PCR产物， 片段长度为210bp； 5-8谱带是以抽穗期父本、 母本、 。
35、高糖群体和低糖群体的cDNA， 以SPS-1为引物扩增出的PCR产物， 片段长度为121bp左 右。 结果表明从抽穗期目的片度的亮度与粗细程度都比之前两个时期有所加强， 说明SPS基 因的表达量要比苗期和拔节期时的量大。 0087 成熟期SPS基因的表达情况见图4， 1-4号谱带是父本、 母本、 高糖群体和低糖群体 的cDNA， 以 -Actin为引物扩增出的PCR产物， 片段长度为210bp； 5-8谱带是父本、 母本、 高 糖群体和低糖群体的cDNA， 以SPS-1为引物扩增出的PCR产物， 片段长度为121bp左右。 结果 表明SPS基因在成熟期表达量达到大值。 0088 综上所述， 以。
36、 -Actin和SPS-1为引物可以扩增出目的片段， 谱带清晰且无杂带。 从 图1-4可知， 在苗期SPS基因表达量较小， 随着生长时期的变化， SPS 基因表达量逐步增加， 到成熟期达到最大。 这与蔗糖含量的变化规律相一致， 可以初步证明SPS基因的表达影响蔗 糖的积累。 0089 实施实例5： 蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因表达的定量分析 0090 5.1苗期SPS基因表达定量分析 0091 定量分析结果表明， 以母本叶片中SPS基因相对浓度为对照， 在苗期高糖群体的 SPS基因相对浓度对大， 是母本SPS基因表达量的1.59倍。 父本SPS基因的相对浓度最小， 仅 说明书 6/8 页 8 。
37、CN 108441544 A 8 为母本SPS基因表达量的1/2。 (见表2) 0092 表2苗期SPS基因表达定量分析 0093 0094 0095 5.2拔节期SPS基因表达定量分析 0096 拔节期亲本、 F5高糖群体和低糖群体在这个时期表达量差异很小， 最大的高糖群 体SPS基因的表达量为最小的低糖群体SPS基因表达量的1.25倍。 (见表3) 0097 表3拔节期SPS基因表达定量分析 0098 0099 5.3抽穗期SPS基因表达定量分析 0100 抽穗期父本叶片中SPS基因的相对浓度最低， 其他三个群体的表达量差异不大， 说 明从抽穗期开始， 甜高粱和高粱之间SPS基因的表达量差。
38、异加大。 甜高粱SPS基因的表达量 约为高粱基因表达量的2倍。 (见表4) 0101 表4抽穗期SPS基因表达定量分析 说明书 7/8 页 9 CN 108441544 A 9 0102 0103 5.4成熟期SPS基因表达定量分析 0104 成熟期亲本、 F5高糖群体和低糖群体在这个时期表达量差异较大， 高糖群体SPS基 因的表达量是最小的低糖群体SPS基因表达量的15倍。 (见表5) 0105 表5成熟期SPS基因表达定量分析 0106 0107 综上所述， 在每个时期都以母本SPS基因的相对浓度为对照， SPS基因表达量由高 到低依次为高糖群体、 母本、 低糖群体和父本。 在成熟期这种变。
39、化趋势与蔗糖的积累规律和 SPS活性变化规律相一致， 由此可见SPS基因表达量越高蔗糖的含量也多。 说明书 8/8 页 10 CN 108441544 A 10 SEQUENCE LISTING 沈阳师范大学 甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因的表达检测方法及扩增引物 2018 4 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 ggcaagaaat agaagagcag 20 2 20 DNA 人工序列 2 accatacgag gcataaaacg 20 3 20 DNA 人工序列 3 ggcaagaaat agaagagcag 20 4 20 DNA 人工序列 4 accatacgag gcataaaacg 20 序列表 1/1 页 11 CN 108441544 A 11 图1 图2 图3 图4 说明书附图 1/1 页 12 CN 108441544 A 12 。